способ получения побегов льна-долгунца in vitro

Формула изобретения

Способ получения побегов льна-долгунца in vitro, включающий инкубацию семян на агаризованной питательной среде в темноте с получением проростков, приготовление эксплантов из полученных проростков, инкубацию эксплантов на свету на агаризованной питательной среде, содержащей 6-бензиламинопурин с получением побегов, отличающийся тем, что семена инкубируют в темноте в течение 1-3 суток, а затем продолжают инкубацию на свету 3-7 суток на агаризованной питательной среде, содержащей, мг/л:

KNO3	945-955
NH4 NO3	823-827
MgSO4×7H 2O	183-187
Сахароза	4950-5050
Агар	6950-7050

экспланты готовят в виде цельных семядолей, их дополнительно инкубируют в темноте в течение 20-70 ч на агаризованной модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга, дополненной, мг/л:

Нафтилуксусная кислота	1,9-2,1
Кинетин	3,9-4,1
2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота	0,098-0,11
Агар	6950-7050

с получением подготовленных эксплантов, а для получения побегов полученные подготовленные экспланты инкубируют на свету на агаризованной модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга, при содержании, мг/л:

ZnSO4×4H 2O	9-10
Н3BO4	17-19
Тиамин-HCl	9,5-10,5
6-Бензиламинопурин	1-2
Агар	6950-7050

до получения побегов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, а также и для фундаментальных исследований в области физиологии растений.

Известен способ получения побегов рапса in vitro, включающий инкубацию семян на агаризованной питательной среде с получением проростков, приготовление эксплантов в виде цельных семядолей из полученных проростков, инкубацию приготовленных эксплантов на агаризованной питательной среде с получением побегов (Ралдугина Г.Н., Соболькова Г.Н. Факторы, влияющие на органогенез у семядольных эксплантов рапса // Физиология растений, 1995, т.42, N6, с.916-922).

Однако известно, что попытки достичь получения побегов на эксплантах семядолей льна-долгунца не имели успеха (Dedicova В., Hricova A., Samaj J., Obert В., Bobak M., Pretova A. Shoots and embryo-like structures regenerated from cultured flax (Linum usitatissimum L.) hypocotyl segments // J. Plant Physiology, 2000, v.157, p.327-334).

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа - прототипом является известный способ получения побегов льна in vitro, включающий инкубацию семян в темноте на агаризованной питательной среде с получением проростков, приготовление эксплантов из полученных проростков, инкубацию эксплантов на свету на агаризованной питательной среде, содержащей 6-бензиламинопурин и нафтилуксусную кислоту, с получением побегов (Каляева Н.М., Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Особенности регенерации льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) // Биотехнология, 2000, №6, с.34-40).

В этом способе для инкубации семян используют агаризованную безгормональную среду Мурасиге-Скуга (МС). (Murashige Т., Scoog P., 1962. A reserved medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology plantarum, v.15, p.473-497). Семена инкубируют на этой среде 14 суток в темноте с получением проростков. Из полученных проростков готовят экспланты в виде сегментов гипокотилей. Для получения побегов экспланты инкубируют на свету на среде МС, дополненной регуляторами роста: 6-бензиламинопурином - 1 мг/л и нафтилуксусной кислотой 0,01-0,1 мг/л.

Однако образование побегов на сегментах гипокотиля происходит по всей поверхности экспланта, преимущественно из эпидермальных клеток. Это снижает эффективность использования известного способа при проведении генетической трансформации при помощи Agrobacterium tumefacience, так как для агробактериальной трансформации необходимо образование побегов вокруг раневой поверхности. При использовании сегментов гипокотиля для увеличения числа побегов, образующихся вокруг раневой поверхности, при проведении генетической трансформации, часть эпидермиса необходимо удалять тонкими полосками вдоль экспланта, что значительно увеличивает трудоемкость способа.

Задачей настоящего изобретения является повышение выхода побегов вокруг раневой поверхности, получаемых из эксплантов льна-долгунца, при высокой общей частоте побегообразования и высоком качестве получаемых побегов, при упрощении способа и снижении его трудоемкости.

Задача решается новым способом получения побегов льна-долгунца in vitro, включающий инкубацию семян на агаризованной питательной среде в темноте с получением проростков, приготовление эксплантов из полученных проростков, инкубацию эксплантов на свету на агаризованной питательной среде, содержащей 6-бензиламинопурин, с получением побегов, причем семена инкубируют в темноте в течение 1-3 суток, а затем продолжают инкубацию на свету - 3-7 суток на агаризованной питательной среде, содержащей, мг/л:

KNO3	900-1000
NH4 NO3	800-850
MgSO4×7H 2O	180-190
Сахароза	4500-5500
Агар	6950-7050

экспланты готовят в виде цельных семядолей, их дополнительно инкубируют в темноте в течение 20-70 часов на агаризованной модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга, дополненной, мг/л:

Нафтилуксусная кислота	1,9-2,1
Кинетин	3,9-4,1
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	0,098-0,11
Агар	6950-7050

с получением подготовленных эксплантов, а для получения побегов полученные подготовленные экспланты инкубируют на свету на агаризованной модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга при содержании, мг/л:

ZnSO4×4H 2O	9-10
Н3BO4	17-19
Тиамин-HCl	9,5-10,5
6-бензиламинопурин	1-2
Агар	6950-7050

до получения побегов.

Заявленные пределы определяются следующим образом: ниже и выше заявленных пределов способ показывает плохие результаты. Ниже приведены примеры №1-6 реализации способа. В примерах использованы следующие варианты сред.

Среда №1а для инкубации семян, содержащая, мг/л:

KNO3	900
NH4NO 3	800
MgSO 4×7H2O	180
Сахароза	4500
Агар	6950
Вода	Остальное

Среда №1б для инкубации семян, содержащая, мг/л:

KNO3	1000
NH4NO 3	850
MgSO 4×7H2O	190
Сахароза	5500
Агар	7050
Вода	Остальное

Среда №2а для дополнительной подготовки эксплантов, агаризованная модифицированная питательная среда МС, дополненная, мг/л:

Нафтилуксусная кислота	1,9
Кинетин	3,9
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	0,098
Агар	6950

Среда №2б для дополнительной подготовки эксплантов, агаризованная модифицированная питательная среда МС, дополненная, мг/л:

Нафтилуксусная кислота	2,1
Кинетин	4,1
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	0,11
Агар	7050

Среда №3а для инкубации подготовленных эксплантов, агаризованная модифицированная питательная среда МС, при содержании, мг/л:

ZnSO4×4H 2O	9
Н 3BO4	17
Тиамин-HCl	9,5
6-бензиламинопурин	1
Агар	6950

Среда №3б для инкубации подготовленных эксплантов, агаризованная модифицированная питательная среда МС, при содержании, мг/л:

ZnSO4×4Н 2О	10
Н 3BO4	19
Тиамин-HCl	10,5
6-бензиламинопурин	2
Агар	7050

Пример 1. Семена льна-долгунца сорта Белоснежка инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 20 часов на агаризованной питательной среде №2а, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 2. Семена льна-долгунца сорта Белоснежка инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 70 часов на агаризованной питательной среде №2б, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов.

Пример 3. Семена льна-долгунца сорта А-29 инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 20 часов на агаризованной питательной среде №2а, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 4. Семена льна-долгунца сорта А-29 инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 70 часов на агаризованной питательной среде №2б, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов.

Пример 5. Семена льна-долгунца сорта Ленок инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 20 часов на агаризованной питательной среде №2а, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 6. Семена льна-долгунца сорта Ленок инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 70 часов на агаризованной питательной среде №2б, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов. Ниже приведены примеры №7-12, показывающие, что без дополнительной подготовки эксплантов способ показывает плохие результаты.

Пример 7. Семена льна-долгунца сорта Белоснежка инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 8. Семена льна-долгунца сорта Белоснежка инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов.

Пример 9. Семена льна-долгунца сорта А-29 инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 10. Семена льна-долгунца сорта А-29 инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов.

Пример 11. Семена льна-долгунца сорта Ленок инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 12. Семена льна-долгунца сорта Ленок инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов.

Пример 13 (по прототипу). Семена льна-долгунца сорта А-29 инкубируют in vitro в темноте течение 14 суток на агаризованной питательной среде МС, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде 4-6 мм сегментов гипокотилей, затем экспланты до получения побегов инкубируют на свету на агаризованной питательной среде МС дополненной 6-бензиламинопурином - 1 мг/л и нафтилуксусной кислотой 0,05 мг/л.

Результаты, плученные по примерам 1-13, приведены в таблице.

Таблица
	Сорт	Номер примера	Общая частота побегообразования, * %	Частота побегообразования вокруг раневой поверхности, ** %
Пример по изобретению	Белоснежка	1	91	91
		2	64	64
	А-29	3	124	124
		4	72	72
	Ленок	5	81	81
		6	57	57
Пример без дополнительной инкубации на среде №2 для подготовки эксплантов	Белоснежка	7	21	21
		8	11	11
	А-29	9	31	31
		10	12	12
	Ленок	11	9	9
		12	10	10
Пример по прототипу	А-29	13	95	4
* Общая частота побегообразования определяется следующим образом: отношение количества образовавшихся побегов к общему количеству эксплантов, умноженное на 100%.
** Частота побегообразования вокруг раневой поверхности определяется следующим образом: отношение количества образовавшихся побегов вокруг раневой поверхности к общему количеству эксплантов, умноженное на 100%.

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что способ согласно изобретению позволяет в 18-30 раз повысить частоту побегообразования вокруг раневой поверхности, что имеет существенное значение при использовании этого способа при проведении генетической трансформации при помощи Agrobacterium tumefacience, так как перенос генов осуществляется в клетки вокруг раневой поверхности. Снижается трудоемкость способа за счет исключения операции по специальной обработке для увеличения раневой поверхности путем удаления части эпидермиса. Способ согласно изобретению прост в использовании и высокотехнологичен.

В результате способа согласно изобретению общая частота побегообразования зависит от генотипа, однако для всех сортов при реализации способа согласно изобретению были получены высокие значения общей частоты побегообразования, получаемые побеги высокого качества, все результаты стабильны и воспроизводимы.