способ получения ксенотрансплантатов для офтальмологии

Формула изобретения

Способ получения ксенотрансплантатов для офтальмохирургии, включающий извлечение перикарда крупного рогатого скота, механическую очистку его, отмывку холодной водой, фрагментацию материала с последующей перфорацией, обработку 6%-ным раствором перекиси водорода, обработку спиртом, а также стерилизацию ионизирующим облучением, отличающийся тем, что перикард крупного рогатого скота непосредственно после механической очистки обрабатывают раствором аммиака преимущественно 10%-ным в течение 4-5 ч, затем промывают дистиллированной водой, после чего материал многократно замораживают при температуре -10-12°С и размораживают при температуре 40-45°С, далее материал в течение 7-8 ч обрабатывают 6%-ным раствором перекиси водорода при температуре до 15°С, фрагментируют, фрагментированный материал обрабатывают ультразвуком, повторно в перемешивающем устройстве обрабатывают в 10%-ном растворе аммиака, повторно многократно замораживают-оттаивают, повторно обрабатывают 6%-ной перекисью водорода и промывают дистиллированной водой, после чего материал дегидратируют в спиртах восходящей концентрации от 30 до 70 об.%, раскладывают во флаконы с 70%-ным этиловым спиртом и стерилизуют ионизирующим излучением дозой 1,5 Мрад.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемый способ относится к медицине, более точно к офтальмологии, может быть использован для изготовления ксенотрансплантатов, применяемых в офтальмологии для оперативного лечения прогрессирующей миопии средней и высокой степени, для лечения сухой макулодистрофии и изготовления антиглаукоматозных дренажей.

Ранее для этих целей применяли трупный аллопластический материал: склеру, твердую мозговую оболочку, ахиллово сухожилие, аорту и др., а в качестве гетеротрансплантата - перикард.

Известен способ обработки склеропластического материала, получаемого из соединительной ткани животных и человека, который включает очистку тканей от механических примесей и крови, отмывку холодной водой, нарезку на полоски нужного размера с перфорациями, помещение в 6%-ный раствор перекиси водорода от 1 до 3-х часов, затем в 4М раствор мочевины не менее 15 час, инкубацию в 2М растворе хлорида натрия, отмывку материала, помещение материала в смесь хлороформ : этанол в соотношении 1:1, отмывку водой, лиофилизацию и стерилизацию радиационным методом в дозе 1,7-2,5 Мрад (патент №2234289 от 20.08.2004).

Недостатками этого способа является то, что он не обеспечивает максимальное удаление растворимых белков и гликопротеинов, определяющих антигенные свойства биологического материала, не позволяет исключить присутствие в материале некоторых спор, бактерий и вирусов, а также прионовых белков, вызывающих такие редкие новые заболевания как "коровье бешенство", болезнь Крейнцфельда-Якобса и др.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание безопасного и эффективного гетеропластического материала для лечения прогрессирующей миопии, стабилизации сухой макулодистрофии и изготовления антиглаукоматозных дренажей, в котором будут максимально удалены растворимые белки и гликопротеины, будут отсутствовать споры, бактериии, вирусы и прионовые белки, вызывающие "коровье бешенство", болезнь Крейнцфельда-Якобса и другие редкие новые заболевания, с максимальным снижением антигенных свойств и гарантированной стерильностью биоматериала, которые снижают процент послеоперационных осложнений и гарантируют стабилизацию патологических процессов. Это в свою очередь обеспечивает отсутствие осложнений типа хемозов, тенонитов и иридоциклитов после оперативного использования материалов, стабилизацию прогрессирования миопии средней и высокой степени, стабилизацию патологического процесса на глазном дне при сухой макулодистрофии, нормализацию внутриглазного давления при оперативном использовании дренажа из предлагаемого материала.

Указанный технический результат возможен потому, что предлагаемый способ обеспечивает наиболее полное освобождение перикарда от клеточных элементов, крови, растворимых белков и гликопротеинов за счет механической деструкции белков благодаря 4-кратному замораживанию - оттаиванию материала с обязательным соблюдением температурного режима и обработки материала ультразвуком. Удаление белков и гликопротеинов осуществляется также в результате гидролиза белков за счет обработки материала аммиаком до и после разрезания материала, а в последнем случае с использованием перемешивающего устройства. Следует отметить, что аммиак обеспечивает максимальный гидролиз белков в сравнении с мочевиной. В результате такой обработки в материале на микроскопическом уровне не обнаруживали кровь, пигмент и какие-либо клеточные элементы, а содержание растворимого белка по Лоури-Фолину в вытяжке из материала уменьшалось по сравнению с исходной величиной в 45 раз и составляло 2,7±1,2 мкг/л. Качественная реакция на протеогликаны в полученном материале была отрицательной.

Кроме того, ограниченные сроки доставки материала после забоя животных позволили избежать посмертной деструкции в ткани перикарда, а доставка перикарда в чистых контейнерах уменьшала степень их контаминации микробной флорой.

Способ обеспечивает гарантированное отсутствие не только микробной флоры, но и спор, прионовых белков, вызывающих заболевания типа "коровьего бешенства", в результате обработки материала 6%-ным раствором перекиси водорода до и после нарезания материала, а в последнем случае еще и в перемешивающем устройстве. Повторная обработка перекисью водорода обеспечивает разрушение всей патогенной микрофлоры, поскольку после первой обработки перекисью водорода дальнейшая обработка материала, как правило, идет в нестерильных условиях.

Кроме того, это позволяет уменьшить дозу эффективного облучения для стерилизации материала до 1.5 Мрад и тем самым препятствовать возможному дополнительному разрушению белков, в том числе и увеличению содержания белка в вытяжке из материала и тем самым предотвращать послеоперационные осложнения при использовании материала.

Неиспользование нами хлороформа, в котором при работе с перикардом нет нужды, обеспечивает более экологически чистое производство.

Отсутствие перфораций в материале и нарезание его на мелкие фрагменты не в начале обработки обеспечивает достаточную прочность материала, что существенно для хирурга в ходе операции и может отразиться на результатах операции.

Этот технический результат достигается тем, что в известном способе получения трансплантатов для офтальмохирургии, включающем извлечение перикарда крупного рогатого скота, механическую очистку его, отмывку холодной водой, фрагментацию материала с последующей перфорацией, обработку 6%-ным раствором перекиси водорода, обработку спиртом, а также стерилизацию ионизирующим облучением, дополнительно перикард крупного рогатого скота непосредственно после механической очистки обрабатывают раствором аммиака, преимущественно 10%-ным, в течение 4-5 часов, затем промывают дистиллированной водой, после чего материал многократно замораживают при температуре минус 10÷12°С и размораживают при температуре плюс 40÷45°С, далее материал в течение 7-8 часов обрабатывают 6%-ным раствором перекиси водорода при температуре до плюс 15°С, фрагментируют, фрагментированный материал обрабатывают ультразвуком, повторно в перемешивающем устройстве обрабатывают в 10%-ном растворе аммика, повторно многократно замораживают - оттаивают, повторно обрабатывают 6%-ной перекисью водорода и промывают дистиллированной водой, после чего материал дегидратируют в спиртах восходящей концентрации от 30 до 70 объемных процента, раскладывают во флаконы с 70%-ным этиловым спиртом и стерилизуют ионизирующим излучением дозой 1.5 Мрад.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Извлекают 1 кг перикарда крупного рогатого скота в течение 1 часа после забоя, доставка в контейнерах.

2. Проводят механическую очистку материала от сгустков крови, прилипших частиц и сосудов скальпелем и нарезают его на пластины 15×10 см.

3. Обрабатывают раствором аммиака, преимущественно 10%-ным, в течение 4-5 часов с 3-кратной сменой раствора.

4. Промывают материал дистиллированной водой в течение 30 мин с 3-кратной сменой воды по 10 литров.

5. Замораживают материал при температуре минус 10-12°С в холодильнике и размораживают при температуре +40-45°С - в теплой воде - 4 цикла.

6. Обрабатывают материал 6%-ным раствором перекиси водорода при температуре до +15°С - 3 цикла по 2,5 часа.

7. Промывают материал в дистиллированной воде - 3 цикла по 10 мин, в каждом цикле использовать 10 л воды.

8. Разрезают материал на полоски размером (10×20)мм и (10×70) мм или диски диаметром 11 мм,

9. Обрабатывают материал ультразвуком в течение 1 часа на приборе Ретона УСУ - 0707 при частоте колебаний излучателей 125±6 кГц, мощность 9 Вт.

10. Повторно обрабатывают материал 10%-ным раствором аммиака на перемешивающем устройстве ПЭ-6410М 3 часа с трехкратной сменой раствора.

11. Отмывают материал в дистиллированной воде в течение 30 мин с трехкратной сменой воды.

12. Повторно замораживают материал при температуре -10-12°С в холодильнике и размораживают при температуре +40-45°С в теплой воде - всего 4 цикла.

13. Повторно обрабатывают материал 6%-ным раствором перекиси водорода на перемешивающим устройстве ПЭ-6410М в течение 30 мин.

14. Повторно промывают дистиллированной водой в течение 30 мин с трехкратной сменой 10 л воды.

15. Дегидратируют в спиртах восходящей концентрации от 30 до 70 объемных процентов, в каждом растворе спирта выдерживают 24 часа на перемешивающем устройстве. В материале отсутствует пигмент.

16. Раскладывают материала во флаконы с 70%-ным этиловым спиртом, производят укупорку, стерилизацию ионизирующим излучением дозой 1.5 Мрад на -установке Со⁶⁰. При бактериологическом исследовании - материал стерилен.

Примеры осуществления способа

Пример 1. Получение ксенотрансплантата для лечения прогрессирующей миопии, сухой макулодистрофии и антиглаукоматозного дренажа.

1. 1 кг перикарда крупного рогатого скота извлечен в течение 45 минут после забоя и доставлен в контейнере.

2. Проведена механическая очистка материала от сгустков крови, прилипших частиц и сосудов скальпелем и материал нарезан на пластины 15×10 см.

3 Материал обработан раствором аммиака 10%-ного в течение 4,5 часов с 3-кратной сменой раствора.

4. Материал промыт дистиллированной водой в течение 30 мин с 3-х кратной сменой воды по 10 литров.

5. Материал заморожен при температуре -10°С в холодильнике и разморожен при температуре +40°С в теплой воде - всего 4 цикла.

6. Материал обработан 6%-ным раствором перекиси водорода при температуре до +15°С - всего 3 цикла по 2,5 часа.

7. Материал промыт в дистиллированной воде - 3 цикла по 10 мин, в каждом цикле использовано 10 л воды.

8. Материал разрезан на полоски размером (10×20) мм и диски диаметром 13 мм

9. Материал обработан ультразвуком в течение 1 часа на приборе Ретона УСУ - 0707, при частоте колебаний излучателей 125±6 кГц, мощность 9 Вт.

10. Материал повторно обработан 10%-ным раствором аммиака на перемешивающем устройстве ПЭ-6410М в течение 3 часов с трехкратной сменой раствора.

11 Материал отмыли в дистиллированной воде в течение 30 мин с трехкратной сменой воды. Контроль на присутствие ионов NH ⁴⁺ проведен с использованием реактива Несслера. Реакция отрицательная, ионы NH⁴ - отсутствуют.

12. Материал заморожен при температуре -12°С в холодильнике и разморожен при температуре +40°С в теплой воде - всего 4 цикла замораживание - размораживание.

13. Материал обработан 6%-ным раствором перекиси водорода на перемешивающим устройстве ПЭ-6410М в течение 30 мин.

14. Материал промыт дистиллированной водой в течение 30 мин с трехкратной сменой 10 л воды.

15. Материал дегидратирован в спиртах восходящей концентрации: 30, 50 и 70 объемных процентов в каждом растворе спирта, выдержан 24 часа на перемешивающем устройстве.

16. Материал разложен во флаконы с 70%-ным этиловым спиртом, укупорен, стерилизован ионизирующим излучением дозой 1.5 Мрад на -установке Со⁶⁰.

Полученный по заявляемому способу материал исследован на наличие в нем растворимых белков, гликопротеинов, элементов крови. Контроль на присутствие растворимых белков, гликопротеинов, клеточных элементов проводили с помощью УФ-спектроскопии путем исследования водных вытяжек из материала (метод Лоури-Фолина). Оказалось, что оптическая плотность водных вытяжек из материала на длинах волн 205 и 210 нм не превышала 0,1 единицы. Качественная реакция на гликопротеины была отрицательной. Данный результат свидетельствует о том, что произошло полное освобождение перикарда от клеточных элементов, крови, растворимых белков и гликопротеинов.

Полученный таким образом материал был использован:

а) при прогрессирующей миопии средней степени.

Больной Б. 25 лет OU миопия - 4,0 D. Градиент прогрессирования 1,0 D в год. Произведена склеропластическая операция по Пивоварову на OD, а через 3 месяца на OS с использованием перикарда, обработанного по предложенной нами методике.

Послеоперационный период протекал без осложнений, через 1 год после операции миопия на OU по-прежнему 4 OD. VIS с коррекцией sph - 4 OD=1,0.

б) при сухой макулодистрофии

Больной М. 45 лет, OD сухая макулодистрофия. Зрение постепенно ухудшалось и к моменту обращения VIS 0,3 н/к. На глазном дне в макулярной зоне мелкоточечные очаги и диссеминация пигмента. Произведена имплантация диска из перикарда в субтеноново пространство в области заднего полюса.

Послеоперационный период протекал без осложнений. Через 1 год ухудшение зрения и картины глазного дна не отмечено.

в) при открытоугольной начальной субкомпенсированной глаукоме

Больной С. 62 года, OD глаукома открытоугольная начальная субкомпенсированная. ВГД 28 мм Hq. Произведена операция непроникающая глубокая склерэктомия с использованием дренажа из перикарда.

Послеоперационный период протекал без осложнений. ВГД нормализовалось. ВГД через 1 год после операции 18 мм Hq.