способ определения биологической активности (токсичности) компонентов твердых материалов и ее воздействия на особи живых организмов

Формула изобретения

1. Способ определения биологической активности (токсичности) компонентов твердых материалов и ее воздействия на особи живых организмов, включающий выбор неселективного биотеста из одной партии каждого вида «i» живых организмов, из установленного перечня, адаптацию биотеста к условиям эксперимента, приготовление тестируемых сред, которыми являются термодинамически равновесные растворы, полученные известными методами при фиксированных условиях (температура, давление, соотношение фаз и др.) из исследуемого твердого материала с использованием выбранного растворителя, которым может быть дистиллированная вода, незагрязненная вода из привычной среды обитания живых организмов данного вида или водные растворы, широко используемые для введения особям живых организмов лекарственных препаратов, например физиологический раствор, а контрольной средой является тот же выбранный растворитель или термодинамически равновесный раствор, полученный из выбранного растворителя, и тот же твердый материал, предварительно отмытый от растворимых токсичных соединений, помещение биотеста одновременно в тестируемые и контрольные объекты или введение известными методами в организм биотеста тех же тестируемых и контрольных растворов, выдерживание биотеста одновременно при тождественных условиях в тестируемых и контрольном объектах или с введенными в организм растворами в течение заданного времени, необходимого для достижения не менее 5% различий токсичности (биологического эффекта) от воздействия наиболее разбавленного раствора для каждого применяемого биотеста, измерение наиболее чувствительного параметра (отклика) биотеста на воздействие компонентов в тестируемом и контрольном объектах, для каждой новой партии применяемого биотеста и с каждой серией измеряемых тестируемых проб проверяют соблюдение экспоненциальной зависимости биологического эффекта «В_e,i» от концентрации «С» водного раствора сульфата меди, для этого особи биотеста выдерживают не менее чем в пяти водных растворах сульфата меди и дистиллированной воды или с введенными в организм теми же растворами, определяют биологический эффект B_e,i - относительный отклик биотеста в растворах сульфата меди к контролю, строят графическую зависимость B_e,i(C) и при соблюдении экспоненциальной зависимости

B_e,i =100e_i ^-kC, /1/

определяют другие критерии выживаемости особей живых организмов в растворах сульфата меди - коэффициент биологической активности сульфата меди «k_i» по отношению к выбранному неселективному биотесту по формуле

k_i =(1/С)ln(100/B_e,i) /2/

и биологическую активность растворов сульфата меди «B_a,i » по воздействию на неселективный биотест как произведение коэффициента биологической активности на концентрацию индивидуального соединения, например сульфата меди, B_a,i,j=k _jC /3/

или из соотношения

В _a,i=ln(100/B_e,i), /4/

затем определяют экспериментально биологический эффект от воздействия компонентов в исследуемых равновесных растворах с твердым материалом «B_e,i,s», затем рассчитывают биологическую активность компонентов в равновесных растворах с твердым материалом «B_a,i,s» по формуле /4/, а затем рассчитывают биологическую активность компонентов в твердом материале «(B _a,i)_hard» по формуле /5/

(B _a,i)_hard=(V_s /m_hard)ln(100/B_e,i,s ) /5/

с использованием соотношений объема растворителя (V_s) и массы твердого материала (m _hard), взятых при получении равновесных растворов, и рассчитывают биологический эффект воздействия на биотест загрязняющих веществ в твердом материале «(B_e,i) _hard» по формуле

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для ускорения процесса растворения токсичных соединений твердый материал измельчают и в процессе получения термодинамически равновесных растворов перемешивают растворитель с твердым материалом.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что получение равновесного раствора и определение критериев выживаемости особей биотеста проводят при температуре 25°С.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что время экспозиции различных биотестов в тестируемом и контрольном растворах устанавливается одинаковым.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области токсикологии, фармакологии, санитарии, медицины, экологии, контроля качества продуктов питания, строительных и др. материалов и может быть использовано для определения токсичных свойств водорастворимых соединений в твердых материалах, а также диагностики величины негативного воздействия их на живые организмы.

Известен способ определения общей токсичности почв и других твердых материалов с помощью люминесцентного бактериального теста и измерительного прибора серии «Биотокс», основанный на определении изменения интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма при воздействии токсичных веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем// Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминесценции бактерий. Методические рекомендации. Минздрав России, М. 2000 г., 21 С.; Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста. Методические рекомендации. Минздрав России, М. 2000 г., 18 С. Образцы проб почвы или других твердых материалов высушивают при 105°С в течение одного часа, растирают в ступке, просеивают через сито с отверстиями в 3 мм, тщательно перемешивают и берут навески (не менее 5 г), помещают в коническую колбу, приливают 5-кратный объем дистиллированной воды, взбалтывают в течение 5 минут и оставляют для экстракции на 24 часа. Через 24 часа экстракт фильтруют через бумажный фильтр - белая, красная ленты (в случае мутной надосадочной жидкости) и тестируют на токсичность. Критерием токсичности водного раствора является величина «Индекса токсичности», обозначаемого символом «Т», Т=(I_o-I)/I _o, где I_о, I соответственно интенсивность свечения бактерий в контроле и в анализируемой пробе. По величине индекса токсичности анализируемые пробы классифицируют на три группы: «допустимая степень токсичности» (Т<20), «образец токсичен» (20<Т<50), «образец сильно токсичен» (Т>50).

Основные недостатки способа заключаются в том, что выдерживание твердых материалов с дистиллированной водой без перемешивания требует большой длительности (в течение 24 часов) или 3 часов с перемешиванием на аппарате встряхивания, не гарантирует установления термодинамического равновесия между твердыми материалами и водным раствором и приводят к диффузии из почвы естественных органических примесей типа фульвокислот, гуминовых кислот и т.д., которые сами являются токсикантами, а выбранный критерий (индекс токсичности) является малоинформативным. Кроме того, критерии «токсичность» и «индекс токсичности» являются неудачными по существу, так как в предложенной интерпретации величина «Т» характеризует концентрацию раствора, которая приводит к изменению относительной интенсивности биолюминесценции микроорганизмов. Эти величины имеют мало понятный смысл, который лишь косвенно связан с токсичными свойствами компонентов в растворе.

Известен способ оценки «токсичности» на основе статистической обработки результатов биоиндикации. Пробитный анализ оценки токсичности// [Унифицированные методы исследования качества воды. М.: СЭВ, 1983, с.232-245]. При этом в качестве критерия токсического действия испытуемого вещества различной концентрации определяют летальность подопытных живых организмов в системе координат "концентрация вещества - процент смертности". Такой подход позволяет достаточно надежно устанавливать значение концентрации токсического вещества, при которой погибает 50% испытываемых живых организмов (LC₅₀). Способ включен в Американские и международные стандартные методы определения «токсичности».

Существенными недостатками этого способа является ограниченность статистической достоверности результата для получения плавных кривых, что приводит к необходимости применения вычислительных методов, которые, по мнению авторов, позволяют получить объективные данные. Однако главный недостаток способа состоит в том, что он позволяет определять только величину концентрации токсического вещества, при которой погибает 50% испытываемых организмов (LC₅₀), но не является строгой характеристикой токсичности среды, а на конечный результат влияют многочисленные факторы, которые трудно учесть в эксперименте (негомогенность биологического материала, колебание температуры среды, возраст и пол особей биотеста, значение рН и прочие параметры).

Известен способ определения предельно допустимой (безвредной) концентрации (ПДК) химических веществ и концентрации индивидуальных соединений в твердых материалах, основанный на принципе порога действия вне зависимости от характера действия (общетоксического, раздражающего, канцерогенного, мутагенного, аллергического и т.п.) и нахождении концентрации или дозы веществ, вызывающих гибель 50% особей живых организмов (ЛС₅₀ или ЛД₅₀) [Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. Л. Химия, 1985, 528 с.]. Основная последовательность действий заключается в размещении подопытных животных в затравочных камерах, обеспечивающих достаточную подвижность животных, оптимальный воздухообмен, очищенный от примесей, при температуре 20-25°С и влажность 70-75%. Необходимую концентрацию химических веществ создают с помощью специальных дозаторов, тип и конструкция которых зависит от агрегатного состояния вещества и особенностей их физических и химических свойств. Действие вещества изучается в 4-месячном эксперименте.

Недостатки способа заключаются в трудности эмпирического подбора диапазона и исследуемых концентраций химического вещества, требующих постановки специальных прикидочных опытов, ограниченной объективности оценок специфичности воздействия только испытуемого вещества на испытуемый объект, так как в любом твердом объекте всегда присутствует множество загрязняющих компонентов. Кроме того, с воздухом и пищей могут поступать в испытуемый живой организм другие загрязняющие вещества, большой длительности испытаний и высокой стоимости всего цикла исследования и неоднозначность полученных результатов для каждого вида живых организмов. Вызывает сомнение, что для все людей независимо от пола, возраста, климатических, географических и социальных условий жизни и других факторов может существовать единая величина ПДК.

Наиболее близким аналогом изобретения является «Способ количественного определения биологической активности (токсичности и стимулирующей способности) тестируемых объектов с использованием биосенсоров». Патент на изобретение №2215291, заключающийся в подготовке образцов биосенсоров, исследуемых и контрольных объектов, который включает стадии выбора биосенсора из одной партии, адаптации его к условиям эксперимента и выдерживания одновременно при тождественных условиях в тестируемом и контрольном объектах в течение заданного времени, измерения наиболее чувствительного параметра (отклика) к воздействию на биосенсор компонентов в тестируемом объекте, нахождения зависимости относительного отклика биосенсора от концентрации компонентов в тестируемом объекте, определение коэффициента биологической активности, а затем биологической активности (токсичности) компонентов в тестируемом объекте.

Основной недостаток способа связан с тем, что с его помощью невозможно прямое определение суммарного загрязнения твердых материалов и нахождение критериев воздействия загрязняющих веществ в твердом материале на живые организмы.

Целью предлагаемого изобретения является возможность создания способа определения суммарной токсичности водорастворимых соединений в твердых материалах и диагностики ее негативных последствий для особей живых организмов.

Под неселективными биотестами понимают особи живых организмов (растительного или животного происхождения) различного вида или отдельные их части, которые в присутствии любых токсичных веществ в тестируемой среде дают отклик - изменение линейных размеров, численности, биомассы, теплопроводности, электропроводности, диэлектрической проницаемости, интенсивности выделения или поглощения энергии, например свечения и т.д. Во всех случаях эксперимент проводят одновременно в загрязненной и незагрязненной (контрольной) среде, а в расчетах используют отношение отклика биотеста в тестируемой среде к контрольной, которое обычно выражают в процентах.

В основу предлагаемого способа положены известные представления о механизме поступления токсикантов в живой организм из твердых материалов через промежуточную стадию растворения в воде, а также методы физической химии, касающиеся закономерностей распределения водорастворимых веществ между жидкой и твердой фазами с последующим проявлением негативного воздействия растворенных соединений в водном субстрате на живые организмы с летальным исходом.

Для определения параметров выживаемости особей живых организмов от воздействия на живые организмы токсичных компонентов используют термодинамически равновесные водные растворы с тестируемым твердым материалом, которые воспроизводимо характеризуют их качественный и количественный состав.

Под твердыми материалами подразумеваются лекарственные препараты, продукты питания, почву, донные отложения, твердые аэрозольные частицы, строительные материалы и т.д.

Поставленная цель достигается тем, что при определении суммарной токсичности твердых материалов сначала получают раствор или термодинамически равновесный раствор между компонентами твердых материалов и выбранным растворителем при фиксированной условиях: температура, соотношение твердой и жидкой фаз, степень измельчения, и т.д.

В качестве детекторов суммарной токсичности равновесных водных растворов используют неселективные биотесты. Под неселективными биотестами подразумевают любые виды живых организмов или частей организма, которые в зависимости от содержания любых водорастворимых токсичных соединений в равновесном водном растворе проявляют «реакцию» или дают «отклик» в виде изменения линейных размеров, численности, биомассы, теплопроводности, электропроводности, диэлектрической проницаемости, интенсивности выделения или поглощения энергии, например свечения и т.д. Во всех случаях эксперимент проводят одновременно в загрязненной и незагрязненной (контрольной) среде, а в расчетах используют отношение отклика биотеста в тестируемой среде к контрольной, которое обычно выражают в процентах.

Для определения токсичных свойств водорастворимых соединений в твердых материалах для неселективаных биотестов «i» - представителей особей каждого вида живых организмов определяют параметры выживаемости в тестируемой среде: коэффициент биологической активности индивидуального соединения «k_i» - специфический параметр, характеризующий воздействие каждого индивидуального соединения на исследуемый неселективный биотест, биологический эффект «B _e,i» - параметр, характеризующий относительный отклик или относительную выживаемость неселективного биотеста - процент или долю выживших особей живых организмов в тестируемой среде относительно контроля и биологическую активность или токсичность компонентов тестируемой среды - специфический параметр для каждого вида неселективного биотеста, характеризующий воздействие любых индивидуальных соединений или их смесей с проявлением строго фиксированного биологического эффекта.

Сущность изобретения сводится к следующему.

1. Способ определения биологической активности (токсичности) компонентов твердых материалов и ее воздействия на особи живых организмов, включающий выбор неселективного биотеста из одной партии каждого вида «i» живых организмов, из установленного перечня, адаптацию биотеста к условиям эксперимента, приготовления тестируемых сред, которыми являются термодинамически равновесные растворы, полученные известными методами при фиксированных условиях (температура, давление, соотношение фаз и др.) из исследуемого твердого материала с использованием выбранного растворителя, которым может быть дистиллированная вода, незагрязненная вода из привычной среды обитания живых организмов данного вида или водные растворы, широко используемые для введения особям живых организмов лекарственных препаратов, например физиологический раствор, а контрольной средой является тот же выбранный растворитель или термодинамически равновесный раствор, полученный из выбранного растворителя и тот же твердый материал, предварительно отмытый от растворимых токсичных соединений, помещение биотеста одновременно в тестируемые и контрольные объекты, или введение известными методами в организм биотеста тех же тестируемых и контрольных растворов, выдерживание биотеста одновременно при тождественных условиях в тестируемых и контрольном объектах или с введенными в организм растворами в течение заданного времени, необходимого для достижения не менее пяти процентов различий токсичности (биологического эффекта) от воздействия наиболее разбавленного раствора для каждого применяемого биотеста, измерение наиболее чувствительного параметра (отклика) биотеста на воздействие компонентов в тестируемом и контрольном объекте, для каждой новой партии применяемого биотеста и с каждой серией измеряемых тестируемых проб проверяют соблюдение экспоненциальной зависимости биологического эффекта «B _e,i» от концентрации «С» водного раствора сульфата меди, для этого особи биотеста выдерживают не менее, чем в пяти водных растворах сульфата меди и дистиллированной воды тли с введенными в организм теми же растворами, определяют биологический эффект B_e,i - относительный отклик биотеста в растворах сульфата меди к контролю, строят графическую зависимость В_е,i(С) и при соблюдении экспоненциальной зависимости:

определяют другие критерии выживаемости особей живых организмов в растворах сульфата меди - коэффициент биологической активности сульфата меди «k_i» по отношению к выбранному неселективному биотесту по формуле:

и биологическую активность растворов сульфата меди «В_а,i» по воздействию на неселективный биотест, как произведение коэффициента биологической активности на концентрацию индивидуального соединения, например сульфата меди,

или из соотношения:

затем определяют экспериментально биологический эффект от воздействия компонентов в исследуемых равновесных растворах с твердым материалом «B_{e,i s}», затем рассчитывают биологическую активность компонентов в равновесных растворах с твердым материалом «B_a,i,s» по формуле /4/, а затем рассчитывают биологическую активность компонентов в твердом материале «(B_a,i) _hard, по формуле /5/:

с использованием соотношений объема растворителя (V_s) и массы твердого материала (m _hard), взятых при получении равновесных растворов, и рассчитывают биологический эффект воздействия на биотест загрязняющих веществ в твердом материале «(B_e,i) _hard» по формуле:

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для ускорения процесса растворения токсичных соединений твердый материал измельчают и в процессе получения термодинамически равновесных растворов перемешивают растворитель с твердым материалом.

3.Способ по п.1, 2, отличающийся тем, что получение равновесного раствора и определение критериев выживаемости особей биотеста проводят при температуре 25°С.

4. Способ по п.1, 2, 3, отличающийся тем, что время экспозиции различных биотестов в тестируемом и контрольном растворах устанавливается одинаковым.

Пример 1.

Определение коэффициента биологической активности, биологической активности и биологического эффекта от воздействия CuSO ₄ в почве на рост отрезков колеоптилей пшеницы.

Сущность способа состоит в следующем. Сначала готовят серию навесок стандартной почвы, например, СДПС-1 по 0,5 г, находящихся в равновесии с водными растворами сульфата меди с концентрациями 0,08; 0,2 и 0,39 ммоль/л. После установления равновесия раствор отделяют от почвы на воронке Бюхнера с обеззоленным фильтром «белая лента» по методике, описанной в РД 52.18.86-91. «Методика выполнения измерений массовой доли водорастворимых форм металлов (меди, свинца, цинка, никеля, кобальта, хрома, марганца) в пробах почвы атомно-абсорбционным анализом». М., Госкомгидромет, 1990. Соотношение почва-вода при извлечении равновесной концентрации сульфата меди поддерживают постоянным равным 1:5, а температуру воды и почвы при получении равновесного раствора поддерживают 25°С. В качестве биотеста используют ростовые свойства трех-суточных проростков зерен пшеницы сорта «Заря». Отбирают 25-30 предварительно отделенных от корней и зерновок отрезков колеоптилей одинаковой длины и специальным ножом вырезают участки с постоянной длиной, например, 4 мм, расположенные на 5 мм ниже верхушек. Отрезки колеоптилей помещают в равновесный водный раствор CuSO ₄ с известной концентрацией и выдерживают в термостате без доступа света в течение 24 ч (до достижения предельной величины прироста отрезков колеоптилей), измеряют длину каждого отрезка колеоптиля, рассчитывают среднее значение для каждой серии опытов и биологический эффект от воздействия сульфата меди в равновесном растворе (В_е,р=100 L/L_o ) из отношения средних величин прироста длины отрезков колеоптилей в загрязненной (L) и контрольной (L_o) пробе равновесного водного раствора CuSO₄. По экспоненциальной зависимости: В_е,р=f(С) (см. Фиг.1, кривая 1) с помощью формулы /1/ рассчитывают коэффициент биологической активности равновесного раствора и биологическую активность загрязняющих веществ в равновесных растворах. Затем из соотношения почвы и воды, используемых при получении равновесного раствора рассчитывают биологическую активность (В _а) сульфата меди и биологический эффект от его воздействия на отрезки колеоптилей в почве. Зависимость биологического эффекта от биологической активности воздействия сульфата меди в почве на ростовые свойства отрезков колеоптилей приведена на Фиг.1, кривая 2.

Пример 2

Определение токсичности (биологической активности) чая

Сущность способа состоит в следующем. Навеску 7 г воздушно сухого чая заливают 1 л кипятка, смесь периодически перемешивают в течение 30 мин до установления комнатной температуры. Готовят серию растворов настоя чая, разбавленных дистиллированной водой в соотношении =1:6, 2:5, 3:4, 4:3, 5:2, 6:1. В качестве биотеста используют ростовые свойства трехсуточных проростков зерен пшеницы сорта «Заря». В каждом эксперименте используют 25 отрезков колеоптилей, одинаковой длины, предварительно отделенных от корней и зерновок, специальным ножом вырезают участки длиной, например, 4 мм, расположенные на 5 мм ниже верхушек. Отрезки колеоптилей помещают в 8 специальных ячеек, содержащих 1 мл исходного и разбавленного водой серию настоя чая (тестируемая проба) и 1 мл дистиллированной воды. Все образцы серии одновременно выдерживают в термостате без доступа света в течение 24 ч (до достижения предельной величины прироста отрезков кролеоптилей), измеряют длину каждого отрезка колеоптиля, рассчитывают среднее значение для каждой серии опыта и определяют величину биологического эффекта «B_e» - отношения средних величин прироста длины отрезков колеоптилей в растворах настоя чая (L) и контрольной (L_o ) пробе. По зависимости:

B_e=100L/L _o=f( )

рассчитывают коэффициент биологической активности «k_s» настоя чая к биотесту, который равен k_s=2,133 л^-1 (см. Фиг.2, кривая 1). Затем рассчитывают биологическую активность «В_а» растворов настоя чая из произведения В_а=k_s . Коэффициент биологической активности настоя чая к биотесту «k_s ^tee» рассчитывают из величины «k_s» и соотношения с чая с водой при получении настоя:

k_s ^tee=k_s/7=2,133/7=0,305 г ^-1.

Величину биологической активности биотеста к чаю рассчитывают из соотношения:

B_a =k_s ,

где фактор разбавления настоя чая « » эквивалентен использованию 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 г чая для получения 1 л настоя.

Зависимость биологического эффекта от биологической активности настоя чая и самого чай (см. Фиг.2, кривая 2) имеет тождественный вид:

В_е =100_e ^-B _a.

Пример 3

Определение токсичности (биологической активности) сырого картофеля

К навескам сырого протертого на терке картофеля массой 2,0 г, содержащего 75% воды, 14,24% крахмал, 2% протеина, 1% клетчатки и 1% сухого остатка, добавляют 6 мл дистиллированной воды. Смесь выдерживают в течение 1 мин и отделяют жидкую фазу фильтрованием на воронке Бюхнера через бумажный обеззоленный фильтр «белая лента».

В качестве биотеста используют ростовые свойства трехсуточных проростков зерен пшеницы сорта «Заря». В каждой серии опытов отбирают образцы проростков одинаковой длины по 25 отрезков колеоптилей, предварительно отделенных от корней и зерновок, специальным ножом вырезают участки длиной 4,0 мм, расположенные на 5 мм ниже верхушек.

Отрезки колеоптилей помещают в 5 специальных ячеек, содержащих по 1 мл водного фильтрата и 1 мл дистиллированной воды, выдерживают в термостате без доступа света в течение 24 ч (до достижения предельной величины прироста отрезков колеоптилей), измеряют длину каждого отрезка колеоптиля, рассчитывают среднее значение для каждой серии опыта и определяют величину биологического эффекта «B _e» - отношения средних величин прироста длины отрезков колеоптилей в растворах фильтрата от 4 образцов картофеля (L) и контрольной (L_o) пробе. По зависимости (см. Фиг.3):

B_e=100L/L _o=f(C),

где С-содержание фильтрата (л) от 1 г сухого картофеля рассчитывают коэффициент чувствительности «k _s» биотеста 5,339 л/г сухого картофеля. Затем рассчитывают биологическую активность «В_а» фильтратов из произведения В_а=k_s С и находят зависимость биологического эффекта от биологической активности токсичных примесей в сыром картофеле (Фиг.3, кривая 2).

Пример 4.

Определение токсичных свойств технического гиприна

Образцы технического гиприна были получены с Волжского гидролизно-дрожжевого завода. Этот препарат характеризуется явно выраженными аллергическими и токсичными свойствами. Подготовка гиприна к эксперименту включала непрерывное перемешивание навески препарата в 10 г в конической колбе с 250 мл дистиллированной воды в течение 2 ч, отделение полученного термодинамически равновесного раствора (раствор №1) от твердого материала фильтрованием на воронке с беззольным фильтром «белая лента». Затем белковый препарат на фильтре промывали 250 мл дистиллированной воды, переносили в коническую колбу, заливали 250 мл дистиллированной воды, смесь перемешивали в течение 2 ч и отделяли термодинамиченски равновесный раствор (раствор №2) от твердого материала на воронке с беззольным фильтром «белая лента». Необходимость получения двух равновесных растворов из одной пробы была связана с тем, что предварительными опытами было установлено присутствие неорганических компонентов в техническом гиприне, среди которых были идентифицированы (мг/г гиприна): железо - 1,52; калий - 7,38; кальций - 6,926; марганец - 3,476; медь - 0,321 и цинк - 1.356. В растворе №2 эти соединения отсутствовали. Затем из растворов №1 и 2 отбирали пробы раствора и разбавляли дистиллированной водой для получения равновесных растворов, соответствующих 5, 10, 20, 30 и 40 г гиприна/л воды. Каждый раствор в трех повторностях исследовали на токсичность с использованием в качестве биотеста отрезками колеоптилей пшеницы. Процедура подготовки и проведения эксперимента биотестирования не отличалась от описанной в Примере 1. Из приведенных на Фиг.4 экспериментальных данных следует, что основной вклад в токсичные свойства технического гиприна вносят неорганические составляющие. При этом рассчитанная по формуле /6/ биологическая активность препарата технического гиприна составляет В_а =2,8×40/1000=0,112, а отмытого от неорганических компонентов В_а=0,238×40/1000=0,095.

Пример 5.

Определение токсичных свойств лекарственного препарата стрептомицина

Навески хлорида стрептомицина 0,050 мг растворяли в 1 л дистиллированной воды и из полученного раствора готовили серию растворов с концентрацией от 0,02 до 2 мкмоль/л. В качестве биотеста использовали биолюминесцирующие микроорганизмы Эколюм-5.

Лиофилизированные люминесцирующие микроорганизмы «Эколюм» хранят в морозильнике при температуре минус (18÷20)°С, а водные растворы «Эколюм» в холодильнике при температуре (2÷4)°С. Допускается хранение и использование микроорганизмов при комнатной температуре не более 24 ч.

Подготовка бактерий «Эколюм» к работе включает:

- приготовление маточного раствора биолюминесцирующих микроорганизмов. Для этого извлекают из морозильника флакон с лиофилизированными микроорганизмами, выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин, добавляют 10 см ³ свежекипяченой и охлажденной до (4÷8)°С дистиллированной воды с рН (5,5÷6,5). Для получения гомогенного маточного раствора флакон с люминесцирующими микроорганизмами и водой энергично взбалтывают и выдерживают при комнатной температуре (20±2°С) в течение 30 мин, затем перед отбором пробы на анализ дополнительно перемешивают. Допускается использование маточного раствора «Эколюм» в течение 2-3 суток при хранении в холодильнике при температуре (2÷4)°С. Перед отбором пробы на анализ маточный раствор выдерживают в комнате до достижения температуры (20±2)°С. Затем измеряют фоновое значение люминометра «Skalar Tox Tracer» по инструкции по эксплуатации прибора (при счете 10 с, без кюветы) и записывают результат. В кювету для измерения биолюминесценции пипеткой вводят 0,1 см³ маточного раствора биотеста, добавляют 0,9 см³ свежекипяченной и охлажденной до комнатной температуры (20±2)°С дистиллированной воды и измеряют интенсивность биолюминесценции. Увеличение интенсивности биолюминесценции по отношению к фоновому значению прибора должно находиться в диапазоне (25-250) имп/с.

При определении интенсивности биолюминесценции «Эколюм» необходимо проводить измерения в последовательности контрольная (I _о) и эталонная (I) пробы не менее пяти раз.

В кюветы для эталонной пробы вводят по 0,1 см³ рабочего раствора «Эколюм», добавляют 0,9 см³ свежекипяченной охлажденной до (20±2)°С дистиллированной воды или эталонной пробы. Засекают время по секундомеру и записывают его в журнал. Помещают кювету в измерительную ячейку люминометр «Skalar Tox Tracer» и через 30 мин после введения воды в кювету измеряют интенсивность биолюминесценции.

При определении интенсивности биолюминесценции «Эколюм» необходимо проводить измерения в последовательности контрольная (I_о) и тестируемая (I) проба не менее пяти раз. Биологический эффект рассчитывают как отношение: B_e=100I/I_o. Результаты измерений, приведенные на Фиг.5, указывают, что стрептомицин характеризуется высокой биологической активностью (коэффициент биологической активности составляет 265 ммоль/л) и при концентрации 2 мкмоль/л вызывает биологический эффект 59%.

Пример 6.

Определение биологической активности почвы в районе свинцово-цинкового комбината

В результате многолетней эксплуатации и рассеяния выбросов комбината цветных металлов произошло загрязнение почвы и в пробе почвы, отобранной на расстоянии 450 м от границы комбината, присутствовали соединениями свинца, цинка, меди и кадмия, достигающие концентрации, соответственно 20; 12; 0,98 и 0,38 г/кг почвы. Равновесные водные растворы с образцом почвы получали при соотношении почва-дистиллированная вода, равном 1:5 по методике, описанной в Примере 1. Контрольные образцы готовили с использованием равновесного раствора, полученного с дистиллированой водой и тщательно отмытой от водорастворимых соединений почвы, отобранной на расстоянии 450 м от комбината цветных металлов. Такая процедура позволяла компенсировать воздействие на биотест органических составляющих почвы (гуминовых кислот, фульфокислот и т.д.). Помимо ростовых свойств отрезков колеоптилей пшеницы в качестве биотестов использовали генетически выравненные особи мышей (массой 20 г), кроликов (массой 3000 г) и серых крыс (массой г), которым те же тестируемые и контрольные равновесные растворы вводили через зонд в желудок по 10 мл/особь. Все особи биотестов выдерживали в течение 24 ч.

Для равновесных водных растворов с образцами почвы, отобранными на расстоянии 450 м от комбината, биологический эффект от воздействия суммарных примесей загрязняющих веществ в почве на колеоптили пшеницы, мышей, кроликов и крыс составил 78; 0,007; 0,042 и 0,063%. Этим значениям биологического эффекта (B _e,i,) соответствует рассчитанная по формуле /5/ биологическая активность компонентов в растворе «B_a,i,s », равная соответственно 0,25; 9,563; 7,775 и 7,370. Из соотношения (B_a,i,s)_soil=(V _s/m_soil)B_a,i,s ) находят значения биологической активности компонентов в почве, которые для колеоптилей пшеницы, мышей, кроликов и крыс равны соответственно 0,05; 1,913; 1,555 и 1,474, а биологический эффект или процент выживших особей от воздействия компонентов в почве, рассчитанный по формуле /7/, составляет 95; 14,8; 21,1 и 22,9%.

Источники информации

1. Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста. Методические рекомендации. Минздрав России, М. 2000 г., 18 С.

2. Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминесценции бактерий. Методические рекомендации. Минздрав России, М. 2000 г., 21 С.

3. Унифицированные методы исследования качества воды. М.: СЭВ, 1983, с.232-245.

4. Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. Л. Химия, 1985, 528 с.

5. Патент RU (11) 2215291 (13) С1 Выдан 27.10.2003, Бюл. №30, Приоритет от 06.08.2002.