штамм микроорганизмов bacillus mycoides var. b.a. для получения биопрепарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от болезней

Формула изобретения

Штамм микроорганизмов Bacillus mycoides var. B.A. ВНИИСХМ № Д138 для получения биопрепарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от болезней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к производству и применению биологических средств борьбы с возбудителями болезней растений и для стимуляции их роста.

Известен штамм Pseudomonas fluorescence biovar V MD-4f [1], подавляющий размножение грибов рода Streptomyces, являющихся возбудителями парши картофеля. Семенной картофель обрабатывают суспензией клеток данного штамма с концентрацией 10⁹ кл/мл.

Недостатком данного штамма является ограниченная область применения (действует только на фитопатогенные грибы рода Streptomyces) и требует большого расхода суспензии, идущей на обработку семян.

Известен также штамм Pseudomonas cepacia AMMA [2], подавляющий рост фитопатогенных грибов вида Aphanomyces.

Однако отсутствуют сведения о его антагонистической активности в отношении других фитопатогенов.

Наиболее близким аналогом к заявляемому штамму является штамм Pseudomonas aureofaciens [3], подавляющий рост вирулентных агробактерий, вызывающих бактериальный рак винограда и других растений. Упомянутый штамм депонирован в ВКПМ под номером В-4117. Клетки данного штамма выращивают в течение 24 часов при 30°С на бульоне Хоттингера или картофельном агаре до титра клеток 10⁸-10⁹ кл/мл.

Недостатком данного штамма является узкая область его антагонистического действия, а также то, что он не обладает свойствами для стимуляции роста растений.

Целью изобретения является выделение природного штамма бактерий с расширенной областью антагонистического действия на патогенную микрофлору с обеспечением возможности стимуляции роста растений.

Выделенный штамм Bacillus mycoides var. B.A. обладает расширенными защитными свойствами от фитопатогенной микрофлоры, а также способствует стимуляции роста растений в составе биологического препарата "Экстрагран".

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ) под номером Д 138.

Штамм Bacillus mycoides var. B.A. выделен в Волгоградской области из ризосферной зоны проса обыкновенного (Panicum miliaceum L).

Культурально-морфологические признаки.

В морфологическом отношении Bacillus mycoides var. B.A. идентичен Bacillus cereus.

Форма колоний на агаре - сероватые, расплывающиеся, ризоидные.

На косом агаре - беловатый, рыхлый, блестящий, ризоидный с утолщающимся во времени налетом.

Представляет собой грамположительные палочки (0,8-1,0×2,0-4,0) микрон, соединенные в длинные цепочки. На глюкозном бульоне палочки значительно длиннее. Движутся медленно.

По характеру расположения жгутиков - перитрихи.

Спора - центрально расположена. Прорастание полярное.

Физико-биохимические свойства.

Штамм Bacillus mycoides var. B.A. - аэроб.

Оптимальная температура роста и спорообразования 28-30°С.

Хорошо усваивает сахарозу, крахмал, нитраты.

Проявляет антагонизм по отношению к вредным объектам Fusarium verticilium, Gelminto-sporium - образует зоны на агаровых культурах.

Главным отличием являются размеры зон подавления роста Fusarium на картофельно-сахарозном агаре.

Размеры зон против Fusarium достигают 9-10 см в чашках Петри.

Штамм фагоустойчив.

Отношение к антибиотикам - резистентен к левомицитину, пеницилину, новобицину и чувствителен к тетрациклину и стрептомицину.

Штамм не фитотоксичен и безвреден для человека и теплокровных животных.

Хранение: на сухом перлите с мелом при температуре 5-6°С.

Условия и состав сред для выращивания:

При размножении бактерий штамма Bacillus mycoides var. B.A. использовали мясопептонный бульон. 4 мясных бульонных кубика растворяли в 1 л горячей воды. Бульон охлаждали, снимали с поверхности жир, отфильтровывали от механических частиц через ватно-марлевый фильтр. К приготовленной мясной воде добавляли навеску пептона и хлористого натрия, растворяли при нагревании, сливали в колбу емкостью 1000 мл, доводили объем дистиллированной водой до метки, 10%-ным раствором едкого натра устанавливали рН, равным 8,1-8,2, и доводили до кипения, что обеспечивало выпадение осадка. Затем подкисляли соляной кислотой (10%-ным раствором) до рН 7,1-7,5, снова кипятили и фильтровали через бумажный фильтр. Полученный мясопептонный бульон разливали в стерильную посуду и стерилизовали при 1 атм в течение 30 мин. В приготовленный мясопептонный бульон добавляли 0,5% глюкозы и 0,5% сахарозы. Раствором щелочи устанавливали рН 7,6-7,8, добавляли 2% агара, расплавляли агар на водяной бане, разливали его по стерильным пробиркам и колбам и стерилизовали при давлении 0,8 атм в течение 30 мин.

После стерилизации рН среды должен быть равен 6,8-7,2.

Культивирование проводят на качалке или виброреакторе при температуре 28-30°С в течение суток.

На свекловичной мелассе Bacillus mycoides var. B.A. выращивали в течение 48 часов при температуре 28-30°С с добавлением мела.

Проведенные исследования показали, что препарат на основе штамма Bacillus mycoides var. B.A. позволяет бороться с такими заболеваниями культурных растений как фузариоз, гельминтоспориоз, мучнистая роса, различные бактериозы, серая гниль, фитофтороз, парша, корневые гнили и др.

Действие препарата на основе штамма Bacillus mycoides var. B.A. заключается в расширении области применения, поскольку он проявляет антифугуальное действие в отношении большего перечня болезнетворных бактерий, чем прототип.

Кроме того, обеспечивается стимулирующее действие на рост растений, поскольку при использовании препарата увеличивается поглотительная активность корней растений, и усиливается синтез физиологически активных веществ и соединений, подавляющих вредное действие фитопагогенных микроорганизмов, в частности Erwinia Rhizoctonia.

Благодаря этому урожайность сельскохозяйственных культур повышается.

Применение такого препарата экономически выгоднее, чем использование минеральных удобрений.

Пример 1. Исследование активности штамма против патогенных микроорганизмов.

В картофельно-сахарозный агар внесли суспензию Fusariuma.

Разливали агар в чашки Петри. В агаре вырезали колодцы и ввели в них культуру Bacillus mycoides var. B.A. на разных стадиях развития. Через 48 часов появились зоны угнетения роста патогенных бактерий Fusariuma.

Пример 2. Стимуляция роста растений.

Семена пшеницы, кукурузы и др. культур выдерживали в культуральной жидкости Bacillus mycoides var. B.A. в течение 30 минут, а также в контрольной чашке. Затем семена раскладывали на влажную фильтровальную бумагу в чашках Петри и выдерживали 48 часов при температуре 28-30°С. Через 48 часов замеряли длину ростков и сравнивали с контрольной чашкой. Длина ростков обработанных семян превышала длину ростков в контрольной чашке на несколько процентов.

Штамм в составе препарата применялся для предпосевной обработки семенного и посадочного материала, при этом в ряде случаев выявлена высокая эффективность при опрыскивании всходов сельскохозяйственных культур.

Полевые испытания показали, что штамм, входящий в состав биопрепарата, улучшает условия питания растений, синтезирует физиологически активные вещества, а также подавляет фитопатогенную бактериальную и грибную микрофлору.

Пример 3. Повышение урожайности подсолнечника, семена которого были обработаны перед посевом.

Культура - подсолнечник, сорт - гибрид "Опера".

Место проведения испытаний - Волгоградская обл.

Урожайность на участке, обработанном препаратом со штаммом, - 17,6 ц/га. Урожайность на контрольном участке 16 ц/га. Разница в урожайности на обработанном и контрольном участках составила +1,6 ц/га.

Пример 4. Повышение урожайности пшеницы, семена которой были обработаны перед посевом.

Культура - озимая пшеница, сорт "Зерноградка-9".

Место проведения испытаний - Волгоградская обл.

Урожайность на участке, обработанном препаратом со штаммом, - 38,2 ц/га.

Урожайность на контрольном участке 34 ц/га. Разница в урожайности на обработанном и контрольном участках составила +4,2 ц/га.

Штамм проявил также хорошие свойства при хранении овощной продукции.

Клубни картофеля, обработанные препаратом, при одинаковых условиях хранения с контрольными, хранились дольше и не были подвержены заболеваниям.

Заявленный штамм Bacillus mycoides var. B.A. (ВНИИСХМ № Д 138) является новым и соответствует критерию изобретательского уровня.

Приведенные примеры подтверждают достижение технического результата и соответствие заявленного штамма условию промышленной применимости.

Источники информации

1. Заявка Японии №1-19320, М. Кл. А 01 Т 63/00, опублик. 1989 г.

2. Патент США №5244658, М. Кл. С 12 N 1/20, опублик. 1993 г.

3. Патент РФ №1482188, М. Кл. С 12 N 1/20, опублик. 1994 г.