способ удаления клеток с чужеродного материала для получения биопротезов и аппарат для его осуществления

Формула изобретения

1. Способ удаления клеток с аллогенного и ксеногенного чужеродного материала при использовании биодетергентов для получения биопротезов, покрытых эндогенными клетками реципиента протеза, отличающийся тем, что чужеродный материал сначала обрабатывают желчной кислотой для уничтожения клеток и для покрытия клеток, а также для разрушения связей с тканевым матриксом, затем обрабатывают спиртом для более полной гибели клеток, причем после каждого из этих этапов проводят этап промывки и, по крайней мере, последний этап промывки проводят в потоке среды для механического воздействия на тканевый матрикс и клетки силами потока.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что поток среды является пульсирующим.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для открепления клеток желчной кислотой используют обволакивающую клетки дезоксихолевую кислоту.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что используют дезоксихолевую кислоту с концентрацией от 1 до 2%.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для уничтожения клеток, используют спирт с концентрацией от 30 до 60%.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что используют 40% спирт.

7. Способ по п, 1, отличающийся тем, что в качестве промывочной среды используют фосфатный буферный раствор.

8. Способ по пп.1-7, отличающийся тем, что обработка дезоксихолевой кислотой в неподвижной среде занимает до 24 ч, обработка спиртом занимает около 20 мин, а промывка занимает около 60 мин.

9. Способ по пп.1-7, отличающийся тем, что обработку чужеродного материала в дезоксихолевой кислоте и/или спирте, и/или промежуточный промывочный цикл проводят в пульсирующем потоке среды, который близок к естественным условиям потока в соответствующем органе.

10. Способ по пп.1 и 9, отличающийся тем, что скорость текущей среды можно изменять.

11. Способ по пп.1, 9 и 10, отличающийся тем, что текущую промывочную среду обновляют постоянно или периодически.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что концентрация потока детергента постепенно снижается.

13. Способ по любому из пп.1 и 9-12, отличающийся тем, что предназначенный для обработки чужеродный материал держат в предварительно натянутом состоянии в потоке соответствующей среды в направлении движения потока.

14. Аппарат для обработки чужеродного материала в потоке среды, включающий кольцевую линию (1) с присоединенным к ней для генерирования пульсирующего потока среды насосом (3) и разъемно соединенную с кольцевой линией (1) камеру (2) для удаления клеток, в которой предназначенный для обработки аллогенный или ксеногенный чужеродный материал (8) может быть зафиксирован в предварительно натянутом состоянии вдоль направления движения потока обрабатывающей среды с помощью разъемно соединенных с камерой (2) для удаления клеток адаптеров (10, 11), имеющих фиксирующие участки (14, 15) и фитинги (12, 13) для соединения с кольцевой линией (1), для осуществления способа по пп.1-13.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу удаления клеток с аллогенного и ксеногенного чужеродного материала при использовании биодетергентов для получения биопротезов, покрытых эндогенными клетками реципиента протеза.

Требовалось получить "бесклеточную" структуру, свободную от чужеродных клеток, для предотвращения иммунологических реакций и обеспечения роста и регенерации вновь основанных эндогенных клеток с целью получения биопротезов из аллогенного и ксеногенного чужеродного материала, покрытого эндогенными клетками последующего реципиента. Однако известные способы очистки от клеток и применения биодетергентов не полностью позволяют экстрагировать чужеродный клеточный материал из тканевого матрикса, в связи с этим нельзя исключить вирусные - пока неизвестные - эффекты, например, от вирусов, содержащихся в тканях свиньи.

Способ, относящийся к аллогенному препарату, описан в патенте RU 2137486. В частности, этот документ описывает аллогенный препарат плаценты человека (ткани), который содержит белки плаценты и глюкозаминогликаны в растворе с глицерином и водой. Этот препарат получают путем полного разрушения структуры ткани, так как биологический материал - ткань плаценты - гомогенизируют и экстрагируют.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа удаления клеток с чужеродного материала, предназначенного для покрытия эндогенными клетками, и этот способ должен обеспечивать полное, но бережное удаление клеток с чужеродной ткани.

Эта задача решается, согласно изобретению, способом, характеризующимся признаками, описанными в п.1 формулы изобретения.

Другими словами, идеей изобретения является удаление чужеродных клеток с исходного аллогенного или ксеногенного продукта, предназначенного для покрытия эндогенными клетками, это удаление осуществляется с помощью комбинированной обработки желчной кислотой, спиртом и промежуточного или последующего этапов промывки с механическим воздействием текущей среды на тканевый матрикс и удаляемые клетки, по крайней мере, на последнем этапе промывки.

Желчная кислота, предпочтительно используемая в виде дезоксихолевой кислоты, вызывает постепенное или, при механическом воздействии, ускоренное покрытие клеток кислотой для создания разделяющего слоя между матриксом из коллагена и эластина (здесь и далее именуемым "коллагеновым матриксом") и клеткой и для открепления клетки от матрикса. В то же время, дезоксихолевая кислота оказывает цитолитическое действие. Открепившиеся клетки и дезоксихолевая кислота отмываются на последующем этапе отмывки. Последующая обработка спиртом, предпочтительно этанолом или пропанолом, позволяет полностью освободиться от остатков дезоксихолевой кислоты, хорошо растворимой в спирте. Остаточная дезоксихолевая кислота, которая может присутствовать, открепляет все клетки, оставшиеся на матриксе, в то время как спирт оказывает цитоцидный и антивирусный эффект. Последующий последний этап отмывки осуществляется преимущественно пульсирующим потоком, силы которого с одной стороны действуют на стенки соответствующей части органа и расправляют матрикс, с другой стороны оказывают прямое механическое воздействие на остаточные клетки и удаляют их с расправленного матрикса.

Другие или все этапы способа могут быть также связаны с механическим воздействием с помощью предпочтительно пульсирующего потока соответствующей среды. Так, пульсирующий поток упомянутой выше дезоксихолевой кислоты приводит к более быстрому образованию разделяющего слоя между клеткой и коллагеновым матриксом благодаря движению и расправлению матрикса, что делает открепление клетки более легким благодаря силам, действующим на нее.

В подпунктах и последующем описании варианта осуществления изобретения описаны другие свойства и преимущественные усовершенствования изобретения.

При использовании предложенного способа можно обеспечить получение бесклеточных исходных продуктов, свободных от любого клеточного материала и вирусов, то есть частей органов, таких как сердечные клапаны или сосуды, для производства биопротезов путем последующего покрытия этих продуктов эндогенными клетками соответствующего реципиента.

Аппарат для обработки частей органов, состоящих из чужеродного материала, в текущей среде включает в себя камеру для удаления клеток, в которую помещают соответствующую часть органа, и насос, создающий поток среды, оба этих узла последовательно включены в кольцевую линию. Кольцевая линия включает входной и выходной клапаны для подачи и отвода соответствующей среды для обработки. Камера для удаления клеток разъемно соединена с кольцевой линией таким образом, что камеру и вместе с ней находящуюся в среде часть органа можно перемещать. Часть органа, подлежащую обработке, фиксируют в емкости путем пришивания к адаптерам, выполненным соответствующим части органа образом, с предварительным натяжением вдоль направления потока.

Подобный аппарат описан в US 5846828. Этот документ описывает аппарат для стерилизации, заселения клетками, хранения, перевозки и проверки сердечных клапанов, но он не включает удаления клеток с сердечных клапанов и сосудов в отличие от настоящего изобретения.

Вариант осуществления изобретения поясняется ниже более подробно со ссылкой на чертежи, где:

На Фиг.1 показан аппарат для удаления клеток с сердечного клапана в циркуляционном контуре;

На Фиг.2 показано сечение камеры для удаления клеток, включенной в циркуляционный контур и содержащей сердечный клапан;

На Фиг.3а показано микроскопическое сечение стенки клапана аорты, очищенного от клеток при помощи способа согласно изобретению; и

На Фиг.3b показан увеличенный вид медиального сечения ткани стенки клапана аорты согласно Фиг.3а.

В описанном здесь варианте осуществления изобретения клапан аорты свиньи, взятый на бойне, освобождают от жира, обрезают до нужного размера, измеряют и проверяют на микроорганизмы (грибы, аэробные и анаэробные бактерии, микоплазму). Промежуточное хранение при максимальной температуре 4°С не должно превышать семи дней.

Полученный таким способом сердечный клапан помещают в раствор дезоксихолевой кислоты концентрации от 1 до 2% (или желчной кислоты с аналогичным эффектом) и выдерживают в нем 24 часа при 37°С. Дезоксихолевая кислота способна образовывать так называемые аддукты с жирной кислотой в виде соединений включения, в результате чего дезоксихолевая кислота может обволакивать клетку со всех сторон, растворяя, таким образом, связи клетки с тканевым матриксом. В то же время, дезоксихолевая кислота обладает цитоцидным эффектом.

Затем сердечный клапан, обработанный таким способом, промывают при одновременном движении сердечного клапана в ряде разведений фосфатного буферного раствора (ФБР) при постоянно уменьшающихся концентрациях для удаления клеток, обработанных дезоксихолевой кислотой, с тканевого матрикса.

На последующем третьем этапе сердечный клапан обрабатывают при комнатной температуре в течение примерно 10 минут в 40% спирте для получения антивирусного эффекта и уничтожения любых оставшихся клеток на коллагеновой структуре. Так как спирт является хорошим растворителем, он при этом отмывает остатки кислоты и открепляет клетки.

Сердечный клапан снова промывают в другом наборе фосфатного буферного раствора (ФБР) и затем обрабатывают механически в пульсирующем потоке ФБР. Пульсирующий поток ритмично расширяет сердечный клапан, зафиксированный с предварительным натяжением в камере для удаления клеток и обтекаемый в продольном направлении потоком, который при этом оказывает на него механическое воздействие. На этом этапе с коллагенового матрикса механически открепляются оставшиеся клетки, таким образом, получают бесклеточную структуру, с которой удален весь клеточный материал и которая не может содержать каких-либо вирусов. Обработанный таким способом тканевый матрикс сердечного клапана, свободный от клеток и среды, использованной для удаления клеток (как показано на Фиг.2), прекрасно подходит для повторного покрытия его эндогенными эндотелиальными клетками будущего реципиента биопротеза; этот биопротез можно имплантировать в тело человека без риска возникновения иммунологических реакций или влияния вирусов.

Изобретение не ограничивается описанным здесь вариантом обработки как в части, касающейся типа и происхождения чужеродного материала, используемого для получения биопротеза, так и в части параметров процесса, поскольку основные этапы способа, то есть обработка в образующей аддукт желчной кислоте и спирте с промежуточной и последующей промывкой выполняются в сочетании с обтеканием соответствующей части органа предпочтительно пульсирующим потоком с целью мягкого механического воздействия на ткань. Способ можно также осуществить, выполняя не только последний этап промывки, но и, вместо него или в дополнение к нему, другие или все этапы обработки в текущей среде. Это механически поддерживает возможность соответствующей среды обеспечивать более полный доступ к клеткам по всей поверхности и легче откреплять или удалять клетки с расправленного коллагенового матрикса за счет силового действия пульсирующего потока.

На Фиг.1 приведен аппарат для удаления клеток с сердечного клапана. Аппарат содержит кольцевую линию 1, в которую включены камера 2 для удаления клеток с расположенным в ней обрабатываемым сердечным клапаном, мембранный насос 3 и расположенная непосредственно за камерой 2 уравновешивающая камера 4. Мембранный насос 3 соединен с приводным узлом (не показан) через шланг 5. Выходной клапан 6 и входной клапан 7, функции которых приблизительно соответствуют функции сердечного клапана, интегрированы в соединения мембранного насоса 3 и кольцевой линии 1. Выходной клапан 6 может не использоваться при обработке сердечных клапанов, так как у них есть заслонки клапана.

Основной частью аппарата является камера 2 для удаления клеток с клапана аорты свиньи 8 при использовании дополнительного эффекта сил потока. Камера 2 для удаления клеток состоит из прозрачного полого цилиндра 9 из пиакрила, в открытых торцевых частях которого герметично зацентрованы и зафиксированы тефлоновые адаптеры 10 и 11, эти адаптеры соединяются с кольцевой линией 1 через фитинги 12, 13, каждый из адаптеров содержит выступающий в полый цилиндр 9 фиксирующий участок 14 или 15 с радиально расположенными по периферии монтажными отверстиями 16, 17 для прочной фиксации клапана аорты 8 в натянутом состоянии на краях торцов. Наружный диаметр обоих фиксирующих участков 14, 15 адаптеров 10, 11 приблизительно соответствует диаметру клапана аорты 8. Задний в отношении направления потока адаптер 11 может быть затянут через буртик 18 и первое уплотнение 27 на внутренней стороне кольцевой кромки 20, соединенной с полым цилиндром 9, в частности с помощью резьбового кольца 21, внутренняя резьба которого взаимодействует с наружной резьбой на адаптере 11. Адаптер 10 включает кольцевой выступ 22, прилегающий к торцу полого цилиндра 9, и может быть стянут с ним с помощью резьбового колпачка 23, внутренняя резьба которого взаимодействует с наружной резьбой на полом цилиндре 9. Для герметизации предусмотрено второе уплотнение 19. Часть шланга кольцевой линии 1, расположенная после камеры для удаления клеток, выполнена из гибкого материала (силикона), что гарантирует протекание за счет пульсирующего характера потока, создаваемого насосом.

Благодаря конструкции и расположению адаптеров 10, 11, описанным выше, подготовленный соответствующим образом клапан аорты 8 можно пришить вне полого цилиндра 9 к противоположным фиксирующим участкам 14, 15 адаптеров 10, 11. Клапан аорты 8, зафиксированный как описано выше, вставляют в полый цилиндр 9. Сначала дезоксихолевую кислоту подают в камеру 2 для удаления клеток и кольцевую линию 1 через входной и выходной клапаны 24, 25 в линии 1 или один из фитингов 13, 14; затем включают мембранный насос 3, при помощи которого пульсирующий поток дезоксихолевой кислоты постоянно течет вокруг или внутри клапана аорты 8, и механическое усилие, вызываемое этим потоком, обеспечивает открепление и удаление клеток, чужеродных реципиенту сердечного клапана. После удаления дезоксихолевой кислоты аппарат заполняют физиологическим раствором или фосфатным буферным раствором и промывают ткань до полного удаления дезоксихолевой кислоты и других токсичных компонентов. После этого этапа промывки следуют обработка клапана аорты 8 спиртом и следующий этап промывки в фосфатном буферном растворе.

Все этапы обработки в способе удаления клеток проводят в описанном выше аппарате при пульсирующем потоке соответствующей среды. Направление потока соответствует естественному направлению потока в имплантированном состоянии биопротеза. Для замены среды используют входной и выходной клапаны 24, 25, однако существует возможность в процессе промывки непрерывно подавать свежий промывочный раствор и удалять отработанный.

При необходимости возможно проведение одного или нескольких этапов обработки при отсоединенных кольцевой линии 1 и мембранном насосе, при отсутствии потока среды через камеру для удаления клеток, которую можно при необходимости поворачивать вручную или при помощи мотора, или, как указано выше, существует возможность проведения отдельных этапов обработки вне камеры для удаления клеток.