способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе

Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов с их последующей сенсибилизацией сенситином, отличающийся тем, что перед обработкой сенситином формализированные эритроциты предварительно обрабатывают додецилсульфатом натрия в 1%-ной концентрации при 50-60°С в течение 30 мин, сенсибилизацию проводят сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смыв ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование и отделение сенситина центрифугированием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к приготовлению диагностических препаратов, и может быть использовано для серологической диагностики бруцеллеза животных.

Известен «Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума» путем дезинтеграции бруцелл ультразвуком с последующим выделением антигена и сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов, при этом с целью повышения активности диагностикума дезинтеграцию ведут при рН 8,0-9,0 и сенсибилизацию эритроцитов проводят при 70-72°С в течение 5-10 мин (а.с. №784879, 1980 г. Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт; Карагандинская научно-исследовательская ветеринарная станция Министерства сельского хозяйства Казахской ССР; авторы Иванов Н.П., Бельченко В.Б.).

Недостатком данного способа является то, что при серологическом исследовании в РНГА с применением диагностикума, изготовленного по указанному способу, животных из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств или искусственно зараженных бруцеллезом, у части больных бруцеллезом животных не удается установить диагноз на это заболевание, несмотря на то, что у них в сыворотке крови циркулируют специфические гемагглютинины, обнаруживаемые в РНГА при использовании более активного эритроцитарного антигена (см.таб.3).

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), который обладает высокой активностью и дает возможность обнаружить инфицированных бруцеллезом животных наиболее полно и в более ранние сроки после заражения.

Поставленная цель достигается тем, что:

1. Формалинизированные эритроциты для повышения адсорбционных свойств их рецепторов предварительно до сенсибилизации обрабатываются новым детергентом - додецилсульфатом натрия при оптимальном режиме - в 1%-ной концентрации при 50-60°С в течение 30 мин.

2. С целью определения оптимальной дозы сенситина, требуемого для сенсибилизации эритроцитов и получения стандартного антигена для РНГА, используется национальный биологический стандарт - стандартный образец сыворотки антибруцелла абортус.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Трехсуточную агаровую культуру бруцелл штамма 19 смывают 12%-ным раствором хлорида натрия, фильтруют через четыре слоя марли, доводят концентрацию бруцелл до 80-100 млрд. микробных клеток в 1 мл. Устанавливают рН 8,0-9,0 и подвергают автоклавированию при 1 атмосфере (120°С) в течение 20-30 мин. Взвесь бруцелл остужают до температуры 18-25°С и подвергают центрифугированию при 8-10 тыс. оборотов в минуту. Полученный экстракт, который представляет собой липополисахаридобелковый комплекс бруцелл (сенситан), используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. Предварительно до сенсибилизации формалинизированные эритроциты обрабатываются детергентом - додецилсульфатом натрия в 1%-ной концентрации при температуре 50-60°С в течение 30 мин.

Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов после обработки додецилсульфатом натрия проводится оптимальной дозой сенситина, которая определяется путем титрации его с использованием стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус.

Специфичность и активность готового эритроцитарного антигена проверяются путем исследования в РНГА отрицательной сыворотки и стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус.

Пример определения оптимальных условий обработки формалинизированных эритроцитов додецилсульфатом натрия и сенсибилизации их сенситином (липополисахаридобелковый комплекс).

Определение оптимальной концентрации додецилсульфата натрия, требуемой для повышения адсорбционных свойств эритроцитов и получения специфичного и активного эритроцитарного антигена для РНГА, проводится путем обработки 10% взвеси формалинизированных эритроцитов разными концентрациями (1,0%; 1,5,%) додецилсульфата натрия и проверки активности и специфичности в РНГА антигена, полученного путем сенсибилизации эритроцитов, обработанных разными концентрациями указанного детергента.

Оптимальную сенсибилизирующую дозу сенситина, необходимую для получения стандартного антигена для РНГА с оптимальной активностью, определяют путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов (предварительно обработанных додецилсульфатом натрия) возрастающими дозами сенситина и проверки серологической активности сенсибилизированных эритроцитов (антигена) в РНГА с использованием стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус. Для сенсибилизации эритроцитов к 1 мл 5%-ной их взвеси добавляют по 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мл сенситина. Результаты проверки активности и специфичности антигена, полученного при обработке эритроцитов разными концентрациями додецилсульфата натрия и сенсибилизированных разными дозами сенситина, даны в таблице 1.

Таблица 1 Результаты титрации сенситина и проверки активности эритроцитарного антигена в РНГА
К-во сенситина на 1 мл 5-% взвеси эритроцитов	Титры РНГА
	со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус						с негативной сывороткой				с физраствором
	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	1:50	1:100	1:200	1:400
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
а. с антигеном, изготовленным без обработки эритроцитов додецилсульфатом натрия
1,0	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
1,5	++	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
2,0	++	++	+	-	-	-	-	-	-	-	-
2,5	+++	++	+	-	-	-	-	-	-	-	-
3,0	+++	++	++	+	-	-	-	-	-	-	-
б. с антигеном, изготовленным путем обработки эритроцитов 1%-ной концентрацией додецилсульфата натрия
1,0	++++	++++	++++	++++	+	-	-	-	-	-	-
1,5	++++	++++	++++	++++	++++	-	-	-	-	-	-
2,0	++++	++++	++++	++++	++++	+	-	-	-	-	-
2,5	++++	++++	++++	++++	++++	++	-	-	-	-	-
3,0	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-	-	-	-	-
в. с антигеном, изготовленным путем обработки эритроцитов 1,5%-ной концентрацией додецилсульфата натрия
1,0	++++	++++	++++	++++	+	-	-	-	-	-	-
1,5	++++	++++	++++	++++	+++	-	-	-	-	-	-
2,0	++++	++++	++++	++++	++++	+	-	-	-	-	-
2,5	++++	++++	++++	++++	++++	++	+	+	+	+	-
3,0	++++	++++	++++	++++	++++	+++	++++	++++	+	+	-
Примечание: знак - отрицательный результат

Из приведенных в таблице 1 данных видно, что антиген, изготовленный путем сенсибилизации эритроцитов, не обработанных додецилсульфатом натрия, обладает низкой активностью. Обработка эритроцитов додецилсульфатом натрия повышает активность эритроцитарного антигена. Наиболее оптимальной для обработки эритроцитов является 1%-ная концентрация додецилсульфата натрия, позволяющая получить эритроцитарный антиген, обладающий достаточно высокой активностью и не дающий неспецифические реакции с негативной сывороткой и физраствором. Наименьшей дозой сенситина, позволяющей получить антиген с достаточно высокой активностью, является 1,0-1,5 мл его на 1 мл 5%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов, предварительно обработанных детергентом.

Следовательно, обработка эритроцитов 1,0%-ной концентрацией додецилсульфата натрия и сенсибилизация их, из расчета 1-1,5 мл сенситина на 1 мл 5%-ной взвеси эритроцитов, позволяет получить специфичный и более активный (по сравнению с аналогом) бруцеллезный эритроцитарный антиген для РНГА (табл.2 и 3).

Таблица 2
Результаты испытания специфичности эритроцитарных антигенов (диагностикумов), изготовленных различными способами, в РНГА
№№ п/п	Сыворотки, крови, подвергнутые исследованию	Исследовано в РНГА сывороток крови	Результат исследования
			с антигеном Прикасп. зонального НИВИ	с диагностикумом Казахского НИВИ (аналог)
1.	здорового по бруцеллезу крупного рогатого скота	50	-	-
2.	здоровых по бруцеллезу овец	60	-	-
3.	здоровых по бруцеллезу свиней	3	-	-
4.	больного туберкулезом крупного рогатого скота	7	-	-
5.	больного лейкозом крупного рогатого скота	10	-	-
6.	больного лептоспирозом крупного рогатого скота	8	-	-
7.	больных кампилобактериозом овец	5	-	-
8.	туляремийные	2	-	-
9.	больного паратуберкулезом кр. рог. скота	1	-	-
10.	больных В.ovis баранов	3	-	-
Всего исследовано:		149	-	-
Примечание: (-) - отрицательный результат.

Таблица 3
Результаты сравнительного испытания активности бруцеллезных эритроцитарных антигенов (диагностикумов) для РНГА, изготовленных различными способами
Вид животных	Исследовано сывороток крови	Показатели	Результат исследования
			с антигеном Прикаспийского зонального НИВИ	с диарностикумом Казахского НИВИ (аналог)
Круп. рог. скот неблагополучных по бруцеллезу хозяйств	54	Получена положительная РНГА	32	26
		%	59,2	48,1
		Средний титр РНГА	1:409	1:390
Мелкий рог. скот неблагополучных по бруцеллезу хозяйств	10
		Получена положительная РНГА	6	-
		%	60	-
		Средний титр РНГА	1:158	-
Свиньи, искусственно зараженные бруцеллезом	10	Получена положительная РНГА	10	9
		%	100	90
		Средний титр РНГА	1:425	1:200