способ и устройство манипулирования микроносителями для их идентификации

Формула изобретения

1. Способ манипулирования микроносителем для идентификации, заключающийся в том, что:

(а) осуществляют идентификацию микроносителя,

(б) а позиционирование и ориентирование микроносителя осуществляют до или во время идентификации, при этом позиционирование и ориентирование микроносителя обеспечено относительно записывающего средства и считывающего средства, и считывающее средство учитывает информацию о позиции и ориентировании микроносителя.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при идентификации осуществляют обнаружение идентифицируемого или кодированного микроносителя.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при идентификации осуществляют мечение идентифицируемого или кодированного микроносителя.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве микроносителя используют кодированный микроноситель, который кодируют кодом, наносимым на микроноситель.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что микроноситель кодируют кодом, наносимым на микроноситель путем воздействия на микроноситель источником света с высокой разрешающей способностью.

6. Способ по любому из предыдущих пп.1-5, отличающийся тем, что для манипулирования популяцией микроносителей для их идентификации на шаге позиционирования и ориентирования

(б.1) осуществляют распределение популяции микроносителей в однослойной системе и

(б.2) ограничивают вращательное движение микроносителей.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что при распределении обеспечивают плоскую конфигурацию микроносителя в двух измерениях (X, Y).

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что при распределении обеспечивают линейную конфигурацию микроносителя.

9. Способ по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что при распределении осуществляют транспортирование микроносителей в ламинарном потоке в жидкой, газообразной или полутвердой среде.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что ламинарное течение обеспечивают в капиллярной трубке.

11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что шаг позиционирования и ориентирования осуществляют за счет физического, механического, химического или биологического взаимодействия на микроносителе или вблизи него.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что при позиционировании и ориентировании ограничивают вращательное движение микроносителя путем воздействия магнитным полем, прилагаемым к микроносителю.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что при позиционировании и ориентировании ограничивают вращательное движение микроносителя путем воздействия электрическим полем, прилагаемым к микроносителю.

14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что этап позиционирования и ориентирования обеспечивают за счет несферической конфигурации микроносителя и в частности эллипсоидной или цилиндрической конфигурации микроносителя.

15. Способ манипулирования микроносителем для идентификации, заключающийся в том, что

а) позиционируют и ориентируют микроноситель,

б) кодируют микроноситель путем нанесения на него кода,

в) проводят реакцию мишени - анализируемого вещества на микроносителе или в нем,

г) позиционируют и ориентируют микроноситель и

д) идентифицируют указанный микроноситель,

при этом позиционирование и ориентирование микроносителя обеспечено относительно записывающего средства и считывающего средства и считывающее средство учитывает информацию о позиции и ориентировании микроносителя.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что выполняют по меньшей мере один шаг, указанный по любому из пп.1-14.

17. Способ по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что кодирование выполняют путем выполнения приема, выбранного из группы, состоящей из фотохромирования, химического травления, осаждения материала, фотообесцвечивания или воздействия на микроноситель источником света с высокой разрешающей способностью.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что при кодировании осуществляют фотохромирование.

19. Способ по п.17, отличающийся тем, что при кодировании осуществляют фотообесцвечивание.

20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что позиционирование и ориентирование выполняют за счет физического, механического, химического или биологического взаимодействия на микроносителе или вблизи него.

21. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что при позиционировании и ориентировании ограничивают вращательное движение микроносителя путем воздействия магнитным полем на микроноситель.

22. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что при позиционировании и ориентировании ограничивают вращательное движение микроносителя путем воздействия электрическим полем на микроноситель.

23. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что позиционирования и ориентирования выполняют за счет несферической конфигурации микроносителя и в частности эллипсоидной или цилиндрической конфигурации микроносителя.

24. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что позиционирование и ориентирование выполняют в проточной кювете.

25. Способ по любому из пп.1-24, отличающийся тем, что идентификацию осуществляют с помощью оптического средства идентификации.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что в качестве оптического средства идентификации используют средство, выбранное из группы, состоящей из лазерного луча, микроскопа передачи, софокусного микроскопа, флуоресцентного микроскопа.

27. Способ по любому из пп.1-26, отличающийся тем, что при кодировании осуществляют нанесение кода на микроноситель, причем код формируют пространственной модуляцией, создаваемой внутри микроносителя или на его внешней поверхности.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что в качестве пространственной модуляции используют расположение конечного числа определенных объемных элементов внутри микроносителя или на его поверхности.

29. Способ по п.26 или 27, отличающийся тем, что для пространственной модуляции выполняют одну из операций:

(i) изменяют одно или несколько свойств материала в отдельном объемном элементе,

(ii) удаляют материал из отдельного объемного элемента,

(iii) размещают материал на отдельном объемном элементе,

(iv) оставляют отдельный объемный элемент неизменным либо выполняют сочетание указанных операций.

30. Способ кодирования микроносителя, отличающийся тем, что осуществляют нанесение кода на микроноситель, причем код формируют пространственной модуляцией, создаваемой внутри микроносителя или на его поверхности, при этом при нанесении кода предусмотрено знание позиции или ориентации микроносителя.

31. Способ по п.30, отличающийся тем, что при пространственной модуляции осуществляют расположение конечного числа определенных объемных элементов внутри микроносителя или на его поверхности.

32. Способ по п.30 или 31, отличающийся тем, что для пространственной модуляции выполняют одну из операций:

(i) изменяют одно или несколько свойств материала в отдельном объемном элементе,

(ii) удаляют материал из отдельного объемного элемента,

(iii) размещают материал на отдельном объемном элементе,

(iv) оставляют отдельный объемный элемент неизменным либо выполняют сочетание указанных операций.

33. Кодированный микроноситель, который получают способом, заявленным по любому из пп.30-32.

34. Устройство манипулирования микроносителем для идентификации, отличающееся тем, что содержит средство для идентификации, выбранное из группы, состоящей из микроскопа или средства мечения, такого, как источник света с высокой разрешающей способностью, и средство для позиционирования и ориентации микроносителей, а также записывающее средство и считывающее средство, относительно которых обеспечивается позиционирование и ориентирование микроносителя, при этом считывающее средство выполнено с возможностью учета информации о позиции и ориентировании микроносителя.

35. Устройство по п.34, отличающееся тем, что средство для позиционирования и ориентирования микроносителей содержит твердый носитель, содержащий множество лунок, выполненных с возможностью размещения в них по меньшей мере одного микроносителя или средства ограничения вращения.

36. Устройство по п.35, отличающееся тем, что в качестве средства ограничения вращения используют магнитное и/или электрическое поле.

37. Устройство по п.34, отличающееся тем, что содержит емкость, выполненную с возможностью размещения популяции микроносителей, которая соединена с капиллярной трубкой и средством создания разности давлений для обеспечения ламинарного течения в капиллярной трубке.

38. Устройство по п.37, отличающееся тем, что магнитное и/или электрическое поле используется для ограничения вращения микроносителей.

39. Микроноситель, выполненный с возможностью применения в способе согласно любому из пп.1-32.

40. Микроноситель по п.39, отличающийся тем, что на микроноситель нанесен код.

41. Микроноситель по любому из пп.39, 40 или 33, отличающийся тем, что код нанесен путем воздействия на микроноситель источником света с высокой разрешающей способностью.

42. Микроноситель по любому из пп.39-41, отличающийся тем, что микроноситель также содержит электрический суммарный заряд, электрический дипольный момент или магнитный дипольный момент, при этом микроноситель является ферро-, ферри- или парамагнитным, имеет анизотропию формы, анизотропию распределения массы или комбинацию этих признаков.

43. Микроноситель по любому из пп.39-42, отличающийся тем, что код нанесен операцией, выбранной из группы, состоящей из фотохромирования, химического травления, осаждения материала, фотообесцвечивания или воздействия источником света с высокой разрешающей способностью.

44. Микроноситель по п.43, отличающийся тем, что код нанесен фотохромированием.

45. Микроноситель по п.43, отличающийся тем, что код нанесен фотообесцвечиванием.

46. Применение микроносителя по любому из пп.39-45 или 33 для высокопроизводительного тестирования.

47. Способ изготовления кодированного микроносителя по любому из пп.39-45 или 33, заключающийся в том, что на микроноситель наносят код.

48. Способ по п.47, отличающийся тем, что код наносят приемом, выбранным из группы, состоящей из фотохромирования, химического травления, осаждения материала, фотообесцвечивания, воздействия источником света с высокой разрешающей способностью.

49. Способ по п.48, отличающийся тем, что код наносят фотохромированием.

50. Способ по п.48, отличающийся тем, что код наносят фотообесцвечиванием.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу и устройству манипулирования микроносителями для идентификации, в частности к манипулированию микроносителями с нанесенным на них кодом.

В данном описании коды, нанесенные «на» микроносители, включают коды, нанесенные на поверхность микроносителей, а также коды, нанесенные в микроносители. Целями идентификации являются, например, считывание или обнаружение и мечение или кодирование микроносителя.

Предшествующий уровень техники

Обнаружение лекарственного средства и тестирование на наличие лекарственного средства в химии и биологии обычно предполагают выполнение количественных анализов по большим количествам соединений или молекул. Анализы обычно включают просмотр химических библиотек относительно искомых соединений, тестирование на наличие искомых молекул в проверяемых образцах и общую проверку наличия искомых химических и биологических взаимодействий между молекулами. Для этих анализов нередко требуется проведение тысяч отдельных химических или биологических реакций. Например, анализ на обнаружение лекарственного средства предполагает проверку тысяч соединений для определения целевого анализируемого вещества. Любые соединения, которые реагируют, связываются или иным образом взаимодействуют с целевым анализируемым веществом, могут указывать на любое число возможностей, при которых наблюдаемое взаимодействие считается важным.

При проведении анализов имеются практические трудности при манипулировании большим числом отдельных взаимодействий. Наиболее значительной трудностью является необходимость мечения и отслеживания каждой реакции. Например, если искомая реакция наблюдается только в одной группе из тысяч реакций, то исследователь должен суметь определить, какое именно одно из тысяч исходных соединений или молекул дало эту реакцию.

Один из известных способов отслеживания реакций заключается в физическом отделении каждой реакции и проведении в отдельном реакционном сосуде в матрице высокой плотности, и регистрации идентичности отдельных реагентов, использованных в каждом сосуде. Если искомая реакция наблюдается в сосуде, маркированном номером от 5 до 1000, то исследователь может обратиться к регистрации использованных в этих сосудах реагентов и узнает по регистрации сосуда 5, какие именно реагенты, присутствовавшие в нем, дали искомую реакцию. Примерами упомянутых высокоплотных матриц являются 384-, 864-, 1536-, 3456- и 9600-луночные титрационные микропланшеты, где каждая лунка представляет собой миниатюрный реакционный сосуд. Миниатюризированные реакционные лунки используют по той причине, что они сохраняют пространство, позволяют увеличить скорость и снизить стоимость используемых в количественных анализах реагентов.

Применение емкостей титрационных микропланшетов в химических и биологических количественных анализах имеет ряд недостатков. Например, при использовании планшетов необходимо тщательно разделять очень большое число отдельных реакционных сосудов с исключением возможности свободного протекания всех реакций. Часто более удобно проводить реакцию в одном реакционном сосуде. Помимо этого, требование пространственного разделения реакционных объемов подразумевает физическое ограничение размера используемого титрационного микропланшета, и поэтому число разных реакций, которые можно проводить на планшете, ограничено.

Ввиду указанных ограничений делались некоторые попытки разработать другие средства отслеживания отдельных реакций в высокопроизводительных количественных анализах. Отказались от идеи пространственного разделения реакций и вместо этого отслеживают отдельные реакции другими средствами. Например, разработаны способы выполнения высокопроизводительных количественных анализов и реакций на микроносителях в качестве подложек. Каждый микроноситель может содержать один определенный лиганд, связанный с его поверхностью, чтобы действовать в качестве реагента. Микроноситель может дополнительно содержать «код», который идентифицирует микроноситель, и поэтому идентифицирует определенный лиганд, связанный с его поверхностью. Описываемые выше способы обеспечивают возможность проведения «произвольной обработки», что означает, что тысячи особо кодированных микроносителей, каждый из которых имеет связанный с его поверхностью лиганд, могут быть смешаны и проанализированы одновременно. Коды микроносителей, которые дают искомую благоприятную реакцию между приданным лигандом и мишенью-анализируемым веществом, можно затем посчитать, т.е. определяя идентичность лиганда, давшего благоприятную реакцию.

Основная трудность известных способов заключается в произвольной позиции микроносителей для идентификации, и поэтому в низкой эффективности кодирования и идентификации. Простое позиционирование микроносителя на носителе недостаточно для обеспечения эффективного кодирования и идентификации. Несколько документов раскрывают позиционирование на твердом носителе. Упоминаемая выше практика применения произвольного носителя требует точного кодирования каждого микроносителя отдельно, и для нее требуется точная, надежная и достоверная идентификация кодов. Поскольку количественные анализы, использующие произвольную обработку, в основном проводятся при кодировании микроносителей, поэтому качество количественных анализов в значительной степени зависит от надежности и читаемости индивидуального кода, числа кодов, точного размера и читаемости кодов на микроносителях. Попытки кодирования микроносителей пока еще ограничены отличающимся друг от друга окрашиванием: микросферы Dye-Trak, флуоресцирующее мечение - Флуоросферы; Nu-flow, так называемыми дистанционно программируемые матрицы с памятью - IRORI; патент США 5751629, съемные метки, такие как олигонуклеотиды и малые пептиды - патент США № 5565324; US № 5721099; US 5789172), и частицы твердой фазы, имеющие ответчики - US № 5736332).

В публикации международной заявки WO98/40726 раскрыт твердый носитель, представляющий собой выполненный из пучка оптических волокон датчик, в котором отдельные микросферы с разными химическими свойствами можно оптически связать с отдельными волокнами или группами волокон в пучке. Свойства кодируют на отдельных микросферах с помощью флуоресцентных красителей и затем их прикрепляют к лункам, вытравленным в конце пучка.

Краткое изложение существа изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание способа манипулирования микроносителями, с помощью которого улучшают их позиционирование и ориентацию. Согласно изобретению, предложен способ манипулирования микроносителями для их идентификации, включающий в себя следующие этапы:

(а) этап для идентификации микроносителя и

(б) этап позиционирования и ориентирования до или во время этапа идентификации.

Несмотря на то что данный способ предполагает позиционирование и ориентирование до или во время этапа идентификации, данное изобретение обеспечивает усовершенствованную, более эффективную и более надежную идентификацию, благодаря отсутствию произвольного количества степеней свободы при позиционировании микроносителя.

Изобретение позволяет осуществлять считывание или нанесение кода на микроноситель, причем код формируют пространственной модуляцией, создаваемой в микроносителе или на его внешней поверхности. Пространственную модуляцию можно сформулировать как известное расположение конечного числа определенных объемных элементов, находящихся в микроносителе или на поверхности микроносителя. Известное расположение определенных объемных элементов можно сформировать (i) изменением одного или нескольких свойств материала в отдельном объемном элементе, (ii) путем удаления материала из отдельного объемного элемента, (iii) путем размещения материала на отдельном объемном элементе, (iv) оставляя отдельный объемный элемент неизменным, либо сочетанием указанных выше вариантов. Расположение может быть таким, что объемные элементы располагаются в одном или нескольких измерениях, таком как линейное расположение или расположение в плоскости.

Задачей настоящего изобретения является создание способа, обеспечивающего позиционирование и ориентирование микроносителя относительно записывающего средства и считывающего средства таким образом, что знание позиции и ориентирования микроносителя позволит записывающему средству сформировать код путем формирования известного расположения конечного числа определенных объемных элементов. Указанный код впоследствии можно надежным образом расшифровать считывающим средством с помощью информации о позиции и ориентировании микроносителя с нанесенным кодом. Код расшифровывают путем измерения свойств тех объемных элементов, которые совместно образуют код, находящийся в микроносителе или на поверхности микроносителя. Ориентирование можно выполнить по одной, двум или всем трем осям, в зависимости от симметрии расположения объемных элементов. Если расположение выполнено симметрично вокруг одной оси или нескольких осей, то микроноситель не нужно ориентировать по вращению вокруг этих осей.

Поставленная задача решается путем создания способа манипулирования микроносителем в целях идентификации, согласно которому осуществляют идентификацию микроносителя и позиционирование и ориентирование до идентификации или во время идентификации. Согласно изобретению возможно обнаружить идентифицируемый или кодированный микроноситель. Для идентификации осуществляют мечение, результатом которого является идентифицируемый или кодированный микроноситель.

Согласно еще одному варианту выполнения изобретения предложен способ манипулирования микроносителем для его идентификации, согласно которому микроноситель является кодированным микроносителем с помощью кода, нанесенного на микроноситель. Микроноситель кодируют кодом, нанесенным на микроноситель, при котором микроноситель подвергают воздействию от источника света высокой разрешающей способности.

Согласно изобретению предложен способ манипулирования популяцией микроносителей для идентификации, согласно которому на этапе позиционирования и ориентирования осуществляют

(b.1) распределение популяции микроносителей в однослойной системе, и

(b.2) ограничение вращательного движения микроносителей.

Согласно данному изобретению при распределении на этапе b.1 получают плоскую конфигурацию, имеющую два измерения X и Y.

Согласно данному изобретению при распределении на этапе b.1 получают линейную конфигурацию. Одномерная конфигурация обеспечивает более быстрое обнаружение.

Согласно данному изобретению на этапе распределения осуществляют транспортирование микроносителей в ламинарном потоке в жидкой, газообразной или полутвердой среде. Транспортирование микроносителей обеспечивает возможность получить фиксированную позицию средства обнаружения, при этом в еще большей степени повышается скорость обнаружения и устраняется необходимость калибровки средства обнаружения.

Согласно изобретению ламинарное течение обеспечивают в капиллярной трубке. Помимо ламинарного течения также возможны другие виды течения.

Согласно данному изобретению на этапе распределения осуществляют позиционирование микроносителей в полужидком или жидком носителе, который имеет разную вязкость или плотность и может состоять из двух или более полужидких или жидких слоев разной вязкости или плотности. Поэтому микроноситель может плавать или его можно расположить на или в носителе на границе перехода вязкости или изменения плотности. Позиция микроносителя может быть разной в зависимости от плотности микроносителя. Отсутствие течения при распределении микроносителей обеспечивает возможность мобильности средству обнаружения.

Согласно данному изобретению на этапе позиционирования и ориентирования осуществляют физическое, механическое, химическое или биологическое взаимодействие на микроносителе или вблизи него. Например, химическое взаимодействие может быть любым видом взаимодействия, таким как ковалентное взаимодействие или вандерваальсово взаимодействие. Биологическое взаимодействие можно получить через непосредственную или косвенную связь микроносителя с носителем, реализованную, например, взаимодействием авидина/биотина, антитела/антигена, антитела/гаптена, рецептора/лиганда, сахара/лектина, дополняющей нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК, или их сочетания), фермента/основы, фермента/кофактора, фермента/ингибитора и/или иммуноглобулина/стафилококкового белка А.

Согласно данному изобретению на этапе позиционирования и ориентирования ограничивают вращательное движение микроносителя путем наложения магнитного поля на микроноситель.

Согласно данному изобретению на этапе позиционирования и ориентирования ограничивают вращательное движение микроносителя путем наложения электрического поля на микроноситель.

Согласно данному изобретению на этапе позиционирования и ориентирования осуществляют несферическую конфигурацию микроносителя, в частности, эллипсоидную или цилиндрическую конфигурацию.

Поставленная задача решается путем создания устройства манипулирования микроносителем для идентификации, которое содержит средство считывания или обнаружения для идентификации, выбранное из группы, состоящей из оптического средства, электронного средства, физического средства, химического средства и магнитного средства, средства мечения в виде источника света с высокой разрешающей способностью, и средство для позиционирования и ориентирования микроносителей.

Согласно изобретению устройство манипулирования микроносителем содержит в качестве средства идентификации микроскоп или средство мечения в виде источника света с высокой разрешающей способностью и средство для позиционирования и ориентирования микроносителей.

Согласно изобретению средство для позиционирования и ориентирования микроносителей содержит твердый носитель, содержащий множество лунок, каждая из которых выполнена с возможностью размещения в ней по меньшей мере одного микроносителя и средства ограничения вращения.

Согласно изобретению средство для позиционирования и ориентирования микроносителей содержит полужидкий или жидкий носитель и средство ограничения вращения. Указанный жидкий или полужидкий носитель может иметь разную вязкость или плотность, либо может содержать два или более полужидких или жидких слоев с разной вязкостью и плотностью. Микроноситель поэтому может плавать, либо его можно позиционировать и ориентировать на или в носителе на границе перехода изменения вязкости или плотности. Позиция и ориентирование могут изменяться согласно плотности микроносителя.

Согласно изобретению в качестве средства ограничения вращения используют источник магнитного и/или электрического поля.

Согласно изобретению устройство также содержит емкость для размещения популяции микроносителей, которая выполнена с возможностью соединения с капиллярной трубкой и средством создания разности давлений для обеспечения ламинарного течения в капиллярной трубке.

Согласно изобретению, в устройстве использован источник магнитного и/или электрического поля, обеспечивающий ограничение вращения микроносителей.

Поставленная задача решается путем создания микроносителя, который предназначен для его применения в заявленном способе, причем микроноситель закодирован кодом, нанесенным на микроноситель.

Согласно изобретению кодированный микроноситель характеризуется тем, что код наносится путем воздействия на микроноситель источником света с высокой разрешающей способностью.

Согласно изобретению кодированный микроноситель характеризуется тем, что код наносится путем осаждения материала на поверхности микроносителя или внутрь указанного микроносителя.

Согласно изобретению микроноситель также содержит электрический суммарный заряд, электрический дипольный или магнитный дипольный момент.Микроноситель может быть ферро-, ферри- или парамагнитным либо имеет анизотропию формы, анизотропию распределения массы, или любое сочетания этих характеристик.

Ниже изложены различные типы микроносителей, которые можно использовать.

В описании термин «микроноситель», также называемый «микросфера», «гранула» или «микрочастица», относится к реакционному объему или к носителю, которые могут быть выполнены, например, из любых материалов, которые обычно применяют в высокопроизводительной методике тестирования и диагностики. Например, микроносители могут быть выполнены из твердого, полутвердого вещества или из сочетания твердого и полутвердого веществ, и они могут быть носителями, используемыми в химических и биологических количественных анализах и синтезах. Примерами материалов являются целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, агар, пористое стекло, силикагель, полистирол, бромированный полистирол, полиакриловая кислота, полиакрилнитрил, полиамид, полиакролеин, полибутадиен, поликапролактон, сложный полиэфир, полиэтилен, полиэтилентерефталат, полидиметилсилоксан, полиизопрен, полиуретан, поливинилацетат, поливинилхлорид, поливинилпиридин, поливинилбензилхлорид, поливинилтолуол, поливинилиденхлорид, поливинилбензол, полиметилметакрилат, полилактид, полигликолид, поли(лактид-ко-гликолид), полиангидрид, полиортоэфир, полифосфазол, полифосфаз, полисульфон; привитой сополимер, такой как полиэтиленгликоль/полистирол, декстраны с перекрестными связями (сшитые), метилстирол, полипропилен, акриловый полимер, парамагнетик, углерод, графит, поликарбонат, полипептид, гидрогели, липосомы, белковый полимер, диоксид титана, латекс, смола, липид, керамика, древесный уголь, металл, бентонит, каолинит, резина, полиакриламид, латекс, силикон, напр. полидиметилдифенилсилоксан, диметилакриламид, и т.п. или приемлемые сочетания вышеуказанных материалов.

Предпочтительными материалами являются: латекс, полистирол или сшитые декстраны. Микроносителями могут быть также прокариотные и эукариотные клетки и даже некоторые вирусы. Указанные микроносители могут иметь любые формы и размеры, соответствующие для кодирования, позиционирования и ориентирования и для последующей их идентификации. Например, микроносители могут иметь форму сферы или форму гранул, которые не обязательно должны быть сферическими. Микроносители могут быть цилиндрическими или овальными. Микроносители сферической формы могут иметь диаметр 0,5-300 мкм. Микроноситель может также иметь диаметр от 1 до 200 мкм. Прочие примеры соответствующих размеров для указанного микроносителя могут иметь значения от 10 до 90 мкм.

Микроноситель может иметь суммарный электрический заряд или электрический дипольный момент.

Микроноситель может быть магнитным, или иметь магнитный дипольный момент.

Микроноситель может иметь некоторую анизотропию формы. Например, микроноситель может иметь осевую симметричную форму, напр. форму стержня, эллипсоида или цилиндра.

Микроноситель может иметь определенную анизотропию распределения массы. Например, один участок частицы может быть более плотным, в результате чего одна сторона будет тяжелее другой. Также если микроноситель имеет асимметричную форму, то это будет отражено также асимметричным распределением массы.

Может быть использован кодированный микроноситель согласно заявке PCT/ЕР00/032280.

Микроноситель имеет сочетание некоторых или всех указанных выше признаков.

Микроноситель обладает разными свойствами, такими как оптическая прозрачность, ферромагнетизм, и также может иметь функциональную поверхностную группу для связывания лигандов, таких как белки. Микроноситель может содержать один или несколько красителей, таких как флуорофоры, люминофоры и т.п., или их сочетания. Ферромагнетизм можно ввести путем осаждением на месте ферромагнитного материала или с помощью полимерного покрытия, содержащего ферромагнитные наночастицы. Примерами ферромагнитных материалов являются Cr ₂O₃, Fe₂O₃, Fe₃ O₄, Ni- и Со-металлы, прочие окислы металлов и металлы. Соединения можно ввести во время приготовления микроносителя, либо на последующем модификационном этапе, таком как вымачивание или нанесение покрытия. Ферромагнитный материал может присутствовать в указанном микроносителе в концентрации в пределах от 0,1 до 50 об.%, либо в концентрации от 0,5 до 40%, либо в концентрации от 1 до 30%.

Коды, наносимые на микроносители согласно заявке РСТ/ЕР00/03280, могут иметь любую геометрию, рисунок или символ, которые могут быть нанесены и считаны. Коды могут наноситься в виде цифр или букв, либо как коды в виде символов, изображений, штрих-кодов, кольцевых кодов, или трехмерных кодов. Кольцевые коды аналогичны штрих-кодам, за исключением, что вместо прямых линий используют концентрические линии. Кольцо может содержать ту же информацию, что и один штрих. Коды могут быть нанесены на поверхности микроносителей либо в микроноситель. Например, коды могут быть нанесены в микроносители, и в частности на центральной плоскости микроносителей. В зависимости от формы микроносителей центральная плоскость может быть предпочтительным местом для нанесения кода, т.к. она может обеспечивать самую большую площадь для нанесения. При этом микроносители могут иметь искривленную поверхность. Более предпочтительным может быть нанесение кодов внутрь, а не на искривленные поверхности. Удобнее наносить и считывать коды на плоской плоскости, а не на искривленной поверхности.

Коды могут быть нанесены на микроносителях с помощью источника света с высокой разрешающей способностью, например, лазером, лампой или источником рентгеновского излучения, альфа и бета-излучения, ионных пучков или любым электромагнитным излучением. Коды можно также наносить на микроносители с помощью фотохромирования или химического травления. Удобным способом нанесения кодов является способ, осуществляемый с помощью источника света с высокой разрешающей способностью, в частности с помощью лазера или лампы в комбинации с софокусным микроскопом. Коды можно наносить внутрь микроносителя с помощью упомянутых выше способов.

Коды можно наносить осаждением материала на микроноситель или в микроноситель. Примерами способа осаждения являются лазерное осаждение и электрохимическое осаждение. Примеры материалов, которые можно использовать для указанного осаждения, включают в себя следующие: любые органические соединения или материалы, любые неорганические соединения или материалы, слой из макрочастиц материала или композитного материала, полимерные материалы, кристаллические или некристаллические материалы, аморфные материалы или стекло, углеродный материал, например, частицы графита или углеродные нанотрубки, металлический материал, например, золото, серебро, медь, никель, палладий, платина, кобальт, родий, иридий, любой металлический халькогенид, оксид металла, например, оксид меди, диоксид титана, сульфид металла, селенид металла, теллурид металла, сплав металла, нитрид металла, фосфид металла, антимонид металла, полупроводник, полуметалл. Указанный материал можно осаждать в виде частиц, таких как микро- или наночастицы. Например, частицы являются наночастицами, когда их размер находится в пределах от 10 нм до 1000 нм.

Знание позиции и ориентации микроносителя существенно для облегчения нанесения и/или считывания указанных кодов, особенно когда этапы идентификации выполняют с высокой производительностью. Знание позиции и ориентации микроносителя в еще большей степени улучшает идентификацию.

Микроносители могут содержать светочувствительные вещества. Например, микроноситель может содержать обесцвечиваемое вещество, а коды на микроносителях могут быть выполнены в виде обесцвеченных рисунков в обесцвечиваемых частях микроносителей. Микроносители могут содержать обесцвечиваемое вещество либо на поверхности микроносителя или внутри микроносителя. Обесцвечивание веществ «на» микроносителях включает обесцвечивание на поверхности микроносителя, а также обесцвечивание в глубине микроносителей. Предпочтительными обесцвечиваемыми веществами являются обесцвечиваемые флуоресцентные вещества или вещества, поглощающие электромагнитное излучение. Микроносители могут содержать обесцвечиваемые люминофоры. Примеры соответствующих люминофоров включают в себя флуоресцирующие, фосфоресцирующие вещества или сцинтилляторы. Могут быть использованы обесцвечиваемые хемилюминесцентные, биолюминесцентные вещества или окрашенные вещества. Примерами обесцвечиваемых веществ, помимо прочих, являются: 3-гидроксипирен 5,8,10-трисульфоновая кислота, 5-гидрокситриптамин, 5-гидрокситриптамин (5-ГТ), кислотный фуксин, акридиновый оранжевый, акридиновый красный, акридиновый красный пигменты, акрифлафин, AFA (Акрифлавин Феулген SITSA), ализарин-комплексон, красный ализарин, аллофикоцианин, эластомерный сополимер акриловых эфиров с небольшим количеством сшивающего мономера, аминоактиномицин-D, аминокумарин, антроилстеарат, арил- или гетероарил-замещенный полиолефин, астразон бриллиантовый красный 4G, астразон оранжевый-R, астразон красный-6В, астразон желтый-7GGL, атабрин, аурамин, аурофосфин, аурофосфин-G, БАО-9, (бизаминофенилоксадиазол), BSECF, берберинсульфат, бисбензамид, ВОВО-1, раствор бланкофора-FFG, блаконфор-SV, Bodipy F1, BOPRO-1, бриллиантовый сульфофлавин-FF, кальциеновый синий, кальциевый зеленый пигменты, кальфтор RW - раствор, калькфтор белы, калькфтор белый АВТ - раствор, стандартный раствор калькфтора белого, карбоцианин, карбостирил, каскадный синий, каскадный желтый, катехоламин, хинакрин, корифосфин-О, кумарин, кумарин-фаллоидин, CY3.1 8, CY 5.1 8, CY 7, 1-диметиламинонафалин-5-сульфоновая кислота, диаминонафтилсульфоновая кислота, «дансил» NH-CH3, DAPI, диаминофенилоксидиазол (ДПАО), диметиламино-5-сульфоновая кислота, дипиррометенбромдифторид, дифенил брилоиантовый флавин 7GFF, допамин, эозин, эритрозин-ITC, этидбромид, эухрисин; флуоресценция, вызываемая формальдегидом; оранжевый пигмент Flazo, Fluo 3, «Флуо-3», флуоресцамин, флуоресцеин изотиоцианат, Fura-2, генакриловый блиллиантовый красный B пигмент, генакрил бриллиантовый желтый пигмент 10GF, генакрил розовый 3G пигмент, генакрил желтый-5GF пигмент, глоксалевая кислота, гранулированный синий пигмент, гематопорфирин, «Хехст 33258," Indo-1, Intrawhite cf жидкий пигмент, лейкофор PAF, лейкофор SF, лейкофор WS, лиссамин родамин B200, люциферовый желтый-CH пигмент, люциферовый желтый - VS пигмент, магдаловый красный пигмент, морской синий пигмент, максилоновый бриллиантовый флавин 10GFF, максилоновый бриллиантовый флавин 8GFF, метил-зеленый-пиронинстильбен, митрамицин, NBD-амин, нильский красный пигмент, нитробензоксадидол, N-(7-нитробенз-2-окса-1.3-диазол-4-ил)диэтиламин (NODD) , норадреналин, ядерный яркокрасный пигмент, ядерный желтый пигмент, найлосановый бриллиантовый флавин-Е8G, орегонский зеленый пигмент, оксазин, оксазол, оксадиазол, тихоокеанский синий пигмент, параросанилин (Феулген), раствор Phorwhite AR, Phorwhite BKL, Phorwhite Rev, Phorwhite RPA, фосфин-3R, фталоцианин, фикоэритрины, фикоэритрин R, полиазаиндацен понтохром сине-черный пигмент, порфирин, примулин, проционовый желтый пигмент, йодид пропида, питронин, пиронин В, пирозаловый бриллиантовый флавин 7GF, хинокриновый горчичный пигмент, родамин-123, родамин 5GLD, родамин 6G, родами B, родамин B200, родамин-B-Экстра, родамин-BB, родамин-BG, родамин-WT, розовый бенгальский пигмент, серотонин, севроновый бриллиантовый красный-2B пигмент, севроновый бриллиантовый красный-4G пигмент, севроновый бриллиантовый красный-B пигмент, севроновый оранжевый пигмент, севроновый желтый-L пигмент, SITS (примулин), SITS (стильбеновая изотиосульфоновая кислота), стильбен, «Snarf-1», сульфородамин B Can C, сульфородамин-G-экстра, тетрациклин, техасский красный пигмент, тиазиновый красный R пигмент, тиофламин S, тиофлафин TCN, тиофлафин-5, тиолит, тиозоловый оранжевый пигмент, тинопол CBS, ТОТО-1, ТОТО-3, истинный синий, Ultralite, Uranine B, Uvitex SFC, ксиленовый оранжевый пигмент, XRITC, YO PRP 1, или их комбинации. Либо обесцвечиваемые вещества содержат функциональные группы, способные образовывать устойчивую флуоресцентную продукцию, обычно имеющуюся в биомолекулах или полимерах, включая активированные сложные эфиры, изотиоцианаты, амины, гидразины, галиды, кислоты, азиды, имиды малеиновой кислоты, спирты, акриламиды, галоацетамиды, фенолы, тиолы, кислоты, альдегиды и кетоны. Объем вещества, которое можно обесцветить в микроносителях, находится в пределах от 0,01 куб. нм до 0,01 куб.мм микроносителя, или от 1 куб.нм до 100000 куб. мкм, или от 10000 и 10000 куб. мкм, или 0,01 куб. мкм до 1000 куб.мкм. Обесцвечиваемые вещества должны подбираться таким образом, что когда происходит обесцвечивание, то код остается на микроносителе по меньшей мере в течение времени, которое желательно для использования микроносителей и любого нужного считывания кодов. Указанный код должен быть сохранен по меньшей мере в течение количественного анализа, в котором используют микроноситель. Функциональный срок службы кода может длиться от нескольких минут до нескольких месяцев, даже до нескольких лет, в зависимости от выполняемого количественного анализа. Поэтому определенная степень диффузии необесцвеченных молекул приемлема, если сохранена полезная длительность кода. В данном документе термины «флуоресцентный краситель, флуоресцирующее вещество, флуорохром или флуорофор" используются взаимозаменяемо и имеют равное значение.

Коды, обесцвечиваемые на микроносителях, можно наносить с разной интенсивностью флуоресценции или цвета в обесцвеченных областях микроносителей. Например, обесцвеченное кодирование может содержать несколько разных степеней обесцвечивания, в результате чего будут иметься несколько разных интенсивностей флуоресценции в обесцвеченной области в целом. Поэтому микроносители можно кодировать не только по геометрии рисунка, обесцвеченного на микроносителях, но также и путем использования разных интенсивностей флуоресценции в данном рисунке.

Коды можно наносить на микроносители с помощью сканирующего микрофотолиза (СКМФ). Технические признаки СКМФ были впервые описаны в: P. Wedekind et al., "Scanning microphotolysis: a new photobleaching technique based on fast intensity modulation of a scanned laser beam and confocal imaging", Journal of Microscopy, том 176, стр.23-32, 1994.

Фотообесцвечивание представляет собой хорошо известное явление, относящееся к тускнению цвета в связи с тем, что определенные значения длины волны светового излучения при освещении пигмента вызывают резонанс молекул пигмента и последующий их распад. Флуоресцентные молекулы часто обесцвечиваются при возбуждении их лазерным лучом на определенной длине волны. Коды можно обесцвечивать светом с помощью обычного несканирующего светового микроскопа, в котором стационарный (лазерный) луч фокусируется на образец во время процесса обесцвечивания. Стационарная позиция лазерного светового луча во время обесцвечивания обеспечивает фотообесцвеченную область, имеющую круглую геометрию. Хотя несканирующие световые микроскопы технически дают облученную область диаметром 2 мкм или меньше, расширение пятна обесцвечения часто происходит вследствие стационарного лазерного луча. Это дает крупные круглые обесцвеченные пятна, которые имеют диаметр от 1 до 35 мкм, обычно 0 от 10 мкм до 20 мкм и даже больше 15-35 мкм. Распространение лазерных световых сканирующих микроскопов обеспечило новые возможности для микрофотолизных способов. Комбинация фотолиза, лучевого сканирования и софокусных микроскопов привела к разработке СКМФ. В СКМФ обесцвечивание происходит во время сканирования образца при переключении между нижним контролирующим и высоким уровнями светообесцвечивающей лазерной интенсивности за время менее микросекунды с помощью устройства модулирования интенсивности, такого как акустико-оптический модулятор («АОМ»). Комбинация обесцвечивания во время сканирования и использования АОМ, который формирует чрезвычайно краткие обесцвечивающие импульсы, исключает расширение пятна обесцвечивания, которое происходит в обычном микрофотолизе при более длительных светообесцвечивающих сроках, и стационарного лазерного луча. СКМФ предусматривает обесцвечивающие пятна на пределе разрешающей способности используемой линзы объектива.

Нанесение кодов на микроносители предусматривает обесцвечивание микроносителей для получения разных уровней интенсивности в обесцвеченном коде. Помимо информации в структуре самого кода информация может также быть представлена разными интенсивностями в обесцвеченных рисунках. Возможность кодирования микроносителей с разными интенсивностями может обеспечить возможность нанесения более мелких кодов на микроносителях, экономя пространство, но все же обеспечивая то же или большее число особых идентификаторов в гранулах. Возможно обесцвечивание четырех разных интенсивностей в гранулах. Это можно выполнить несколькими способами. Например, путем неоднократного обесцвечивания некоторых частей гранулы относительно других, либо путем рассеяния разных уровней акустической мощности в АОМ, чтобы получить некоторую совокупность разных лазерных мощностей, которые создадут обесцвеченные рисунки, имеющие разные интенсивности, на основе мощности света лазера, используемого для каждой части кода.

Код можно также нанести фотохромированием. Фотохромные материалы подвергаются необратимому изменению при поглощении света, вызванном электромагнитным излучением. В наиболее распространенных способах предусматриваются необратимые изменения цвета или прозрачности при воздействии видимого или ультрафиолетового цвета. Это часто наблюдается в видимом спектре 400-700 нм и может быть быстрым или очень медленным. Поэтому код можно нанести внутри гранулы, которая содержит фотохромный краситель, с помощью фокусированного ультрафиолетового светового излучения. Есть два основных класса фотохромных материалов - органический и неорганический. Примером неорганического типа являются галиды серебра. Органические фотохромные системы можно подразделить в соответствии с типом реакции. Фотохромные соединения могут быть растворимыми в обычных органических растворителях, таких как гексан, толуол, ацетон и диметилсульфоксид. Неограничивающим примером является дисперсия полистирола с концентрацией 99%. Указанные соединения также устойчивы как при высоком, так и при низком рН и стабильны в широком температурном диапазоне. Нужные фотохромные соединения являются необратимыми. Изменение цвета не обращается при отсутствии освещения. Наиболее интересными соединениями являются температурно-необратимые соединения, т.е. они не возвращаются в первоначальное бесцветное состояние при комнатной температуре. Целесообразными фотохромными красителями являются те, которые нельзя обесцветить обратно в их первоначальное состояние. Примерами фотохромных целесообразных соединений являются производные диарилетенов с гетероциклическими арильными группами, такие как арильные группы фурана, индола, тиофена, селенофена, тиазола; мономерные и полимерные формы указанных соединений и т.п.Примерами указанных соединений являются

1,2-дициано-1,2-бис(2,4,5-триметилтиофен-3-ил)этен;

2,3-бис(2,4,5-триметилтиофен-3-ил)малеиновый ангидрид;

1,2-бис(2,4-диметил-5-фенилтиофен-3-ил)перфторциклопентен;

1,2-бис(3-метил-2-тиэнил)перфторциклопентен;

1,2-ди(2-диметил-5-фенил-тиофен-3-ил)перфторциклопентен;

1,2-бис(2-метил-3-тиэнил)перфторциклопентен;

1,2-бис(2,5-диметил-3-тиэнил)перфторциклопентен;

2-(1-октил-2-метил-3-индолил)-3-(2,3,5-триметил-3-тиэнил)малеиновый ангидрид;

2-(2'-метоксибензо[b]тиофен-3-ил)-3-(2-диметил-3-индолил)малеиновый ангидрид;

1,2-бис(2-метил-5-фенил-3-тиэнил)-перфторциклопентен;

1,2-бис(2,4-метил-5-фенил-3-тиэнил)-перфторциклопентен;

1,2-бис(2-метил-6-нитро-1-бензотиофен-3-ил)перфторциклопентен;

1,2-бис(2-метокси-5-фенил-3-тиэнил)перфторциклопентен, и т.п.

Фотохромные соединения можно вводить в микросферу в количестве от 0,1 до 100%. Согласно другому варианту фотохромные соединения можно вводить в микросферу в количестве от 0,1 до 80% или в количестве от 0,1 до 50%. Фотохромное соединение можно также вводить в количестве от 1 до 3%. Фотохромный метод потенциально более быстрый и легкий с точки зрения управления им, чем обесцвечивание флуоресцентного красителя, поскольку окрашивание является обычно линейным с интенсивностью падающего излучения. Считывание упрощается, поскольку достаточно взять изображение, которое обнаруживает код на прозрачном фоне. Рисунок, нанесенный локализированным обесцвечиванием на флуоресцентной грануле, требует использование софокусного микроскопа для его обнаружения. Возможно кодирование до нескольких десятков тысяч микроносителей в секунду с помощью фотохромирования.

Для нанесения кодов можно также использовать другие способы, такие как нанесение кода за счет изменения показателя преломления или путем избирательного спектрального фотообесцвечивания. В случае спектрального фотообесцвечивания микроносители могут содержать один или несколько разных красителей, каждый из которых обладает особыми спектральными характеристиками, при этом один или несколько этих красителей можно обесцвечивать с разной интенсивностью.

Микроносители можно функционализировать, т.е. микроноситель может содержать один или несколько лигандов или функциональных блоков, связанных с поверхностью микроносителей. В качестве лигандов указанным микроносителям можно придать широкий спектр химических и биологических свойств. Эти свойства включают в себя все функциональные свойства, обычно используемые в высокопроизводительной технике количественного анализа и диагностики. Выбор лиганда будет зависеть от нужных анализируемых веществ. Например, лиганд может быть органическим объектом, таким как одиночная молекула или совокупность молекул. Примерами функционализации является прикрепление часто с помощью линкера к антителу или фрагменту антитела, или к олигонуклеотиду или к детектируемой метке. В некоторых вариантах микроноситель может иметь многие функциональности. Термин «функциональная единица» означает любой объект, который модифицируется, прикрепляется, является приложением или покрытием, либо ковалентно или не-ковалентно связан с поверхностью микроносителя. Термин «функционализированный» в данном описании означает любую модификацию поверхности микроносителя, ковалентно или не-ковалентно модифицированного, производного или иным образом покрытого органическим, неорганическим, органо-металлическим или композитным монослоем, многими слоями, пленкой, полимером, стеклом, керамикой, металлом, полуметаллом, полупроводником, оксидом металла, халькогенидом металла, или их сочетаниями. Несмотря на то, что функционализация может происходить обычно на внешней поверхности микроносителя, она также может иметь место на внутренних поверхностях микроносителя, как это может быть в случае пористого или полого микроносителя. Примерами анализируемых веществ-мишеней для связанных с микроносителем лигандов являются: антигены, антитела, рецепторы, гаптены, ферменты, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, лекарственные средства, гормоны, патогены, токсины или иные изучаемые химикаты или молекулы. Лиганды или функциональные единицы можно прикрепить к микроносителям средствами, обычно используемыми для прикрепления лигандов к микроносителям, включая ковалентную связь и непосредственное прикрепление или прикрепление с помощью линкера. Микроносители можно также функционализировать разными способами, позволяющими прикрепление исходного реагента к неорганической или органической функциональной группе, включая кислоты, амины, тиолы, эфиры, сложные эфиры, сложные тиоэфиры, карбаматы, амиды, тиокарбонаты, дитиокарбонаты, имины, алкены, алканы, алкины, ароматические группы, спирты, гетероциклы, цианаты, изоцианаты, нитрилы, изонитрилы, изотиоцианаты и органоцианиды, или их сочетания; любой неорганический координационный комплекс, включая, помимо прочего, 2- 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- и 9-координатные комплексы; любой органо-металлический комплекс, включая, помимо прочего, объекты, содержащие одну или несколько связей «металл-углерод», «металл-кремний» или «металл-азот».

Функциональная единица содержит съемную метку. Съемная метка является любым объектом, который можно использовать для обнаружения, идентификации, нумерации, слежения, определения местоположения, позиционной триангуляции и/или количественного определения. Эти измерения можно выполнять на основании поглощения, излучения, генерировании и/или рассеяния одного или более фотонов; поглощения, испускания, генерирования и/или рассеяния одной или более частиц; по массе, по заряду; по электрохимическим свойствам электрической емкости или иным электрохимическим свойствам; на основании электронного сродства, протонного сродства, нейтронного сродства, или по другим физическим или химическим свойствам, включая, помимо прочего, растворимость, поляризуемость, температуру плавления, температуру кипения, тройную точку, дипольный момент, магнитный момент, размер, форму, основность, изоэлектрическую точку, коэффициент диффузии или коэффициент осаждения. Такую молекулярную метку можно обнаружить или идентифицировать с помощью одного из этих свойств или комбинации этих свойств.

Настоящее изобретение также относится к способу манипулирования микроносителем для идентификации, согласно которому

а) позиционируют и ориентируют микроноситель, и

б) кодируют указанный микроноситель путем нанесения кода,

в) проводят реакцию мишени-анализируемого вещества на микроносителе или в нем,

г) позиционируют и ориентируют микроноситель и

д) идентифицируют микроноситель,

при этом этап (в) предшествует этапу (а).

Указанный способ может включать этап, согласно которому микроносители избирательно идентифицируют по имевшей место определенной реакции искомого вещества-анализируемого вещества. Например, микроносители с нужной реакцией мишени-анализируемого вещества можно отделить от остальных микроносителей, и затем можно подвергнуть этапам (г) и (д).

Согласно изобретению этап позиционирования и ориентирования является результатом физического, механического, химического или биологического взаимодействия на указанном микроносителе или вблизи него.

На этапе позиционирования и ориентирования ограничивают вращательное движение микроносителя в результате воздействия магнитного поля, прилагаемого к микроносителю.

На этапе позиционирования и ориентирования осуществляют несферическую конфигурацию микроносителя, и в частности эллипсоидную или цилиндрическую конфигурацию микроносителя.

На этапе позиционирования и ориентирования осуществляют анизотропию распределения массы микроносителя. В этом случае можно обеспечить осевое позиционирование и ориентирование как гравитационным способом, так и центрифугированием.

На этапе позиционирования и ориентирования осуществляют комбинацию упомянутых выше приемов. Например, комбинацию магнитных сил и анизотропии формы, комбинацию магнитных сил и анизотропии веса и т.д.

Этап позиционирования и ориентирования могут проводить в проточной кювете проточного цитометра. Термин «проточный цитометр» используется для любого устройства, которое создает одношеренговый поток частиц в текучей среде и измеряет флуоресценцию частиц. Образец текучей среды можно ограничить в узком проточном канале или с помощью гидродинамического фокусирования внутри оболочечной текучей среды. Например, чтобы позиционировать и ориентировать частицы в течении, можно применить принцип гидродинамического фокусирования в т.н. оболочечной проточной кювете или камере. Образец текучей среды, содержащей частицы, можно ввести в центр более быстрого окружающего течения, оболочечного течения или перед сходящимся соплом. При прохождении жидкости через схождение в область наблюдения течение образца ускоряется, вытягивается и центрируется, чтобы пройти через фокус системы наблюдения. Текучей средой может быть воздух, вода, растворитель, буферное вещество и т.п.Можно использовать разные типы проточных кювет, например, кюветы с закрытой оптической камерой, которую можно использовать для обнаружения флуоресценции, рассеяния или затухания света; сортировщики частиц, использующие проточные кюветы с открытым концом, которые разделяют поток на электрически заряженные капли, которые можно отклонять с помощью электрического поля в емкости для сортировки частиц согласно их флуоресцентному сигналу; проточные кюветы с асимметричными соплами или асимметричными ограничениями в проточной камере, чтобы ориентировать несферические частицы на оптической оси.

Этап позиционирования и ориентирования может быть осуществлен с помощью диэлектрофоретической камеры для микроносителей. Взвешенными в жидкости диэлектрическими частицами, такими как полистироловый микроноситель, можно манипулировать с помощью высокочастотного электрического поля в микроэлектродной клетке. Например, микроноситель можно ввести в специально сконструированную проточную кювету с некоторым количеством электродов. Путем изменения амплитуды, частоты и фазы полей данный микроноситель можно позиционировать и ориентировать.

Позиционирование и ориентирование микроносителей может также происходить в полужидком или жидком носителе, при этом полужидкий или жидкий носитель может иметь разную вязкость и плотность либо может состоять из двух или более полужидких или жидких слоев с разной вязкостью или плотностью. При этом микроноситель может плавать или его можно позиционировать на носителе или в носителе на границе изменения вязкости. Позиционирование и ориентирование можно изменять в соответствии с плотностью микроносителя. Отсутствие течения в указанном распределении микроносителей указывает возможность того, что средство обнаружения может быть мобильным.

Этап позиционирования и ориентирования можно также осуществить с помощью улавливания микроносителя в сильно фокусированных лазерных лучах, так называемых «лазерных щипцах». Этап позиционирования и ориентирования можно также осуществить с помощью акустических волн - ультразвуковое улавливание, когда микроноситель улавливают в стоячей волне в жидкости. «Микростанок», который обычно используют для модифицирования формы частиц с помощью ультрафиолетового лазера, можно также использовать для позиционирования и ориентирования микроносителя для этапа идентификации.

Этап позиционирования и ориентирования можно также осуществить с помощью двух или более комбинаций.

Этап кодирования можно осуществить, как указано выше при описании микроносителя. Способ кодирования можно выбрать из группы, состоящей из фотохромирования, химического травления, осаждения материала, фотообесцвечивания, или воздействия на микроноситель источником света с высокой пространственной разрешающей способностью, такого как УФ-лазер. Согласно еще одному варианту осуществления этап кодирования выполняют с помощью фотообесцвечивания.

Кодирование включает в себя нанесение кода на микроноситель, в результате чего код формируют пространственной модуляцией внутри микроносителя или на его внешней поверхности. Указанная пространственная модуляция является известным расположением конечного числа определенных объемных элементов, находящихся внутри микроносителя или на его поверхности. Пространственную модуляцию можно сформировать одним или несколькими этапами, включающими

(i) изменение одного или нескольких свойств материала в отдельном объемном элементе,

(ii) удаление материала из отдельного объемного элемента,

(iii) осаждение материала на отдельном объемном элементе, или

(iv) отдельный объемный элемент оставляют неизменным,

либо комбинации этих этапов.

Этап реакции мишени-анализируемого вещества может включать в контактирование раствора, содержащего анализируемое вещество, с составом, содержащим молекулу, частицу или материал, которые взаимодействуют с анализируемым веществом, связанным с кодированным микроносителем или с микроносителем; и может иметь этап идентификации, согласно которому определяют, произошло ли взаимодействие. Указанный этап включает в себя реакцию мишени - анализируемого вещества в отношении анализируемых веществ в газовой, паровой, полужидкой и твердой фазе.

Этап идентификации согласно изобретению выполняют любым физическим или химическим средством опроса, включая электромагнитное, магнитное, оптическое, спектрометрическое, спектроскопическое или механическое средство. Этап идентификации относится к интерпретированию информации, кодированной в микроносителе, и этот этап также может быть назван как «опросный этап» или «считывающий этап» или «дифференцирующий этап». Этап идентификации можно также выполнить с помощью идентификационных средств, включая средства визуальной проверки, цифровые камеры, видеокамеры, фотографические пленки; электрические приборы, такие как лазерные сканирующие устройства, флуорометры, люминометры, светодиоды, квантовые счетчики, устройства считывания планшетов, эпифлуоресцентные микроскопы, сканирующие микроскопы, софокусные микроскопы, капиллярные электрофорезные детекторы, или с помощью других средств усиления сигнала, таких как фотоэлектронный умножитель или иные фотоприемники, которые могут определять присутствие, местоположение, спектры интенсивности и возбуждения, поляризацию флуоресценции, продолжительность флуоресценции и прочие физические свойства флуоресцентного сигнала.

Этап идентификации осуществляют с помощью средства оптической идентификации. Коды можно считывать с помощью обычного микроскопа, если код находится на поверхности микроносителя, или если микроноситель достаточно прозрачен, то в глубине микроносителя. Коды также можно считывать с помощью софокусного микроскопа, передающего микроскопа или флуоресцентного микроскопа. В частности, коды можно считывать путем взвешивания микроносителей в водной среде, поместив микроносители между двумя предметными стеклами и наблюдая коды в микроскоп или софокусный микроскоп. Коды также можно считывать с помощью прибора сканирования лазерного луча. Считывание также можно выполнить в проточной кювете. В области проточных цитометров известны многие источники света и фотоприемники.

На этапе идентификации микроноситель можно трехмерно позиционировать в отдельных лунках таким образом, чтобы все микроносители последовательно проходили стационарный сканирующий луч средства идентификации. Скорость считывания можно повысить, если сами микроносители будут проходить через луч сканирования. В этом случае ограничивающими факторами будут время срабатывания приемника и время, нужное для алгоритма декодирования. Например, лунки можно позиционировать на диске по спирали с линейно возрастающим радиусом. Поэтому диск будет нужен только для вращения с постоянной угловой скоростью, во время которого сканер перемещается с постоянной скоростью в радиальном направлении, и микроносители будут проходить по одному через луч сканирования.

Указанный способ можно использовать для количественного анализа мишени-анализируемого вещества. Примером количественного анализа мишени-анализируемого вещества могут быть гибридизация ДНК, ферментные анализы, иммуноанализы, комбинированные химические анализы, анализы на обнаружение определенных соединений в образцах и также анализ по обнаружению и выделению соединений из этих образцов.

Данное изобретение также относится к способу кодирования микроносителя, согласно которому наносят код на микроноситель, код формируют с помощью пространственной модуляции, создаваемой внутри микроносителя или на его внешней поверхности. Пространственную модуляцию можно сформулировать как известное расположение конечного числа определенных объемных элементов, расположенных в микроносителе или на поверхности микроносителя. Известное расположение определенных объемных элементов можно сформировать (i) изменением одного или нескольких свойств материала в отдельном объемном элемента, (ii) путем удаления материала из отдельного объемного элемента, (iii) путем размещения материала на отдельном объемном элементе, (iv) оставляя отдельный объемный элемент неизменным, либо сочетанием указанных выше приемов.

Настоящее изобретение также касается кодированного микроносителя, который получают согласно описываемому выше способу, при этом код формируют на указанном кодированном микроносителе с помощью пространственной модуляции, создаваемой внутри микроносителя или на его внешней поверхности. Согласно одному из вариантов осуществления пространственную модуляцию можно сформулировать как известное расположение конечного числа определенных объемных элементов, расположенных в микроносителе или на поверхности микроносителя. Известное расположение определенных объемных элементов можно сформировать (i) изменением одного или нескольких свойств материала в отдельном объемном элементе, (ii) путем удаления материала из отдельного объемного элемента, (iii) путем размещения материала на отдельном объемном элементе, (iv) оставляя отдельный объемный элемент неизменным, либо сочетанием указанных выше приемов.

Настоящее изобретение также относится к использованию микроносителя в высокопроизводительном тестировании, т.е. обнаружении присутствия или отсутствия одного или анализируемых веществ-мишеней в образце. Тестирование включает контактирование связанного с микроносителем лиганда по меньшей мере с одним анализируемым веществом, обнаружение факта реагирования анализируемого вещества или его связи с лигандом, и считывание кода микроносителя, при котором произошло реагирование или связывание, причем анализ включает выбор одного или более лигандов, которые связываются или реагируют с одним или более анализируемых веществ, связывание лигандов с совокупностью микроносителей, соотнесение идентичности лигандов с кодами на микроносителях, с которыми связаны лиганды, контактирование одного или более анализируемых веществ с микроносителями, связанными лигандами, наблюдение микроносителей, на которых анализируемое вещество стало связанным или прореагировало с лигандом, связанным с микроносителем, и считывание кодов на микроносителях, чтобы идентифицировать лиганды, с которыми прореагировали одно или более анализируемых веществ, определяя присутствие или отсутствие одного или более анализируемых веществ. Указанное высокопроизводительное тестирование-количественный анализ с помощью кодированных микроносителей можно проводить в воде, растворителе, в буферном веществе или в любой биологической текучей среде, включая выделенные или отфильтрованные биологические жидкости, такие как моча, цереброспинальная жидкость, плевральный выпот, синовиальная жидкость, брюшинная жидкость, околоплодные воды, желудочный сок, кровь, сыворотка, плазма, лимфатическая жидкость, тканевая жидкость, тканевый гомогенат, клеточные экстракты, слюна, мокрота, стул, физиологические выделения, слезы, слизь, пот, молоко, семя, влагалищный секрет, жидкость из язв и других поверхностных нарушений, волдырей, воспалений, и вытяжки тканей, включая биопсию нормальных, злокачественных или подозрительных тканей, или любых других составляющих организма, которые могут содержать искомое анализируемое вещество. Другие аналогичные образцы, такие как клеточные или тканевые культуры, или питательная среда также могут представлять интерес. Либо образец можно получить из такого источника окружающей среды, как почва, вода или воздух, или из промышленного источника, взятого из потока отходов, источника водоснабжения, линии водоснабжения, или из партии продукции. Промышленные источники включают в себя ферментационную среду, такую как биореактор или такой процесс пищевой ферментации как пивоварение; или продовольствие, такое как мясо, дичь или молочная продукция. Проверочный образец можно предварительно обработать до применения, например, приготовить плазму из крови, разбавить вязкие жидкости. При этом способы обработки могут включать фильтрацию, дистиллирование, концентрирование, нейтрализацию соединений, являющихся помехой, или введение реагентов.

Данное изобретение также включает отчет, содержащий сведения, полученные в результате описанных выше высокопроизводительных количественных анализов.

Настоящее изобретение также относится к способу приготовления кодированного микроносителя, содержащему этап нанесения кода на микроноситель. Примерами способов нанесения указанных кодов являются фотохромирование, химическое травление, осаждение материала, фотообесцвечивание или воздействие на микроноситель со стороны источника света с высокой пространственной разрешающей способностью. Код наносят с помощью фотохромирования или фотообесцвечиванием.

Настоящее изобретение относится также к компьютеру для контролирования высокопроизводительного количественного анализа мишени-анализируемого вещества с помощью описываемого здесь микроносителя, компьютер соединен с описываемым выше устройством.

Настоящее изобретение относится также к устройству для высокопроизводительного количественного анализа мишени-анализируемого вещества, содержащему компьютер для контролирования указанного количественного анализа. Устройство содержит микроматрицу и средство идентификации. Примерами средства идентификации являются оптические, электронные, физические, химические и магнитные средства. Микроматрица обычно содержит некоторую совокупность разных компонентов. Теоретически нужен только один компонент, но их число может доходить до 10⁵. Хотя число компонентов обычно не превышает 10⁵, число используемых отдельно кодированных микроносителей может быть существенно большим.

Кодированные микроносители к микроматрице могут располагаться дорожками. Для определения местоположений можно использовать заголовки, чтобы можно было быстро обнаруживать определенные взаимодействия. В частности, диски имеют круговые дорожки с заголовками, определяющими местоположения на дорожках, и поэтому положительные сигналы можно интерпретировать в отношении информации, предоставляемой заголовком. Круговые дорожки предпочтительно являются концентрическими и могут иметь поперечное сечение порядка от 5 до 5000 мкм, или, например, от 100 до 1000 мкм, или от 500 до 2000 мкм. Возможны разные модификации, такие как заранее подготовленные сегменты, которые можно прикрепить затем к диску для анализа.

Краткое описание чертежей

Преимущества настоящего изобретения будут более понятны из приводимого ниже описания со ссылками на сопровождающие чертежи, на которых:

Фиг.1 изображает сферический микроноситель с магнитным дипольным моментом, возникающим из магнитного материала внутри. Магнитное поле, обусловленное катушками, удерживает микроноситель на месте и одновременно его ориентирует. Если магнитный материал поместить вне центра микроносителя, то получается полная трехмерная ориентация по причине гравитационного и магнитного воздействия;

Фиг.2 - сферические микроносители с магнитным дипольным моментом, переносимые текучей средой, проходящей по капилляру со скоростью v. Обеспечивают две катушки, чтобы создавать магнитное поле параллельно капилляру. Вне магнитного поля носители будут вращаться из-за трения текучей среды. Внутри катушек магнитное поле будет выравнивать дипольный момент поперек себя, тем самым устраняя вращение в направлении перемещения частицы,

Фиг.3 - схематическое изображение капиллярной системы, используемой для изучения позиционирования микроносителей, переносимых ламинарным течением внутри капилляра, полученное с помощью софокусного микроскопа,

Фиг.4 - софокусное изображение с одной частицей, идущей внутри капилляра. Стрелка вправо показывает внутренний размер капилляра - 80 мкм. Капилляр и вода полностью темные, поскольку они не испускают флуоресцентный свет. Обзор: 0,92×0,10 мм. Одна частица видна как три отдельные линии, а не диск - по причине скорости частиц и конкретного способа получения софокусного изображения;

Фиг.5 - составное изображение всех отдельных изображений одного временного ряда: изображены все частицы, прошедшие этот временной интервал (давление - ок. 0,05 атм). Ясно, что все частицы двигаются по одной прямой линии на постоянном расстоянии от стенки (но не в центре) капилляра. Из Фиг.5 следует, что частицы действительно имеют определенное местоположение при их транспортировании ламинарным потоком по капилляру (давление ок. 0,05 атм, в данном случае - плюс/минус 15%). Частицы следуют по одной прямой линии на постоянном расстоянии от капиллярной стенки (линия выглядит наклонной, поскольку сам капилляр расположен таким образом в поле зрения).

Фиг.6 - составное изображение с тем же позиционированием при повышенном давлении (около 0,1 атм);

Фиг.7 - составное изображение с тем же позиционированием при повышенном давлении (ок. 0,15 атм). Единственное различие между Фиг.5, 6 и 7 - прилагаемое давление (ок. 0,05; 0,1 и 0,15 атм соответственно) и, поэтому - также и скорость текучей среды. Позиционирование действительно также и при повышенных давлениях;

Фиг.8 - софокусное изображение верха зеленой флуоресцентной 40-мкм микросферы с покрытием из ферромагнитных частиц CrO₂;

Фиг.9 - софокусное изображение центральной плоскости 40-мкм зеленых флуоресцентных частиц с ферромагнитным покрытием;

Фиг.10 - софокусное изображение простого рисунка, который был обесцвечен на центральной плоскости частицы с ферромагнитным покрытием;

Фиг.11 - 28-мкм фотохромной микросферы (перед УФ-освещением) с красным светом в режиме передачи света. Микроскоп сфокусирован на центральной плоскости;

Фиг.12 - передачу микросферы после фотохромирования 3-мкм квадрата в указанной микросфере;

Фиг.13 иллюстрирует изображение передачи полностью окрашенной и прозрачной микросферы;

Фиг.14 - софокусное изображение трех «пунктир-кодовых» микросфер (слева) и нормализованный профиль интенсивности, измеренный по среднему коду (справа). Каждое деление по осям изображения составляет 2 мкм;

Фиг.15 - софокусное изображение фотообесцвеченной микросферы в ДМСО (слева). Второе изображение справа было взято через три часа;

Фиг.16 - схематическое представление ферромагнитных микроносителей в носителе, состоящей из двух жидкостей или полужидкостей разной плотности. Обеспечены две катушки, которые могут создавать магнитное поле. Внутри катушек магнитное поле будет выравнивать дипольный момент поперек себя, тем самым, позиционируя и ориентируя микроноситель определенным образом;

Фиг.17 схематически изображает устройство, содержащее Софокусный Лазерный Сканирующий Микроскоп (СЛСМ), соединенный с мощным лазером, совместно с быстродействующим оптическим переключателем. В качестве источника света используется ионный лазер Spectra Physics Stabilite 2017, настроенный на единственную волну, напр. 488 нм. АОМ обусловливает дифракцию лазерного света на несколько лучей. Луч первого порядка затем пускают по оптическому волокну. АОМом управляет компьютер и специальное программное обеспечение для переключения интенсивности луча первого порядка между двумя уровнями: слабый луч создания изображения и сильный луч обесцвечивания. Конец волокна соединен с «двойной волоконной муфтой», в результате чего свет, выходящий из волокна, можно скомбинировать со светом от другого лазера (но он не используется в экспериментах, связанных с обесцвечиванием). Наконец, свет входит в СЛСМ и фокусируется на образце. Рисунок обесцвечивания можно задать в специальном программном обеспечении. При взятии изображения путем сканирования лазерного луча в растре: специальное программное обеспечение управляет оптическим переключателем таким образом, что свет низкомощного и высокомощного лазеров доходит до образца согласно заданному рисунку;

Фиг.18 - софокусное изображение обесцвеченного штрих-кода, использующего три ширины и два уровня интенсивности, в центральной плоскости полистироловой флуоресцентной микросферы размером 45 мкм;

Фиг.19 - софокусное изображение обесцвеченного штрих-кода, использующего 8 разных уровней интенсивности, на центральной плоскости полистироловой флуоресцентной микросферы (справа) и нормализованный профиль интенсивности, измеренный по среднему коду (справа);

Фиг.20 - два софокусных изображения микросфер, в которых обесцвечены штрих-коды разной геометрии, напр. буквы или цифры;

Фиг.21 - изображения 40-мкм ферромагнитных флуоресцентных гранул, протекающих в проточной кювете;

Фиг.22 - цилиндрически симметричная гранула, на которой коды нанесены в круге вокруг оси Z', с контрольным рисунком, который указывает начало кода;

Фиг.23 - сферическая гранула, в которой разряды кода нанесены по оси симметрии указанной гранулы;

Фиг.24 - магнитные гранулы, проходящие по капилляру и проходящие через фокус лазерного луча. Катушки, по которым проходит электрический ток, создают магнитное поле и ориентируют гранулы вдоль направления движения;

Фиг.25 - пример схемы кодирования с использованием 4 разных интенсивностей, при этом каждая интенсивность представлена цветом и номером от 0 до 3. Эта схема кодирования имеет 28 знаков, символически представленных 26 буквами латинского алфавита и двумя дополнительными знаками пунктуации. Каждый знак состоит из 4 кодирующих элементов (т.е. 4 возможные плотности (или цвета)), при том дополнительном условии, что два одинаковых элемента не могут следовать друг за другом, даже когда два знака находятся рядом друг с другом;

Фиг.26 - капилляр, окруженный катушкой, генерирующей переменное магнитное поле В, и гранула, содержащая закрытый проводник с индуцированным магнитным полем В', которое параллельно, когда магнитное поле В возрастает;

Фиг.27 - гранула, содержащая закрытый проводник, идущая в капилляре, который расположен между двумя магнитными пластинами и к которому прилагают магнитное поле перпендикулярно направлению течения;

Фиг.28 - схематическое изображение на экспериментальной установке: емкость со взвесью ферромагнитных зеленых микросфер помещена на софокусный микроскоп Bio-Rad MRC1024, соединенный с инвертированным микроскопом, в результате чего можно использовать водопогружной объектив Nikon 60x для рассмотрения гранул снизу предметного стекла микроскопа. Микросферы освещались 488-нм лазерным лучом. Микроскопы были ориентированы внешним магнитным полем В, сформированным сильным постоянным магнитом, установленным на расстоянии 20 см от емкости;

Фиг.29 - изображения ферромагнитных микросфер, где стрелка была обесцвечена на центральной плоскости указанной микросферы. В изображении (а) микросфера была ориентирована во внешнем магнитном поле магнита. В изображениях (b-i) микросфера была ориентирована во втором движущемся внешнем магнитном поле. В изображениях (j-l) микросфера была повернута в первоначальную ориентацию после удаления второго магнита;

Фиг.30 представляет ферромагнитную микросферу, где стрелка была обесцвечена на центральной плоскости указанной микросферы. В изображении (а) микросфера была ориентирована во внешнем магнитном поле магнита. В изображениях (b-j) этот же магнит был использован для вращения микросферы на 360^о вокруг емкости, и был возвращен в свое точное исходное положение. Изображение j показывает, что микросфера не вернулась свое исходное положение по причине относительно сильного взаимодействия между полимером и стеклом. В изображениях (k-l) микросфера была ослаблена за счет того, что второй магнит быстро переместили вблизи емкости, и она немедленно вернулась в свою первоначальную ориентацию;

Фиг.31 - Чертежи (a, b, i, j) схематически изображают поле зрения микроносителя перед объективом микроскопа. Чертежи (a, i) изображают поле зрения перед тем, как микроноситель входит в фокусированный лазерный луч для считывания/нанесения кода. Чертежи (b, j) изображают поле зрения микроносителя в положении фокуса. Чертежи (c, d, e, f, g, h) представляют боковую проекцию объектива микроскопа, помещенного перед проточной кюветой. Чертеж (с) изображает случай, когда фокус лазерного луча считывания/записи производит сканирование по оси симметрии. Чертеж (f) иллюстрирует случай, когда фокус лазерного луча считывания/записи производит сканирование под осью симметрии микроносителя. Чертеж (d, g) представляет случай, когда вспомогательный лазерный луч освещает микроноситель и производит эффект затенения на другой стороне указанного микроносителя.

Описание предпочтительных вариантов воплощения изобретения.

1. Примеры позиционирования и ориентирования микроносителя с использованием твердого носителя.

Ниже приводится раскрытие двух предпочтительных осуществлений позиционирования и ориентирования микроносителя с использованием описываемых выше предпочтительных микроносителей. Во-первых, микроносители помещают на твердый носитель и транспортируют их на нем; и во втором предпочтительном осуществлении микроносители транспортируют с помощью течения текучей среды или полутвердой среды.

Твердый носитель имеет лунки, форма которых соответствует вхождению в них микроносителя только определенным или ограниченным образом, таким образом обеспечивая определенную ориентацию. Лунки могут быть магнитными, чтобы удерживать на месте магнитный микроноситель и ориентировать его определенным образом. Одна конфигурация в качестве примера приводится на Фиг.1. Прочими возможностями являются химические и/или биологические взаимодействия между твердым носителем или микроносителем.

Лунки в носителе можно также обеспечить вакуумными каналами, чтобы удерживать на месте микроносители. Носитель может быть плоским и магнитно/электрически заряженным, только в случае, когда необходимо собрать магнитные/заряженные микроносители. Микроноситель может быть комбинацией упоминаемых выше возможностей. Упоминаемые выше лунки можно упорядочить в определенном порядке на твердом носителе, например в один ряд, в двухмерном порядке, по спирали, концентрическими кругами и т.п.

Лунки могут также иметь несферическую конфигурацию, напр. коническую или эллипсоидную, чтобы несферические микроносители можно было поместить в лунках в определенной ориентации.

2. Примеры позиционирования и ориентирования микроносителя с помощью таких средств транспортирования, как поток текучей среды.

Микроноситель можно транспортировать текучей средой, протекающей в канале, напр. в капилляре. В литературе теоретически показано на двухмерных компьютерных моделях, что сферическая или эллипсоидная частица будет позиционирована на определенной глубине при протекании по каналу. Также теоретически показано, что эллипсоидная частица будет иметь точное ориентирование в зависимости от конкретных обстоятельств. Например, возможно, что эллипсоидная частица правой эллиптичности, протекающая в капилляре с правым диаметром, будет позиционирована на или вблизи центральной линии, при этом ее самая длинная ось будет параллельна течению. Таким образом, единственной остающейся свободой движения является вращение вокруг ее самой длинной оси.

Далее приводится подробное пояснение предпочтительного осуществления способа, согласно которому это позиционирование и ориентирование получают при течении текучей среды.

Если эллипсоидная частица дополнительно имеет дипольный момент, перпендикулярный ее самой длинной оси, то свободу вращения вокруг этой оси можно также устранить путем приложения электрического или магнитного поля перпендикулярно направлению течения.

Если сферический микроноситель транспортируют в текучей среде, то он обычно будет вращаться. Это вращение можно устранить с помощью микроносителей с магнитным или электрическим дипольным моментом и за счет приложения соответствующего магнитного/электрического поля. Это иллюстрировано на Фиг.2. Сферические микроносители с магнитным дипольным моментом транспортируют текучей средой по капилляру. По причине этого движения относительно течения вращающая сила будет воздействовать на носитель. Когда носители проходят через область между двумя катушками, сила вращения будет компенсироваться магнитной силой, воздействующей на дипольный момент и будет позиционировать микроноситель согласно изображению на этой Фиг. (дипольный момент поперек магнитного поля В). Этот сферический микроноситель позиционируется течением и ориентируется с помощью магнитного поля, оставляя только вращательную свободу вокруг его дипольной оси.

Описываемые выше ситуации можно дополнить асимметричным распределением массы, чтобы устранить последнюю степень свободы вращения - с помощью гравитационного или центробежного усилия.

Экспериментальное исследование позиционирования сферических микроносителей, текущих в текучей среде, например в воде, по капиллярной трубке

Авторы изучили движение частиц в ламинарном течении внутри капилляра с помощью софокусного микроскопа в качестве средства обнаружения.

Были использованы сферические флуоресцентно меченые полистироловые микрочастицы (в первой экспериментальной части, не магнитной) диаметром 15 мкм, взвешенные в дистиллированной воде; и при отображении их с помощью софокусного микроскопа, их легко можно было наблюдать.

Была выполнена капиллярная система и помещена на софокусный микроскоп. Сам капилляр был выполнен из стекла, и имел квадратную форму. Его внутренние размеры: 80×80 мкм; наружные размеры: 180×180 мкм. Эта система схематически изображена на Фиг.3. Капилляр на обоих концах соединен с емкостью. В этот резервуар можно было ввести взвешенные микрочастицы. Постоянное давление можно прилагать к емкости, тем самым, создавая течение взвеси в другую сторону. Низкое давление (менее 0,2 атм) предпочтительно для создания ламинарного потока в капилляре.

Частицы отображают при прохождении их мимо объектива сканирующего лазерного софокусного микроскопа. В этом первом эксперименте объектив имел кадровое окно 0,45 и десятикратное увеличение. Этот объектив был использован для обеспечения широкого поля зрения.

Во время течения частиц изображения брали через определенные промежутки времени, обычно около минуты, тем самым обеспечивая временной ряд. Затем эти изображения суммировали в одно изображение, показывающее все частицы, прошедшие в этот временной интервал. Таким образом, можно определить, протекают ли микроносители по одному и тому же маршруту.

Эти эксперименты показывают, что частицы действительно позиционируются по постоянному маршруту при транспортировании ламинарным течением внутри капилляра - согласно прогнозу двухмерного компьютерного моделирования. Разумеется, необходима дальнейшая проверка при более высокой разрешающей способности, чтобы изучить величину возможных колебаний. Последующие эксперименты необходимы для наблюдения последствий изменения размера частиц.

В еще одном эксперименте микроносители с магнитным дипольным моментом были использованы в описываемой выше установке, и магнитное поле В прилагалось к транспортируемым микроносителям через две катушки в конфигурации Гельмгольца (Фиг.3). Магнитное поле проходит параллельно капиллярной трубке. Ограничение вращения наблюдалось согласно пояснению в отношении Фиг.2.

Эти эксперименты доказывают, что способ согласно данному изобретению может обеспечить определенное положение микроносителя, используемого в целях идентификации.

3. Примеры магнитных микроносителей.

Были использованы зеленые флуоресцентные 40-мкм микросферы с ферромагнитным покрытием (CrO₂). Ферромагнитные микросферы или микроносители являются первыми кандидатами для получения правильного ориентирования в течении текучей среды при использовании внешнего магнитного поля, параллельного течению - согласно приводимому выше объяснению. Этот эксперимент определяет, достаточно ли указанные микроносители прозрачны, чтобы "видеть" центральную плоскость и наносить рисунки внутри с помощью, например, фотообесцвечивания.

В этом эксперименте ферромагнитные частицы были введены во взвесь в деионизированной воде, помещены на предметное стекло микроскопа и накрыты покровным стеклом. Затем частицы были отображены с помощью софокусного УФ-микроскопа Bio-Rad MRC1024. Был использован водопогружной объектив Nikon Plan Apochromat 60x N.A. 1.4. Источником света для возбуждения зеленых флуоресцентных микросфер был аргоновый-ионный лазер Spectra Physics Stabilite 2017, настроенный на волну 488 нм.

Фиг.8 изображает софокусное изображение, сфокусированное наверху микросферы с ферромагнитным покрытием. Видно, что покрытие состоит из слоя субмикронных частиц CrO₂, осажденных на поверхность микросфер. Поскольку частицы CrO₂ не являются флуоресцентными и прозрачными, то они обнаруживаются как темные точки на светлом флуоресцентном фоне.

Для оценки прозрачности микросфер с покрытием из ферромагнитных частиц было взято софокусное изображение центральной плоскости некоторых микросфер (Фиг.9). Центральная плоскость была отображена очень ясно, указывая, что имеющие покрытие микросферы были все еще прозрачными. По сравнению с микросферами без покрытия зарегистрированный флуоресцентный сигнал был менее однородным на протяжении центральной плоскости.

Затем была сделана оценка кодирования, выполненного фотообесцвечиванием микросфер с ферромагнитным покрытием. Микроскоп был сфокусирован на центральной плоскости имеющей покрытие микросферы, и обесцвечивающий рисунок в виде основных геометрических форм был выполнен с помощью специального программного обеспечения, составленного для экспериментов обесцвечивания. Сила света составляла ок. 20 мВ. Геометрия рисунка обесцвечивания не имела значения в этом эксперименте, т.к. цель эксперимента заключалась только в проверке следующего: можно ли все еще обесцветить имеющие покрытие частицы. Фиг.10 демонстрирует, что рисунок можно было легко нанести внутри имеющей покрытие микросферы.

В заключение, зеленые флуоресцентные 40-мкм полистироловые микросферы были покрыты ферромагнитными частицами CrO₂. Несмотря на непрозрачность этих ферромагнитных частиц микросферы с покрытием оказались все же прозрачными. Зарегистрированная флуоресценция была менее однородной по сравнению с частицами без покрытия, поскольку ферромагнитные частицы на поверхности микросфер блокировали часть траектории света. Но концентрацию ферромагнитных частиц можно было изменить, тем самым, улучшив однородность зарегистрированной флуоресценции. Минимальную концентрацию можно было определить по магнитной силе, нужной для ориентирования микроносителей, текущих через указанное позиционирующее устройство. Ферромагнитные микросферы легко кодировались обесцвечиванием в виде некоторого рисунка на центральной плоскости.

4. Примеры фотохромных микроносителей

Альтернативой кодирования фотообесцвечиванием является кодирование с помощью фотохромирования. Полистироловые микросферы были нагружены фотохромным соединением 1,2-бис(2-метокси-5-фенил-3-тиэнил)перфторциклопентен (Extraordinary Low Cycloreversion Quantuim Yields of Photochromic Diarylethenes with Methoxy Substituents, Shibata K., Kobatake S., Irie M., Chem. Lett. (2001), vol. 7, 618-619), которое первоначально не имеет поглощения в видимом диапазоне, но проявляет полосу поглощения в полосе от 450 нм до 750 нм, приблизительно, при ультрафиолетовом освещении, с максимальным поглощением при значении около 600 нм. Следовательно, нагруженные микросферы были первоначально прозрачными и стали синими при ультрафиолетовом освещении.

Кодирование микросферы фотохромированием считается альтернативой кодированию с помощью фотообесцвечивания в основном по той причине, что оно облегчает считывание кода, при этом налагая менее строгие ограничения в отношении точности позиционирования позиционирующего устройства. Фактически, при использовании обесцвеченного кода мы получаем полностью флуоресцентный микроноситель, в котором только небольшой участок не имеет сигнала. Следовательно, для идентификации указанной кодированной микросферы требуется использование софокусного микроскопа и также требуется точное фокусирование на той плоскости, на которой был обесцвечен код. При кодировании фотохромированием мы получаем полностью прозрачный микроноситель с нанесенным цветным рисунком. Его гораздо легче обнаружить, и поэтому нет необходимости в применении софокусного микроскопа, достаточным будет обычный световой микроскоп. При этом при использовании одинаковой лазерной мощности способ фотохромирования более быстрый, чем фотообесцвечивание.

В этом примере полистироловые микросферы нагружались фотохромным соединением. Затем делалась первая попытка нанести рисунок внутри фотохромных микросфер.

Все эксперименты выполнялись в условиях темного помещения. Ненагруженные прозрачные 28-мкм полистироловые микросферы (5% степень сшивания) были нагружены фотохромным соединением 1,2-бис(2-метокси-5-фенил-3-тиэнил)перфторциклопентена. Сначала 5 мг сухих микросфер были превращены в взвесь в 2%(вес./об.) растворе фотохромного соединения в СН₂Cl₂ и были оставлены на сутки. Взвесь затем центрифугировали в течение 5 мин при скорости 12000 об./мин. После центрифугирования плавающие сферы были выделены путем удаления жидкости-основы. Сферы затем превратили во взвесь в дионизированной воде и нанесли на предметное стекло микроскопа для наблюдения под микроскопом.

Устройство микроскопа излагается в примере 3. Лазер Coherent Enterprise был также использован для окрашивания микросфер (357 нм УФ-линии), и 647-нм линия аргоно-криптонового лазера Bio-Rad была использована для отображения микросфер. Красный свет использовался по причине его поглощения синими областями, что дало серое изображение, где синие участки темные, а прозрачные области - светлые. Изображения регистрировались в режиме передачи света с помощью фотоприемника передачи.

Для конструирования рисунка кодирования частичная область микросферы была сканирована УФ-светом путем приближения к этому участку и путем выполнения обычного сканирования изображения. В результате этого был получен нанесенный квадрат (см. ниже). Фиг.11 изображает 28-мкм фотохромную микросферу, отображаемую в режиме передачи света с помощью красной лазерной линии (647 нм). На этом этапе микросферу подвергали воздействию УФ-света. Затемнение по краям было обусловлено линзовыми эффектами сферических микросфер (показатель преломления - 1,59), взвешенных в воде (показатель преломления - 1,33).

После увеличения небольшой области (3×3 мкм) центральной плоскости микросферы сканирование делалось с помощью 357-нм УФ-линии при 0,5 мВ. Изображение затем было взято с красной лазерной линией (Фиг.12). Был ясно виден темный квадрат, указывая, что микросферы были успешно нагружены фотохромным красителем, который превратился в синий при освещении ультрафиолетовым излучением. Синий квадрат передает только 50% красного света по сравнению с прозрачным окружением. Согласно Фиг.12 при УФ-освещении микросфера становилась темнее, чем до УФ-освещения (Фиг.11). Для сравнения: Фиг.13 изображает две микросферы, из которых одна полностью окрашена (темная сфера) после УФ-освещения, и вторую, которая не подвергалась воздействию УФ-света.

В заключение, микросферы были успешно нагружены фотохромным соединением. Для окрашивания указанных микросфер требовалась меньшая лазерная мощность (˜40х) по сравнению с фотообесцвечиванием. Преимущество этого способа кодирования заключается в том, что коды можно считывать быстрее.

5. Примеры флуоресцентных микроносителей

Согласно одному из осуществлений устройства позиционирования и ориентирования микроносители транспортируют течением текучей среды, и они проходят через записывающий луч только однократно и только в одном направлении. Поэтому предпочтительным кодом является одномерный «пунктир-код», а не штрих-код (который также одномерный, но наносится в двух измерениях). Этот эксперимент определяет, можно ли записать этот «пунктир-код» с помощью фотообесцвечивания на центральной плоскости 40-мкм микросферы и проверить, достаточно ли быстрым является способ обесцвечивания, чтобы можно было нанести код только однократным сканированием.

В этом эксперименте были использованы 28-мкм полистироловые микросферы (5% степень сшивания), нагруженные быстро обесцвечивающимся зеленым флуоресцентным красителем NODD (N-(7-нитробенз-2-окса-1.3-диазол-4-ил)диэтиламин.

Для моделирования течения микросферы мимо записывающего луча микросферу позиционировали под софокусным микроскопом, который был сфокусирован на центральной плоскости указанной микросферы. Затем прибор был установлен для сканирования только одной линии на сфере, тем самым моделируя позиционируемую микросферу, проходящую мимо стационарного записывающего луча. С помощью специализированных средств программного обеспечения прибор запрограммировали на включение и выключение лазерной мощности два раза во время линейного сканирования, чтобы получить «пунктир-код».

Сканируемая линия состоит из 512 элементов изображения, и в этом эксперименте 1 элемент изображения соответствует 0,038 мкм. Одно сканирование строки занимает 1,2 мсек, что означает скорость сканирования, равную 16,35 мкм/мсек. Этот эксперимент моделирует ситуацию, когда микросфера протекает мимо стационарного записывающего луча на скорости 16,35 мкм/сек или максимально - 584 сферы (27 мкм) в секунду. С помощью специального программного обеспечения прибор был запрограммирован на переключение лазера 5 раз до 20 мВ (в образце) в течение 8 элементов изображения (т.е. 0,304 мкм) и 80 элементов изображения между каждой вспышкой. Был получен код, состоящий из пяти точек через каждые 3,04 мкм. Результат изображен на Фиг.14 в виде пунктирной линии в середине микросферы. В применявшихся условиях было получено обесцвечивание около 55%. Верхняя и нижняя линии были получены путем обесцвечивания соответственно 40 и 16 элементов изображения, что дало уровень обесцвечивания, равный 80% и 70%.

В заключение, лазерная мощность, равная 20 мВ, была достаточной, чтобы создать «пуктир-код» в центральной плоскости нагруженной NODD-веществом микросферы с уровнем обесцвечивания свыше 50%. Скорость сканирования составляла 16,35 мкм/мсек. Этот эксперимент демонстрирует осуществимость кодирования пунктир-кода путем фотообесцвечивания с помощью одного линейного сканирования. Также возможно увеличить скорость сканирования и обеспечить тот же объем обесцвечивания путем увеличения лазерной мощности в образце.

Следующий этап эксперимента заключался в проверке стабильности обесцвеченного кода внутри флуоресцентного микроносителя в условиях растворителя, конкретно - когда микроносители взвешены в растворе ДМСО (диметилсульфоксид).

Были использованы 28-мкм микросферы, нагруженные NODD предыдущего эксперимента. Сначала они были приведены в состояние взвеси в деионизированной воде, затем капля этой взвеси была нанесена на покрывное стекло микроскопа и высушена на воздухе, оставив на покрывном стекле сферы. Микросферы затем были покрыты каплей ДМСО (более 99,7%) и помещены под софокусный микроскоп.

Простой рисунок был обесцвечен на центральной плоскости микросферы, и был отображен снова после трех часов - для проверки наличия какого-либо отличия флуоресценции микросферы или обесцвеченного рисунка. Софокусный микроскоп был сфокусирован на центральной плоскости микросферы, окруженной ДМСО. Был обесцвечен простой рисунок, состоящий из трех линий. После трех часов рисунок был отображен снова. Результаты показаны на Фиг.15. Ни во флуоресценции, ни в обесцвеченном рисунке какую-либо разницу обнаружить не удалось. Левое изображение было менее резким по причине незначительной расфокусировки на рисунке.

Ни во флуоресценции, ни в обесцвеченном рисунке какую-либо разницу обнаружить не удалось после нахождения во взвеси 99,7% ДМСО в течение трех часов. Это свидетельствует о высокой стабильности нанесенного рисунка независимо от условий анализа.

6. Примеры позиционирования и ориентирования микроносителя в жидком или полужидком носителе.

Фиг.16 представляет микроносители, позиционированные в полужидком или жидком носителе, при этом полужидкий или жидкий носитель состоит из двух полужидких или жидких веществ с разной плотностью. Микроноситель позиционировали на границе двух веществ. Обеспечивали две катушки, которые создавали магнитное поле. Внутри катушек магнитное поле будет выравнивать дипольный момент поперек себя, тем самым определенным образом ориентируя микроноситель, за счет этого облегчая детектирование кодов. Отсутствие течения в указанном распределении микроносителей приводит к возможности мобильности средства детектирования.

7. Примеры разных типов кодов.

Для выполнения количественных анализов на гранулах с очень большим числом соединений или молекул для обнаружения лекарственного средства или тестирования на наличие лекарственных средств требуется мечение каждого из микроносителей в соответствии с определенным лигандом, связанным с их поверхностью. Это позволяет последующее смешивание особо кодированных микроносителей и одновременное их анализирование. Коды этих микроносителей, которые выказывают благоприятную искомую реакцию между приданным лигандом и мишенью-анализируемым веществом, можно затем считать, тем самым - идентифицировать лиганд, давший благоприятную реакцию. Здесь имеется два разных способа кодирования микроносителей, и это обеспечивает практически неограниченное количество особых кодов.

Фотообесцвечивание. Согласно первому способу рисунок наносят на однородно флуоресцентно окрашенный микроноситель с помощью фотообесцвечивания. Это - осуществляемый светом способ, в котором флуоресцентные молекулы теряют свои флуоресцентные свойства, в результате чего тускнеет цвет. Это можно выполнить, во-первых, фокусированием СЛСМ на определенной глубине в микроносителе, на которой нужно нанести рисунок, созданный специальным программным обеспечением. СЛСМ модифицируют за счет того, что обеспечивают его быстродействующим оптическим переключателем, который управляет мощностью лазерного света, поступающего в микроноситель. Низкую мощность используют только для создания изображения, а высокую мощность - для быстрого обесцвечивания. Компоновка устройства схематически изображена на Фиг.17.

При взятии изображения, что делается сканированием лазерного света в растровом рисунке, специальное программное обеспечение управляет оптическим переключателем таким образом, что мало- и высокомощный лазерный свет входит в микросферу в соответствии с заданным рисунком. Поскольку флуоресцентные молекулы практически неподвижны в матрице микроносителей, поэтому обесцвеченные области останутся, в результате чего обеспечивается светлый фон и более темный постоянно обесцвеченный рисунок. Фиг.18 изображает софокусное изображение обесцвеченного штрих-кода, который использует три ширины и два уровня интенсивности, в центральной плоскости 45-мкм полистироловой флуоресцентной микросферы. Фиг.19 изображает софокусное изображение обесцвеченного штрих-кода, с использованием 8 разных уровней интенсивности, на центральной плоскости полистироловой флуоресцентной микросферы (справа) и нормализованный профиль интенсивности, измеренный по среднему коду (справа).

Второй способ использует ту же методику за тем исключением, что процесс фотохромирования используют вместо фотообесцвечивания. В этом способе микроносители однородно окрашивают фотохромным соединением, которое изменяет цвет под излучением света соответствующей длины волны. Например, микроносители могут быть первоначально бесцветными и прозрачными, но будут иметь внутри окрашенный рисунок на определенной глубине после облучения, сделанного по существу тем же прибором, который описывается выше.

Количество кодов зависит от нескольких факторов: разрешающая способность пишущего луча, используемые уровни интенсивности, имеющееся место на микроносителе, габариты конфигурации кода и пр. Например, с помощью объектива 6xNA1.4 мы доказали, что можно создать по меньшей мере 263×106 разных кодов по длине только 16 мкм только с помощью одномерного кода, использующего две разные ширины и 4 уровня интенсивности (результаты не изображены). Этот код легко считывается в центральной плоскости 30-мкм микросферы. Можно создать еще большее число кодов, если, напр., использовать более крупные микросферы, или если конфигурация кода имеет два или три пространственных измерения. Примеры изображены на Фиг.20, где штрих-коды разной геометрии, напр. буквы или цифры, были обесцвечены на двух микросферах. Поэтому можно утверждать, что число формируемых этой методикой кодов практически неограниченное.

8. Экспериментальное исследование позиционирования и ориентирования ферромагнитных флуоресцентных гранул, текущих в текучей среде в проточной кювете.

В этом примере 40-мкм ферромагнитные флуоресцентные гранулы текли в проточной кювете. Скорость течения составляла около 6 м/сек. Давление было в пределах значений от 0,30 до 0,24 бар. Изображения указанных гранул даны на Фиг.21. Источник света для возбуждения флуоресцентных гранул был лазером, настроенным на 488-нм линию. Использовался объектив с 20-кратным увеличением. Текущие гранулы отображались с помощью камеры с выдержкой 50 мсек, и световой импульс длительностью в одну мсек освещал поток каждые 25 мсек. Благодаря этому решению каждую текущую гранулу можно видеть два или три раза в каждом изображении. На Фиг.21, внизу справа, представлено изображение гранулы, проходящей дважды при открытом затворе. Изображение над указанным изображением представляет группу из двух гранул.

9. Кодирование гранул с помощью фотообесцвечивания и последующее позиционирование и ориентирование указанных гранул.

Флуоресцентные гранулы можно кодировать фотообесцвечиванием под микроскопом. Информацию можно записывать в 3 измерениях путем сканирования фокуса пишущего/считывающего луча по оси X, Y, Z; причем ось Z параллельна оптической оси микроскопа. На 1 оси можно обнаружить максимум 60 разрядов информации, предположив, что на практике имеется 32 разряда: это дает возможность нанести 4×10² разных кодов.

Затем обеспечивают механизм ориентирования и позиционирования гранулы в ее первоначальном положении нанесения. Если гранулы являются сферически симметричными, то коды можно нанести как концентрические сферы равных уровней обесцвечивания. Ту же информацию получают, если строка считана через центр гранулы.

Если гранула является цилиндрически симметричной гранулой (симметрия вращения по Z'), то коды можно нанести в круге вокруг оси Z'. Это позволит считывать и наносить коды по существу в одном измерении (угол в полярных координатах). Можно ввести контрольный рисунок, который указывает начало кода - Фиг.22.

Кодовые разряды можно нанести по оси симметрии сферической гранулы согласно Фиг.23. Эта ось ясно определяется при ориентировании гранулы. Поэтому считывание возможно только по этой линии. Ось Z' гранулы может быть либо параллельной или перпендикулярной оптической оси микроскопа. В случае если зеркальной плоской симметрии, перпендикулярной оси Z', не имеется (магнитные гранулы, анизотропия массы), то строку можно считывать только в одном направлении. Также возможно отмечать как начало, так и конец кодовых разрядов.

Если считывание делают в одномерной плоскости, то возможно считывать 1000 гранул/сек при соблюдении следующих параметров: предполагается, имеется 50 разрядов на одну гранулу, из расчета на один разряд измеряют 5 позиций, и это дает 250 измерений из расчета на один код. Поскольку строку из 514 точек можно измерить за 1,2 мсек (исходя из технических данных софокусного микроскопа Bio-RadMRC1024), это дает 0,6 мсек для считывания одной гранулы, и поэтому 1667 гранул можно считывать в одну секунду, если процесс считывания является фактором, ограничивающим время.

Подача гранул и их сканирование через фокус лазерного луча можно осуществить с тем же ровным движением. Ровное движение можно реализовать разными способами. Гранулы можно переносить с помощью текучей среды, текущей по капиллярной трубке. Либо капиллярную трубку, содержащую гранулы и (соответствующую индексу) текучую среду, можно поступательно перемещать через фокус.

Фиг.24 изображает магнитные гранулы, которые переносятся течением текучей среды по капилляру и перемещаются через фокус лазерного луча в направлении, перпендикулярном оптической оси микроскопа. Катушки, по которым проходит электрический ток, создают магнитное поле и ориентируют гранулы в направлении движения. Коды на гранулах можно наносить на гранулы или считывать с них. Катушки могут служить индикатором для поступающих гранул и в качестве счетчика скорости, поскольку движущееся магнитное поле гранул индуцирует ток в катушках. Сигнал от катушек поэтому можно использовать для начала считывания/нанесения на гранулу и также как обратный сигнал для управления потоком гранул.

Если проточная трубка установлена вертикально, то гранулы можно также ориентировать так, чтобы их ось симметрии была параллельна их движению, когда их центр тяжести не соответствует их геометрическому центру. Движение гранул можно также контролировать оптически. Контрольный рисунок можно ввести в начало и конец каждого кода, чтобы снизить требования к устойчивому течению и чтобы точно знать скорость. Число позиций считывания/нанесения можно также сократить за счет использования разных уровней фотообесцвечивания, напр. 0%, 33%, 66%, 100% обесцвечивания. В этой системе скорость течения можно увеличивать, а ограничения в отношении фокусирования, точного позиционирования и ориентирования можно снизить. Не ограничивающий пример схемы кодирования с использованием 4 разных интенсивностей изображен на Фиг.25. Каждая интенсивность представлена цветом и числом от 0 до 3. Эта схема кодирования имеет 28 знаков, символически представленных 26 буквами латинского алфавита и двумя дополнительными знаками пунктуации. Каждый знак состоит из 4 кодирующих элементов (т.е. 4 возможных интенсивности (или цвета)) при дополнительном условии, что два одинаковых элемента не могут следовать друг за другом, даже когда два знака находятся рядом друг с другом.

10. Пример позиционирования и ориентирования гранул, текущих в капилляре и подвергающихся воздействию переменного магнитного поля, параллельного направлению течения.

Гранулы в этом эксперименте содержат небольшой закрытый проводник. Капилляр, по которому могут протекать гранулы, помещен в катушку - Фиг.26. При прохождении соответствующего количества электрического тока по катушке формируется однородное магнитное поле В. При изменении электрического тока магнитное поле В становится переменным.

При протекании гранул через усиливающееся магнитное поле ток будет генерироваться в небольшом проводнике, который в свою очередь будет формировать в грануле магнитное поле B', противодействующее изменениям во внешнем магнитном поле. Поскольку магнитное поле В' формируется, поэтому пара сил будет воздействовать на гранулу, которая ориентируется на B' поперек В. Таким образом обеспечивается осевое позиционирование и ориентирование гранулы согласно направлению магнитного поля В, и при этом не будет возникать ненужный эффект слипания гранул вместе в результате действия постоянного магнитного поля. Перемещение гранулы для этого способа ориентирования не является обязательным.

11. Пример позиционирования и ориентирования гранул, текущих в капилляре, который подвергается воздействию магнитного поля, перпендикулярного направлению течения.

В этом эксперименте гранулы содержат небольшой проводник. Капилляр в этом случае установлен между двумя полярными пластинами, которые формируют однородное магнитное поле В - Фиг.27. Гранулы перемещаются по капилляру со скоростью v внутри магнитного поля В - Фиг.27. Сила Лоренца F будет воздействовать на электроны небольшого проводника в гранулах, в результате чего они будут перемещаться в одну сторону проводника. Эта сила будет продолжать свое действие, когда гранулы будут продолжать течение, и плоскость небольшого проводника будет принудительно смещаться параллельно силе F. Осевое позиционирование и ориентирование гранул обеспечивают согласно направлению F. Этот пример представляет упрощенную картину действия сил в этом эксперименте.

12. Примеры ориентирования и позиционирования ферромагнитных микросфер

Эти эксперименты показали, что ферромагнитные 4-мкм микросферы можно намагничивать и ориентировать во внешнем магнитном поле. В этих экспериментах рисунок был обесцвечен на центральной плоскости намагниченной ферромагнитной микросферы, при этом указанные микросферы подвергали воздействию магнитного поля и ориентировали их под его воздействием. Затем рисунок был создан, когда сфера подвергалась воздействию движущегося внешнего магнитного поля. Делалась проверка, чтобы определить, возникнет ли снова первоначальное ориентирование - известное из обесцвеченного рисунка - после произвольного перемещения микросферы, если указанная микросфера будет снова подвергнута воздействию первоначального магнитного поля. Были приготовлены зеленые флуоресцентные ферромагнитные полистироловые микросферы диаметром 40 мкм. Был приготовлен 0,01 об.% раствор NP40 (нейтральное моющее средство) в дионизированной воде и использован для приготовления 0,1% взвеси микросфер. Нейтральное моющее средство ввели, чтобы минимизировать взаимодействие полимерной гранулы с покровным стеклом микроскопа (см. ниже).

На покровном стекле микроскопа была приготовлена емкость: был приклеен пластмассовый цилиндр диаметром 0,5 см. Емкость была наполнена взвесью микросфер в количестве 80 мл, и микросферам дали возможность осесть на покровном стекле. Емкость затем поместили над сильным постоянным магнитом на 1 минуту, чтобы намагнитить микросферы. Затем емкость поместили на софокусный микроскоп Bio-RadMCR1024, который был соединен с инвертированным микроскопом в целях использования погружного объектива Nikon 60x для осмотра гранул через дно покровного стекла. Сильный постоянный магнит был установлен на расстоянии 20 см от емкости, чтобы ориентировать гранулы без изменения их магнитной поляризации (Фиг.28).

Стрелка была обесцвечена на центральной плоскости ферромагнитной сферы, ориентированной внешним магнитным полем первого сильного магнита, тем самым указывая ее первоначальное ориентирование (Фиг.29а). Затем софокусный микроскоп был использован для взятия серии из 50 изображений с интервалом 1,2 секунды между каждым из изображений. При взятии этой серии изображений второй магнит использовали для перемещения вокруг емкости: сначала на 90^о в одну сторону и затем на 180^о в противоположную (Фиг.29b-i); при этом первый магнит оставался на месте. Затем второй магнит был убран, и наблюдалось возвращение микросферы в ее первоначальное положение (Фиг. 29j-i). Изображения на Фиг.29 были выбраны из серии 50 изображений с 1,2-секундным интервалом записи перемещения микросферы. На некоторых изображениях стрелка четко не видна по причине наклона первоначальной центральной плоскости при движении второго магнитного поля и по той причине, что софокусный микроскоп создает софокусные секции.

В следующем эксперименте были использованы те же микросферы, что и в предыдущем эксперименте. Микросферы были первоначально ориентированы в магнитном поле первого магнита (Фиг.30а). После тщательного мечения позиции этого магнита он был использован для вращения микросферы (Фиг.30b-j) за счет движения магнита на 360^о вокруг емкости и возвращения в его первоначальное положение. Микросфера не вернулась в свое первоначальное положение из-за относительно сильного взаимодействия между полимерной гранулой и покровным стеклом. Второй магнит был использован для ослабления микросферы путем быстрого перемещения близко к емкости. Микросфера немедленно возвратилась в свое точное первоначальное ориентирование (Фиг.30k-l).

Частицы с ферромагнитным покрытием можно было легко намагничивать с помощью сильного магнита. Микросферы можно было ориентировать во внешнем магнитном поле. Ориентирование микросфер в определенном внешнем магнитном поле было точно воспроизводимым после произвольного перемещения сфер при повторном приложении первоначального поля. В пределах одного элемента изображения разница ориентирования не наблюдалась (0,7 мкм/элемент изображения).

13. Пример использования сферических микроносителей с одной осью симметрии в целях идентификации, т.е. кодирования и считывания в проточной кювете.

Ниже приводится объяснение необходимости ориентирования и позиционирования в целях идентификации. Код на указанном сферическом микроносителе наносят на оси симметрии, при этом код кодируют (наносят) или идентифицируют (считывают) с помощью источника света с высокой разрешающей способностью, в частности с помощью флуоресцентного обесцвечивания.

Сферические микроносители ориентируют по их оси симметрии вдоль течения. Лазерный луч для флуоресцентного обесцвечивания имеет стационарное положение в софокусном микроскопе; и код на указанном микроносителе наносят по оси симметрии. Само течение служит в качестве движения сканирования по оси симметрии. Указанный выше код (по оси симметрии) можно считывать лазерным лучом, имеющим стационарное положение. Фиг.31а, 31b, 31i, 31j представляют схематическое поле зрения микроносителей, протекающих перед объективом микроскопа. Фиг.31а, 31i показывают поле зрения до прибытия микроносителя в фокусированный лазерный луч для считывания/нанесения кода. Фиг.31b, 31j имеют поле зрения с микроносителем в положении фокуса.

В случае стационарного луча нанесения/считывания и точного течения микроносителя код можно наносить/считывать по оси симметрии микроносителя - Фиг.31с. Но если течение не является достаточно воспроизводимым относительно фокуса микроскопа, то есть возможность того, что код не будет правильно считан - Фиг.31f, где код нанесен/считан под осью симметрии.

Согласно Фиг.31d, 31g вспомогательный лазерный луч можно использовать для освещения проходящего микроносителя. В этом случае будет наблюдаться затеняющий эффект позади микроносителя по причине частичного поглощения или отражения света указанным микроносителем. Светодиод, состоящий из двух отдельных элементов (двухэлементный фотоприемник), установлен на противоположной стороне проточной кюветы, чтобы измерять эффект затенения. На Фиг.31d: поскольку центр сферического микроносителя пересекает оптическую ось микроскопа, то то же самое количество света поступает в два элемента; и двухэлементный фотоприемник измеряет разностной сигнал, равный нулю, указывая, что гранула проходит на правильной высоте. На Фиг.31g: поскольку центр сферического микроносителя не пересекает оптическую ось микроскопа, то двухэлементный фотоприемник измеряет разностной сигнал, равный нулю, указывая, что микроноситель протекает слишком высоко. Следовательно, использование светодиода позволяет обнаруживать неправильное позиционирование микроносителей в течении и указывает, текут ли микроносители слишком высоко или слишком низко по отношению к оптической оси.

Эту светодиодную систему можно использовать для измерения положения микроносителя до того, как указанный микроноситель окажется в фокусе считывающего/наносящего лазерного луча. В этом случае сформированный сигнал ошибки позиции можно использовать для регулирования фокуса считывающего/наносящего луча. На Фиг.31с: поскольку измеренный сигнал ошибки позиции равен нулю, поэтому позиция фокуса луча не изменилась. На Фиг.31h: сигнал ошибки измерен, и в этом случае положение фокуса луча сдвинулось вверх. Фокус лазерного луча можно регулировать путем изменения направления падения наносящего/считывающего луча на объективе микроскопа. Акустико-оптический дефлектор луча можно использовать в качестве устройства, которое может быстро адаптировать направление лазерного луча. Этот же метод можно использовать для формирования сигнала ошибки позиции для оси Z, т.е. оптической оси микроскопа. Поскольку на двухэлементном фотоприемнике будет только разностной сигнал, то этот сигнал можно использовать для обнаружения поступления микроносителя и можно также использовать как сигнал пуска считывания и нанесения.