молекулярная вакцина для профилактики бруцеллеза

Формула изобретения

Молекулярная вакцина для профилактики бруцеллеза, характеризующаяся тем, что она содержит белок внешних мембран бруцелл с аминокислотной последовательностью MRTLKSLVIVSAALLPFSATAFAADAIQEQPPVPAPVEVAPQYSWAGG YTGLYLGYGWNKAKTSTVGSIKPDDWKAGAFAGWNFQQDQIVYGVE GDAGYSWAKKSKDGLEVKQGFEGSLGARVGYDLNPVMPYLTAGIAG SQIKLNNGLDDESKFRVGWTAGAGLEAKLTDNILGRVEYRYTQYGNK NYDLAGTTVRNKLDTQDIRVGIGYKF,

конъюгированный с молекулярным носителем, в качестве которого используется ассоциативный домен летального фактора сибиреязвенного экзотоксина, состоящий из первых 254 аминокислот, и протективный антиген, доставляющий эту химерную молекулу внутрь антигенпрезентирующих клеток.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам конструирования вакцины и ее применения для профилактики бруцеллеза.

В настоящее время для профилактики бруцеллеза используются живые вакцины на основе аттенуированных штаммов Brucella abortus 82, 82 pn и 75/79 в России, Brucella abortus RB51 и 19 в США [1-4]. Живые бактериальные вакцины являются эффективным инструментом для создания защитного иммунитета против внутриклеточных паразитов, но в случае с бруцеллами такие вакцины не обеспечивают достаточного уровня защиты. Все перечисленные вакцины не обеспечивают 100% защиту животных от бруцеллеза. Кроме того, они не безопасны для человека и при вакцинации могут провоцировать развитие инфекционного процесса. Практическое использование этих вакцин показало, что вакцинация во многих случаях приводит к развитию вялотекущей бруцеллезной инфекции с разнообразными осложнениями аллергенного характера.

Известна также вакцина на основе инактивированных нагреванием при 80°С клеток бруцелл штамма 45/20 и разрушенных ультразвуком [4]. Антигенная субстанция осаждается 10% трихлоруксусной кислотой и лиофильно высушивается. Данная вакцина требует двукратного введения и обладает высокореактогенными свойствами.

Другим известным препаратом является вакцина на основе белково-полисахаридного комплекса, выделенного химическим путем из клеток бруцелл. Основным недостатком этого препарата является неизвестный состав и отсутствие возможности введения стандартизации различных партий [5].

Настоящее изобретение позволяет решить такие задачи, как высокая стандартизации препарата на основе точного химического состава вакцины, дозируемость и возможность введения различными способами (внутримышечно, подкожно), при этом достигается следующий результат: при двукратном подкожном введении создает напряженный и длительный (не менее одного года) иммунитет у привитых животных, эффективный против экспериментального заражения бруцеллами за счет индукции специфических цитотоксических лимфоцитов [6].

Сущностью изобретения является молекулярная вакцина для профилактики бруцеллеза на основе белка внешних мембран бруцелл с молекулярным весом и аминокислотной последовательностью

MRTLKSLVIVSAALLPFSATAFAADAIQEQPPVPAPVEVAPQYSWAGGYT GLYLGYGWNKAKTSTVGSIKPDDWKAGAFAGWNFQQDQIVYGVEGDAGYS WAKKSKDGLEVKQGFEGSLGARVGYDLNPVMPYLTAGIAGSQIKLNNGLDD ESKFRVGWTAGAGLEAKLTDMLGRVEYRYTQYGNKNYDLAGTTVRNKLDTQDIRVGIGYKF [7] конъюгированного с молекулярным носителем, в качестве которого был использован ассоциативный домен летального фактора сибиреязвенного экзотоксина, состоящий из 254 аминокислот и таким образом лишенный ферментативной активности, присущей нативному белку, а также протективный антиген, доставляющий эту химерную молекулу внутрь антигенпрезентирующих клеток.

Рекомбинантные белки, входящие в состав молекулярной вакцины в соотношении 1:1, очищали с помощью аффинной хелатирующей хроматографии. Культуры штаммов Е. coli BL21, продуцентов белков, выращивали на L-бульоне с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) до OD₆₀₀=0,6-0,8 и индуцировали экспрессию рекомбинантных белков с помощью 1-2 mM изопропил-D-тиогалакгопиранозила (ИПТГ). Через три часа после культивирования с индуктором бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 6000 g в течение 30 минут и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора (3 раза по 30 секунд с минутным интервалом при мощности 150 ватт) в присутствии ингибитора протеаз PMSF. После удаления центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут клеточного дебриса супернатант наносили на колонку Ni²⁺-сефарозой. Связанный белок элюировали 0,5 М имидозола. Очищенные рекомбинантные белки обессоливали на колонке с биогелем Р6, уравновешенным Na-фосфатным буферным раствором рН7,2 и хранили при 4°С.

Пример. Профилактическую эффективность разработанного препарата изучали на мышиной модели бруцеллеза. В качестве модели экспериментального бруцеллеза использовали мышей линии СВА, инфицированных дозой в 10⁴ КОЕ (колонеобразующих единиц) штамма Brucella abortus S19. Через 7-10 дней высевы из селезенки демонстрировали инфицированность на уровне 10^5,5-6 КОЕ. Животным (в каждой группе по 10) вводили препараты рекомбинантных белков в дозах от 50 до 500 нг подкожно в объеме 0,1 мл. Через месяц проводили повторную иммунизацию. Через 6 месяцев после последней иммунизации животным внутрибрюшинно в дозе 10⁴ КОЕ вводили культуру Brucella abortus S19, выращенную на чашках с эритрит-агаром, в объеме 0,5 мл. Вскрытие проводили на 7-10 сутки после заражения. Селезенку взвешивали и помещали в стерильную ступку, тщательно растирали пестиком до получения однородной массы. В ступку с гомогенатом вносили 5 мл стерильного Na-фосфатного буфера с 0,2% Tween 80, дополнительно гомогенизировали и титровали шагом 1:10. Из каждого разведения производили посев в объеме 0,1 мл на чашки с эритрит-агаром с добавлением полимиксина. Предварительный учет результатов проводили через 5 суток, окончательный учет - через 10 суток.

Препарат	Высеваемость (logKOE) при различных инфицирующих дозах
	102 КОЕ	104 КОЕ
Контроль	3,39±	5,69±
LFn-omp25	3,11±	5,46±
LFn-omp25+PA, 50 нг	0,15±	4,41±
LFn-omp25+PA, 100 нг	0±	3,18±
LFn-omp25+PA, 500 нг	0±	3,03±

Таким образом, разработанная молекулярная вакцина индуцирует специфический и длительный иммунитет, эффективно защищающий от инфицирования высокими дозами бруцелл: двукратное введение молекулярной вакцины подкожно в дозе от 100 нг до 500 нг эффективно и статистически достоверно снижает инфицированность в 70-100 раз при инфицирующей дозе 10⁴ КОЕ и демонстрирует отсутствие высеваемости при инфицирующей дозе 10² КОЕ.

Использование: ветеринария, профилактика бруцеллеза. Сущность изобретения: двукратное подкожное введение вакцины, содержащей белок внешних мембран бруцелл оmр25, конъюгированный с молекулярным носителем генно-инженерными методами, создает напряженный иммунитет у привитых животных, эффективный против экспериментального заражения бруцеллами.

Источники информации

1. Сухая живая вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма №19. ГОСТ 1859 - 73.

2. Патент Франции №2479000, МПК. F 61 K 39/10, 1983.

3. Авторское свидетельство СССР №467933 МПК F 61 K 39/08, опубл. 1975.

4. Ветеринарные препараты. Справочник /Сост. Ю.Ф.Борисович, Л.В.Кириллов./ Под ред. Д.Ф.Осидзе. М.: Колос, 1981, с.178-180.

5. Изучение иммуногенной активности искусственных бруцеллезных антигенов. /Петров Р.В. и др./ - ЖМЭИ. №7, 1988, с.39-42.

6. Induction of specific cytotoxic lymphocytes in mice vaccinated with Brucella abortus RB51 /He Y, Vemulapalli R, Zeytun A, Schurig GG./ Infect Immun. 2001 Sep; 69(9): 5502-8.

7. Nucleotide sequence and expression of the gene encoding the major 25-kilodalton outer membrane protein of Brucella ovis: Evidence for antigenic shift, compared with other Brucella species, due to a deletion in the gene /Cloeckaert A, Verger JM, Grayon М, Zygmunt MS, Grepinet O./ Infect Immun. 1996 Jun; 64(6): 2047-55.