способ определения содержания свинца в органах свиней

Формула изобретения

Способ определения содержания свинца в органах свиней, включающий анализ биосубстрата животного, отличающийся тем, что проводят микроэлементный анализ щетины свиньи методом атомно-абсорбционной спектрометрии, при этом для определения содержания свинца в печени устанавливают в щетине концентрацию одного или нескольких элементов, выбираемых из Pb, Cd, Cu, Fe, Zn, и рассчитывают уравнения регрессии:

у=0,1911+0,7571х, где х - концентрация Pb в щетине, а у - содержание Pb в печени;

у=0,1576+2,8652х, где х - концентрация Cd в щетине, а у - содержание Pb в печени;

у=0,7074-0,0458х, где х - концентрация Cu в щетине, а у - содержание Pb в печени;

у=0,2492+0,0024х, где х - концентрация Fe в щетине, а у - содержание Pb в печени;

у=0,6603-0,0023х, где х - концентрация Zn в щетине, а у - содержание Pb в печени;

для определения содержания свинца в легких устанавливают в щетине концентрацию Fe и/или Mn и рассчитывают уравнения регрессии:

у=0,6177+0,0022х, где х - концентрация Fe в щетине, а у - содержание Pb в легких;у=0,5139+0,1026х, где х - концентрация Mn в щетине, а у - содержание Pb в легких;

а для определения содержания свинца в селезенке устанавливают в щетине концентрацию Fe и рассчитывают уравнения регрессии:

у=0,4437+0,0028х, где х - концентрация Fe в щетине, а у - содержание Pb в селезенке.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к животноводству, ветеринарии и экологии и предназначено для использования в качестве критерия прижизненной оценки степени аккумуляции в органах и тканях свиней основного загрязнителя окружающей среды - свинца.

В Российской Федерации около 74 млн. га почв загрязнено промышленными токсикантами, основным из которых является свинец. Период полуудалентия этого металла в условиях почвенных лизиметров составляет 740...5900 лет.

Биологическая роль Pb изучена недостаточно. Установлено участие Pb в метаболизме костной ткани. В результате хронической токсикации свинцом происходят изменения состояния нервной, сердечно-сосудистой, кроветворной систем и органов желудочно-кишечного тракта. Свинец является сильным мутагеном, канцерогеном и тератогеном, а также синергистом при комбинированном и сочетанном действии на организм со многими другими агентами различной природы [1].

Основными путями поступления Pb считаются ингаляционный (до 70% содержащегося в аэрозоле элемента оседает в легких) и алиментарный (всасывается 5...10%, иногда до 50% от поступившего в ЖКТ металла). В наибольших количествах Pb накапливается в печени, почках, поджелудочной железе, костях и волосе. Повышенное содержание в рационе Са, Р, Mg, Zn снижает усвоение Pb, а дефицит Fe повышает. Свинец выделяется в основном через кишечник (80...90%) и почки, но его можно обнаружить в слюне, молоке и других экскретах [1, 2].

Для Pb установлены очень жесткие ПДК: атмосферный воздух селитебных зон - 0,0003 мг/кг, воздух рабочей зоны - 0,01 мг/кг, питьевая вода - 0,03 мг/кг, почва - 20 мг/кг, кости - 20 мг/кг, печень - 1 мг/кг, почки - 1,0 мг/кг, головной мозг 0,1 мг/кг, волос - 4 мг/кг, кровь - 0,1 мг/л для детей и 0,4 мг/л для взрослых [1].

Относительная простота получения Pb и большая распространенность в земной коре (16 мг/кг) сделали его классическим промышленным ядом и глобальным экотоксикантом. Антропогенная свинцовая нагрузка, в 10-40 раз превышающая геогенную, способна индуцировать нарушения практически на всех уровнях биологической организации, включая экосистемы [3].

Токсическое действие Pb обусловлено его способностью образовывать соединения с биологически важными анионами-лигандами: сульфгидрильными группами цистеина, стабилизирующими третичную структуру белков, имидазольными и карбоксильными группами, а также фосфатами. Следствием этого являются: угнетение синтеза белков и активности ферментов, нарушение порфиринового обмена и повреждение мембран.

Свинец может вызывать медленно развивающееся хроническое отравление (сатурнизм), характеризующееся разнообразной симптоматикой и полисиндромностью течения. Характерным проявлением свинцового токсикоза является микроцитарная анемия, морфологически неотличимая от железодефицитной - ингибирование активности АЛДГ, повышенное выделение копропорфирина с мочой, появление в крови и моче предшественников гема [1, 2].

С возрастом концентрация Pb увеличивается; например, у коров в возрасте от трех до восьми лет концентрация Pb возрастает в 9,2 раза, происходят хронические изменения в печени [9].

Живые организмы, находясь в динамическом равновесии со средой, постоянно выводят избыток поступающих с пищей, водой и воздухом химических элементов: из желудочно-кишечного тракта - с калом, из крови - с мочой, желчью, потом, молоком, а также посредством депонирования в костной ткани, коже и ее придатках - волосе и копытном роге. Многие ученые считают волос более информативным по отношению как к традиционным биосубстратам - кровь, моча, так и к тем, что используются сравнительно недавно - слеза, экспират, костная ткань, зубы и копыта [4]. Это обусловлено высокой митотической активностью клеток влагалища волосяного фолликула, которые уступают по пролиферации только стволовым клеткам гемопоэтической системы. Выходя за уровень кожных покровов, клетки волоса теряют влагу, сохраняя большинство метаболитов, включая Pb. Таким образом, волос интегрально отражает аккумуляцию Pb за довольно продолжительный период своего роста (до нескольких лет).

Кроме того, из всех видов сельскохозяйственных животных свиньи являются наиболее удобным модельным объектом при изучении различных болезней человека, так как многие физиологические и биохимические процессы у них сходны.

В настоящее время известны способы определения содержания Pb в пищевом сырье, включая мышцы и другие органы и ткани, которые можно использовать только после забоя животных [5-8].

Недостатком этих способов является невозможность прижизненной оценки степени загрязнения Pb органов и тканей животных для оценки и коррекции экологической чистоты потенциального продовольственного сырья.

Прототип - ГОСТ 26932-86. Сырье и продукты пищевые. Методы определения свинца [5].

Предлагается способ определения содержания свинца в органах свиней, включающий анализ биосубстрата животного, отличающийся тем, что проводят микроэлементный анализ щетины свиньи методом атомно-абсорбционной спектрометрии, при этом для определения содержания свинца в печени устанавливают в щетине концентрацию одного или нескольких элементов, выбираемых из Pb, Cd, Cu, Fe, Zn, и рассчитывают уравнения регрессии:

у=0,1911+0,7571х, где х - концентрация Pb в щетине, а у - содержание Pb в печени;

у=0,1576+2,8652х, где х - концентрация Cd в щетине, а у - содержание Pb в печени;

у=0,7074-0,0458х, где х - концентрация Cu в щетине, а у - содержание Pb в печени;

у=0,2492+0,0024х, где х - концентрация Fe в щетине, а у - содержание Pb в печени;

у=0,6603-0,0023х, где х - концентрация Zn в щетине, а у - содержание Pb в печени;

для определения содержания свинца в легких устанавливают в щетине концентрацию Fe и/или Mn и рассчитывают уравнения регрессии:

у=0,6177+0,0022х, где х - концентрация Fe в щетине, а у - содержание Pb в легких;

у=0,5139+0,1026х, где х - концентрация Mn в щетине, а у - содержание Pb в легких;

а для определения содержания свинца в селезенке устанавливают в щетине концентрацию Fe и рассчитывают уравнения регрессии:

у=0,4437+0,0028х, где х - концентрация Fe в щетине, а у - содержание Pb в селезенке.

Предлагаемым способом решается задача оценки накопления Pb в барьерных органах свиней - печени, легких, селезенке.

Поставленная задача достигается путем установления содержания в щетине Fe, Zn, Cu, Pb, Cd, Mn с последующим расчетом уровня свинца в печени, легких и селезенке по уравнениям регрессии. По уровню одного или нескольких из нижеследующих элементов Fe, Zn, Cu, Pb, Cd рассчитывается концентрация Pb в печени, а по концентрации Fe - в легких и селезенке.

От существующих методов, при которых определение концентрации свинца в органах и тканях животных возможно только после забоя, заявленный способ отличается тем, что устанавливается содержание в щетине одного или нескольких из следующих элементов: Fe, Zn, Cu, Pb, Cd, Mn и по нему оценивается накопление Pb в печени, легких и селезенке. Содержание свинца в печени, легких и селезенке может быть определено по концентрации Fe в щетине.

Тестирование загрязнения паренхиматозных органов свинцом по заявленному способу обеспечивает точность метода, отсутствие стрессирования животных, безболезненность, исключение риска инфицирования, простоту и удобство при проведении исследования. Возможно создание банка проб щетины, так как волос имеет неограниченный срок хранения.

Волос является наиболее информативным неинвазивным биосубстратом, так как клетки луковицы (см. чертеж) хорошо снабжаются кровью, а по митотической активности уступают только клеткам красного костного мозга.

Таблица 1
Содержание свинца в органах и тканях свиней, мг/кг
Орган, ткань			Cv, %	Lim	ПДК, мг/кг
Легкое	0,72±0,05	0,21	29,2	0,30-1,10
Печень	0,36±0,04	0,16	44,4	0,16-0,79	1,0
Сердце	0,69±0,05	0,20	29,0	0,36-1,02
Мышечная ткань	0,70±0,06	0,22	31,4	0,44-1,27
Почки	0,66±0,04	0,18	27,3	0,35-0,97	1,0
Селезенка	0,58±0,06	0,27	46,6	0,22-1,12
Щетина	0,24±0,05	0,23	95,8	0,01-1,02	4,0
Копытный рог	0,26±0,03	0,11	42,3	0,09-0,47

Пробы щетины брали в области лопатки, отмывали детергентами и обезжиривали петролейным эфиром. Затем промывали дистиллированной водой и сушили при температуре 70°С в течение 24 часов. Массу навесок определяли с использованием торсионных весов. Озоление проб проводилось при постепенном увеличении температуры от 200 до 450°С. Озоленный остаток кипятили в концентрированной азотной кислоте при температуре 130...140°С до полного ее испарения. Далее - отжиг оставшейся органики при температуре 450°С до получения золы светлых тонов без темных включений (при наличии темных частиц повторялись две предыдущие операции). В заключение добавлялась концентрированная соляная кислота, минерализат выпаривался до мокрых солей и разбавлялся бидистиллятом.

Концентрации изучаемых металлов определялись методом атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС). ААС основана на поглощении излучения оптического диапазона невозбужденными свободными атомами. Величина поглощенной энергии пропорциональна концентрации определяемого элемента в атомном паре.

Анализируя данные табл.1, необходимо отметить, что наибольшим накоплением Pb характеризуются легкие и мышечная ткань. По уровню аккумуляции свинца органы и ткани располагаются в следующем порядке: легкие > мышечная ткань > сердце > почки > селезенка > печень > копытный рог > щетина.

В волосе среди исследованных элементов больше всего аккумулируются Zn и Fe (табл.2). По концентрации в щетине изученные химические элементы образуют следующий ранжированный ряд: Zn > Fe > Cu > Mn > Pb > Cd.

Таблица 2
Содержание химических элементов в щетине свиней, мг/кг
Элемент			lim
Zn	137,76±9,97	42,29	50,00-238,57
Cu	7,70±0,58	2,47	1,70-10,90
Fe	47,66±12,12	49,98	14,10-205,00
Cd	0,07±0,01	0,04	0,01-0,16
Со	0,75±0,24	0,96	0,10-3,90
Mn	2,05±0,30	1,23	0,90-4,70
Pb	0,24±0,05	0,23	0,01-1,02

Между концентрацией в щетине некоторых тяжелых металлов выявлены средние и высокие положительные и отрицательные корреляции (табл.3).

Таблица 3
Корреляции уровней тяжелых металлов в щетине
Коррелирущие элементы		Р
Pb-Cd	0,631±0,150	0,009
Pb-Fe	0,673±0,137	0,004
Cd-Fe	0,749±0,140	0,001
Cd-Cu	-0,727±0,132	0,001
Fe-Cu	-0,835±0,174	0,000

С целью изучения связи уровня тяжелых металлов в щетине с концентрацией свинца в органах и тканях были вычислены коэффициенты корреляции. В табл. 4 приведены выявленные достоверные связи между содержанием химических элементов в щетине и свинца в паренхиматозных органах. Показано, что между изученными показателями существуют средние и высокие положительные и отрицательные корреляции. Для неинвазивного определения уровня свинца во внутренних органах были рассчитаны уравнения регрессии. Накопление Pb в печени можно определить по концентрации одного из следующих элементов в волосяном покрове: Fe, Zn, Cu, Pb, Mn и Cd. Аккумуляцию Pb в легких отражают Fe и Mn. Содержание Pb в селезенке можно установить только по уровню Fe в щетине.

Таблица 4
Корреляции уровней тяжелых металлов в щетине с содержанием свинца в органах свиней
Коррелирующие признаки, х-у		Rx/у	у=а+bx
Pb волос - Pbпечень	0,577±0,178	0,5023	у=0,1911+0,7571х
Cd волос - Pbпечень	0,694±0,139	0,1821	у=0,1576+2,8652х
Cu волос - Pbпечень	-0,833±0,082	-9,0018	у=0,7074-0,0458х
Fe волос - Pbпечень	0,729±0,125	226,1548	у=0,2492+0,0024х
Fe волос - Pbлегкое	0,567±0,175	138,5632	у=0,6177+0,0022х
Fe волос - Pbселезенка	0,546±0,188	107,6562	у=0,4437+0,0028х
Zn волос - Pbпечень	-0,579±0,178	-155,0744	у=0,6603-0,0023х
Mn волос - Pbлегкое	0,667±0,143	3,8794	у=0,5139+0,1026х

Наиболее информативным показателем из всех изученных является концентрация железа в щетине. По концентрации этого металла в волосе с использованием уравнений регрессии можно установить аккумуляцию свинца в печени, легких и селезенке. В то же время по уровню Mn в волосяном покрове возможно определить концентрацию Pb только в селезенке. Степень связи содержания тяжелых металлов в щетине не всегда отражает корреляцию уровней этих элементов с аккумуляцией свинца в паренхиматозных органах (табл.3, 4).

Таким образом, с использованием уравнений регрессии возможно неинвазивное тестирование концентрации свинца в печени, легких и селезенке по уровню железа в щетине.

Литература

1. Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. - М.: Издательский дом «ОНИКС 21 век»: Мир, 2004. - С.186-190.

2. Антонов А.Р. Микроэлементы в жизни человека / А.Р.Антонов, А.В.Ефремов // Природные минералы на службе здоровья человека. - Новосибирск, 1999. - С.28-39.

3. Летувнинкас А.И. Антропогенные геохимические аномалии и природная среда - Томск: Изд-во НТЛ, 2002. - С.122-221.

4. Скальный А.В. Мониторинг и оценка риска воздействия свинца на человека и окружающую среду с использованием биосубстратов человека / А.В.Скальный, А.В.Есенин // Токсикологический вестник. - 1996. - №6 - С.16-23.

5. ГОСТ 26932-86. Сырье и продукты пищевые. Методы определения свинца. - М.: Госстандарт России, 1986, - С.1-7.

6. ГОСТ Р 51301-99. Продукты пищевые и продовольственное сырье. Инверсионно-вольтамперометрические методы определения содержания токсичных элементов (кадмия, свинца, меди и цинка): - М.: Госстандарт России, 1999.- С.7-13.

7. ГОСТ 30538-97. Продукты пищевые. Методика определения токсичных элементов атомно-эмиссионным методом. - М.: Госстандарт России, 1997. - С.10-21.

8. ГОСТ 26929-94. Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения содержания токсичных элементов (кадмия, свинца, меди и цинка): - М.: Госстандарт России, 1994. - С.2-7.