способ прогнозирования развития токсического гепатита при химиотерапии множественной миеломы

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития токсического лекарственного гепатита при химиотерапии множественной миеломы, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови больного, генотипирование полиморфизма гена CYP1A1 в сайте Ile 462 Val методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, и при выявлении генотипа Ile/Val прогнозируют высокий риск развития токсического лекарственного гепатита при химиотерапии множественной миеломы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования развития токсического гепатита при химиотерапии множественной миеломы.

Множественная миелома (MM) - одно из наиболее распространенных злокачественных заболеваний системы крови, заболеваемость в различных регионах мира колеблется от 1 до 5 случаев на 100000 взрослого населения (Cancer Incidence in Five Continents, ARS Sea Publ., 1992). Заболевание требует непрерывной химиотерапии с момента возникновения до исхода, схемы лечения отличаются в зависимости от стадии заболевания, состояния внутренних органов, наличия осложнений от терапии. Наличие таких осложнений, как острая пневмония, выраженная сердечная недостаточность, токсический лекарственный гепатит, может быть основанием для отсрочки специфической химиотерапии, а значит, и прогрессирования основного заболевания. Таким образом, своевременное прогнозирование развития токсического лекарственного гепатита способствовало бы улучшению результатов лечения.

Согласно литературным данным к факторам неблагоприятного прогноза развития токсического гепатита относятся пол, возраст, вид лекарственного препарата (Ивашкин В.Т. Ненаркотические анальгетики, алкоголь и печень / В.Т.Ивашкин, В.П.Фисенко, А.А.Шептулин // Клиническая медицина. - 1999. - №9. - С.35-37).

Известен способ прогнозирования развития токсического гепатита по нарушениями в активности ферментов, метаболизирующих лекарственные препараты (Полунина Т.Е. Лекарственные гепатиты // Т.Е.Полунина // Тер. архив. - 1999. - №12. - С.46-49; Гепатотоксическое действие лекарственных препаратов некоторых фармакологических групп / Ю.А.Кинзирская, Т.А.Богуш, Н.В.Остапчук, В.П.Фисенко // Клиническая медицина. - 2003. - №10. - С.11-15).

Прототипом изобретения является способ прогнозирования развития токсического гепатита, предложенный Watkins P. Role of cytochromes P-450 in drug metabolism hepatotoxity / P.Watkins // Semin. Liver Dis. - 1990. - Vol.10. - P.236-238. Авторы считают, что важное значение в метаболизме лекарственных препаратов играют ферменты семейства цитохрома P-450 и по их активности можно прогнозировать развитие токсического поражения внутренних органов. Однако пользуясь этим способом, нельзя точно прогнозировать поражение печени при применении химиопрепаратов.

Важно подчеркнуть, что при множественной миеломе исследований активности ферментов не проводилось. В связи с этим изучение генетического полиморфизма, обеспечивающего активность ключевого фермента системы цитохрома P-450 - CYP1A1, может позволить прогнозировать активность фермента, а значит, и риск развития токсического гепатита. Как известно, фермент CYP1A1 экспрессируется, главным образом, в легких и печени, обеспечивает связывание токсических продуктов, поступающих извне, в том числе и лекарственных препаратов. От его активности зависит их обезвреживание. По данным литературы активность фермента генетически детерминирована, зависит от полиморфизма (Ile462Val) гена CYP1A1 (Oyama Т. et al. Detection of CYP1A1 gene polymorphism using designed RFLP and distributions of CYP1A1 genotypes in Japanese / T.Oyama, T.Mitsudomi, T.Kawamoto et al. // Int. Arch. Occup.Environ Health. - 1995. - Vol.67. - №4. - Р.253-6; Hayashi S.I. High susceptibility to lung cancer analyzed in terms of combined genotypes of P450 1A1 and muclass glutathion S-transferase genes / S.I.Hayashi, J.Watanable, K.Kawajiri // Jpn. J.Cancer Res. - 1992. - Vol.8. - P.866-870).

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования развития токсического лекарственного гепатита при химиотерапии множественной миеломы.

Указанный технический результат достигается тем, что в выделенной методом фенольно-хлороформной экстракции ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови проводят генотипирование полиморфизма промоторной области гена CYP1A1 в сайте - Ile 462 Val методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК с последующей рестрикцией. После амплификации и рестрикции фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном неденатурированном геле и анализируют при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе: наличие ДНК-фрагментов 139 и 48 нуклеотидных пар (н.п.) интерпретируют как генотип изолейцин-изолейцин (Ile-Ile), размером 120 н.п., 139 н.п., 48 н.п. и 19 н.п. - как изолейцин-валин (Ile-Val). При выявлении генотипа Ile-Val прогнозируют высокий риск развития токсического лекарственного гепатита.

Для молекулярно-генетического анализа полиморфизма гена CYP1A1 последовательности праймеров взяты из работ Oyama T. et al. (1995). После амплификации в вышеописанных условиях продукты ПЦР подвергали расщеплению специфической эндонуклеазой HincII. Наличие С А трансверсии в 4,887 положении 7 экзона гена CYP1A1, характеризующейся заменой изолейцина (Ile, аллель I) на валин (Val, аллель V) в 462 кодоне, приводило к появлению второго сайта рестрикции для эндонуклеазы HincII. Нормальные аллели имели один сайт рестрикции для HincII, и на электрофорезе выявлялись фрагменты размером 139 н.п. и 48 н.п. (генотип Ile-Ile). При наличии мутации в гетерозиготном состоянии идентифицировались аллели размером 139 н.п., 120 н.п. и 48 н.п., 19 н.п. (генотип Ile-Val). У гомозигот по наличию мутантного аллеля определялись фрагменты размером 120 н.п., 48 н.п. и 19 н.п. (генотип Val-Val).

Способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 6 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press. - 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до рН 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂О; раствор хранят при -20°С.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента промоторной области гена ИЛ-6. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров приведены в работе Oyama Т. et al., 1995 (Detection of CYP1A1 gene polymorphism using designed RFLP and distributions of CYP1A1 genotypes in Japanese / T.Oyama, T.Mitsudomi, T.Kawamoto et al. // Int. Arch. Occup. Environ Health. - 1995. - Vol.67. - №4. - Р.253-6). После амплификации в вышеописанных условиях продукты ПЦР подвергали расщеплению специфической эндонуклеазой HincII. Наличие С А трансверсии в 4,887 положении 7 экзона гена CYP1A1, характеризующейся заменой изолейцина (Ile, аллель I) на валин (Val, аллель V) в 462 кодоне, приводило к появлению второго сайта рестрикции для эндонуклеазы HincII.

Состав реакционной смеси для ПЦР следующий: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 мМ Tris-HCl, рН 8.8, 6.7 мМ MgCl₂, 16,6 мМ (NH₄ )₂SO₄, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°С, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°С - 45 секунд, 55°С - 45 секунд, 72°С - 45 секунд.

После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°С в течение 7 минут. ПЦР-продукты подвергают рестрикции с помощью фермента Hsp92II при 37°С в течение ночи и электрофорезу в вертикальном 7% полиакриламидном геле. Для этого 7 мкл ПНР-продукта смешивают с 5 ед. фермента, смесь выдерживают при 37°С в течение 10 часов. В качестве электролита для электрофореза применяют IX боратный буфер (0,089 М трисHCl, рН 7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с рН 8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Нормальные аллели имели один сайт рестрикции для HincII, и на электрофорезе выявлялись фрагменты размером 139 н.п. и 48 н.п. (генотип Ile/Ile). При наличии мутации в гетерозиготном состоянии идентифицировались аллели размером 139 н.п., 120 н.п. и 48 н.п., 19 н.п. (генотип Ile/Val). У гомозигот по наличию мутантного аллеля определялись фрагменты размером 120 н.п., 48 н.п. и 19 н.п. (генотип Val/Val).

В качестве контроля обследовали группу здоровых индивидов, проживающих на территории республики Башкортостан (101 человек), у которых отсутствовали какие-либо злокачественные заболевания.

В качестве конкретных примеров обследовано 68 больных ММ, находившихся на лечении в гематологическом отделении РКБ, в возрасте от 32 до 75 лет.

Проведен анализ основных биохимических показателей у пациентов в 3 стадии множественной миеломы без признаков вирусного поражения печени с различными генотипами по полиморфизму Ile 462Val гена CYP1A1. Биохимические исследования до начала курсов полихимиотерапии не выявили статистически значимых различий у пациентов с различными генотипами. Значительные изменения выявлены через 6 курсов лечения по схеме М2 (циклофосфан, винкристин, алкеран, преднизолон, белюстин). Данные представлены в табл.1.

Как видно из данных таблицы, группа пациентов, гетерозиготных по гену CYP1A1, характеризовалась статистически значимо низкими показателями содержания альбуминов и холестерина, а показатели токсического повреждения печени - ACT, АЛТ - были увеличены. Также был увеличен показатель внутрипеченочного холестаза - щелочная фосфатаза. Уровень билирубина в группе больных ММ, гетерозиготных по гену CYP1A1, также был увеличен (р<0,05). Увеличение билирубина выше нормы наблюдалось в 9 случаях: 6 пациентов имели генотип Ile/Val, а 3 пациента - генотип Ile/Ile ( ²=11,72; р<0,005). Таким образом, у больных множественной миеломой при генотипе Ile/Val статистически значимо чаще происходит развитие токсического лекарственного гепатита, и наличие данного генотипа можно считать фактором риска возникновения лекарственного поражения печени.

Пример 1. Б-ая Б.З., 1926 года рождения, Б-ий район, Республика Башкортостан. Диагноз ММ установлен в апреле 1997 года, подтвержден стернальной пункцией, где обнаружено 52% плазматических клеток, наличием остеодеструкций в костях позвоночника и черепа. Регулярно получает полихимиотерапию с включением циклофосфана, винкристина, алкерана, белюстина, преднизолона. После 3 курса химиотерапии развились явления лекарственного гепатита: увеличились размеры печени, повысился уровень билирубина сыворотки крови (общий - 46 мкмоль/л, прямой - 40 мкмоль/л), аланинаминотрансферазы до 4 норм, аспартатаминотрансферазы до 3 норм, щелочной фосфатазы до 3 норм. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка гена ИЛ-6 в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой HincII провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфного локуса Ile 462 Val гена CYP1A1 выявило генотип Ile/Val, что подтверждало высокий риск развития токсического гепатита при данном генотипе гена CYP1A1.

Таким образом, нами проведено молекулярно-генетическое изучение полиморфного локуса Ile 462 Val гена CYP1A. Установлено, что при генотипе Ile/Val полиморфного локуса Ile 462 Val гена CYP1A статистически значимо чаще развивается токсический лекарственный гепатит. Полученные данные позволяют прогнозировать развитие лекарственного гепатита и корректировать дозы химиопрепаратов с целью профилактики токсического гепатита.