способ диагностики начинающихся нарушений агрегации тромбоцитов у людей и животных

Формула изобретения

1. Способ диагностики начинающихся нарушений агрегации тромбоцитов, включающий взятие крови, ее стабилизацию, выделение богатой тромбоцитами плазмы и нанесение ее на предметное стекло, добавление индуктора агрегации, отличающийся тем, что у обследуемых оценивают время возникновения агрегации тромбоцитов одновременно с несколькими индукторами, выбранными из АДФ, адреналина, коллагена, тромбина, используя минимальные взаимопотенциирующие концентрации индукторов агрегации, которые составляют при двойном сочетании индукторов у людей: АДФ - 10^-6 М, адреналин - 2,5·10 ^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:4, тромбин - 0,100 ед/мл.; у новорожденных телят АДФ 5,0·10^-6 М, адреналин 5,0·10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:3, тромбин 0,110 ед/мл; при тройном сочетании индукторов у людей: АДФ - 5,0·10^-7 М, адреналин - 10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:5, тромбин - 0,090 ед/мл, у новорожденных телят: АДФ 7,5·10 ^-7 М, адреналин 2,0·10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:4, тромбин 0,100 ед/мл, выявляют отклонения времени агрегации тромбоцитов от границ нормы, которые составляют для здоровых людей при использовании сочетания индукторов АДФ + адреналин 30-42 с, АДФ + коллаген 22-30 с, адреналин + коллаген 24-35 с, АДФ + коллаген + адреналин 21-26 с, АДФ + коллаген + тромбин 21-24 с, для новорожденных телят АДФ + адреналин 33- 47 с, АДФ + коллаген 25-32 с, адреналин + коллаген 27-39 с, АДФ + коллаген + адреналин 25-33 с, АДФ + коллаген + тромбин 23-27 с.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при превышении времени агрегации у людей для сочетания АДФ + адреналин длиннее 42с, АДФ + коллаген длиннее 30с, адреналин + коллаген длиннее 35с, АДФ + коллаген + адреналин длиннее 26с, АДФ + коллаген + тромбин длиннее 24с диагностируют гипоагрегацию тромбоцитов.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при уменьшении времени агрегации у людей для сочетания АДФ + адреналин короче 30с, АДФ + коллаген короче 22с, адреналин + коллаген короче 24с, АДФ + коллаген + адреналин короче 21с, АДФ + коллаген + тромбин короче 21с диагностируют гиперагрегацию тромбоцитов.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при превышении времени агрегации у новорожденных телят для сочетания АДФ + адреналин длиннее 47с, АДФ + коллаген длиннее 32с, адреналин + коллаген длиннее 39с, АДФ + коллаген + адреналин длиннее 33с, АДФ + коллаген + тромбин длиннее 27с диагностируют гипоагрегацию тромбоцитов.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при уменьшении времени агрегации у новорожденных телят для сочетания АДФ + адреналин короче 33с, АДФ + коллаген короче 25с, адреналин + коллаген короче 27с, АДФ + коллаген + адреналин короче 25с, АДФ + коллаген + тромбин короче 23с диагностируют гиперагрегацию тромбоцитов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии, медицине и ветеринарии в области гематологии, и может быть использовано для оценки агрегации тромбоцитов в условиях, приближенных к внутрисосудистым, с целью диагностики гипо- и гиперагрегации тромбоцитов при физиологических и патологических состояниях у людей и животных.

Наиболее близким к предложенному является способ определения агрегации тромбоцитов на предметном стекле с использованием одного индуктора (Шитикова А.С. Визуальный микрометод исследования агрегации тромбоцитов. В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян, СПб., 1999. - С.49-52. Однако описанный метод не позволяет моделировать реальные условия агрегации тромбоцитов в организме человека и животного и при его проведении непредусмотрено применение индукторов агрегации в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях.

Известен способ исследования агрегации тромбоцитов на агрегометре "Пайтон" (США) с комбинацией индукторов (Акопов С.Э., Мартиросян Г.Р. Об использовании комбинаций индукторов агрегации в оценке изменений тромбоцитарных функций у больных с нарушениями мозгового кровообращения. // Кровообращение. 1988. - Т.21, №4. - С.47-49). Метод позволяет оценивать агрегацию тромбоцитов с комбинацией индукторов на агрегометре. Вместе с тем, он может применяться далеко не в каждой лаборатории по причине дороговизны агрегометров, а также проведение исследования требует затрат плазмы, значительно превышающих расход ее при оценке агрегации на стекле. Кроме того, авторами метода не предусматривалось применение индукторов агрегации в минимальных взаимопотенциирующих дозах.

Цель изобретения: с помощью технически простых, экономически доступных и быстро выполнимых приемов диагностировать гипо- и гиперагрегацию тромбоцитов в малом объеме плазмы с комбинацией индукторов, наиболее вероятно присутствующей в зоне повреждения сосуда, взятых в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях при различных состояниях у человека и животных.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что после взятия крови, ее стабилизации цитратом натрия 3,8%, разделения крови на плазму и эритроциты путем центрифугирования с получением богатой тромбоцитами плазмы (БТП) на предметном стекле проводится тест на агрегацию тромбоцитов с несколькими индукторами. Визуальная оценка агрегации тромбоцитов в этих условиях позволяет с небольшим объемом (0,02 мл) плазмы и малым объемом индукторов моделировать реальные условия кровотока у людей или животных при использовании минимальных взаимопотенциирующих концентраций индукторов.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. После взятия крови в цитрат натрия 3,8% в соотношении 9:1 ее центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин для получения БТП. Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БеТП). БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (до 200·10⁹/л).

Из получившегося объема стандартизированной плазмы отбирают из расчета по 0,02 мл плазмы на каждую исследуемую комбинацию индукторов. Оставшийся объем плазмы можно использовать для других гематологических и биохимических исследований.

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и разными пипетками растворы нескольких индукторов (фиг.1 и 2) общим объемом, равным объему плазмы. Объемы агонистов определяются по формуле:

где n - число используемых одновременно индукторов агрегации (фиг.1 и 2).

В качестве агонистов возможно использование аденозиндифосфата (АДФ), коллагена, тромбина (производство НПО "РЕНАМ"), адреналина (производства Гедеон Рихтер) и других индукторов, агрегация с сочетаниями которых развивается раньше, чем при изолированном их использовании (табл.1 и 2). Минимальные взаимопотенциирующие дозы индукторов ниже стандартных (табл.3 и 4) и способны вызывать агрегацию тромбоцитов только при сочетанном применении индукторов. Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см (фиг.3). Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.

Исследование повторяют 2-3 раза с каждой комбинацией индукторов, находя среднее значение из полученных результатов. Например, при троекратной регистрации времени развития агрегации тромбоцитов с АДФ и адреналином у одного пациента получено три значения - 30 с, 32 с и 34 с, тогда принимаемая во внимание цифра составит среднее арифметическое из них - 32 с.

В табл.1 приводится время развития агрегации тромбоцитов в случае изолированного воздействия индуктора в стандартных концентрациях, в табл.2 - их сочетанного влияния в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях. Из представленного материала следует, что по сравнению со стимуляцией одним индуктором при применении одновременно двух индукторов средняя скорость агрегации возрастает, а временной разброс ее наступления сокращается, что вероятно связано с задействованием нескольких механизмов активации. В случае одномоментного использования трех индукторов эта закономерность выражена еще в большей степени. Необходимо отметить, что исследование агрегационной способности кровяных пластинок с несколькими индукторами моделирует события, происходящие в кровотоке в области повреждения сосуда и инициации процесса гемостаза, т.к. реально в этих условиях тромбоциты активируются несколькими агонистами. Например, у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом найденные закономерности выражены еще больше, чем у здоровых людей из-за активации у них в большинстве случаев тромбоцитарных функций с ускорением развития агрегации кровяных пластинок.

Таблица 3
Стандартные дозы индукторов, вызывающие агрегацию тромбоцитов при их изолированном применении.
Индукторы	АДФ, М	Адреналин, М	Коллаген, разведение основной суспензии	Тромбин, ед/мл.
Дозы	0,5·10-4	5·10-6	1:2	0,125

Таблица 4
Минимальные взаимопотенциирующие концентрации индукторов агрегации у людей и новорожденных телят при двойном и тройном их сочетании.
	Сочетания индукторов агрегации тромбоцитов
Категория обследованных	АДФ, М		Адреналин, М		Коллаген, разведение основной суспензии		Тромбин, ед/мл.
	с одним агонистом	с двумя агонистами	с одним агонистом	с двумя агонистами	с одним агонистом	с двумя агонистами	с одним агонистом	с двумя агонистами
Люди, n=21	10-6	5·10 -7	2,5·10-7	10-7	1:4	1:5	0,100	0,090
Новорожденные телята, n=20	5,0·10-6	7,5·10-7	5,0·10 -7	2,0·10-7	1:3	1:4	0,110	0,100

Из таблиц 3 и 4 следует, что минимальные вызывающие агрегацию дозы индукторов при сочетанном их использовании значительно ниже, чем в стандартных условиях при использовании воздействия на тромбоциты одного агониста. При одновременном присутствии в БТП трех индукторов минимальная взаимопотенциирующая концентрация индукторов еще ниже, чем в случае двух индукторов. Одномоментное применение нескольких индукторов приближает наши представления о реальных условиях при инициации гемостаза в сосудах человека и животных и позволяет вести тонкую и раннюю диагностику у них гипо- и гиперагрегации тромбоцитов.

Суть диагностики заключается в выявлении отклонений времени агрегации тромбоцитов с сочетаниями индукторов во взаимопотенциирующих концентрациях (табл.4) в большую или меньшую сторону от найденных авторами границ нормы (табл.2) для людей и новорожденных телят. Более раннее или более позднее развитие агрегации тромбоцитов, чем обозначенные границы нормы у людей и животных, свидетельствуют о развитии гипер- или гипоагрегации тромбоцитов, позволяя в ранние сроки назначать соответствующее лечение.

Диагностировать гипоагрегацию у людей возможно при превышении времени агрегации для сочетания АДФ + адреналин длиннее 42 с, АДФ + коллаген длиннее 30 с, адреналин + коллаген длиннее 35 с, АДФ + коллаген + адреналин длиннее 26 с, АДФ + коллаген + тромбин длиннее 24 с при применении индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях: АДФ - с одним агонистом 10^-6 М, двумя - 5·10 ^-7 М, адреналин - с одним агонистом - 2,5·10^-7 М, с двумя - 10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии с одним индуктором - 1:4, с двумя индукторами - разведение 1:5, тромбин - с одним агонистом 0,100 ед/мл, с двумя 0,090 ед/мл.

Диагностировать гиперагрегацию у людей возможно при сокращении времени агрегации для сочетания АДФ + адреналин короче 30 с, АДФ + коллаген короче 22 с, адреналин + коллаген короче 24 с, АДФ + коллаген + адреналин короче 21 с, АДФ + коллаген + тромбин короче 21 с, при применении индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях: АДФ - с одним агонистом 10^-6 М, двумя - 5·10^-7 М, адреналин - с одним агонистом - 2,5·10 ^-7 М, с двумя - 10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии с одним - 1:4, с двумя индукторами - разведение 1:5, тромбин - с одним агонистом 0,100 ед/мл, с двумя - 0,090 ед/мл.

Диагностировать гипоагрегацию у новорожденных телят возможно при сокращении времени агрегации для сочетания АДФ + адреналин длиннее 47 с, АДФ + коллаген длиннее 32 с, адреналин + коллаген длиннее 39 с, АДФ + коллаген + адреналин длиннее 33 с, АДФ + коллаген + тромбин длиннее 27 с при применении индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях: АДФ - с одним агонистом 5,0·10^-6 М, двумя - 7,5·10 ^-7 М, адреналин - с одним агонистом - 5,0·10^-7 М, с двумя - 2,0·10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии с одним индуктором - 1:3, с двумя индукторами - разведение 1:4, тромбин - с одним агонистом - 0,110 ед/мл, с двумя - 0,100 ед/мл.

Диагностировать гиперагрегацию у новорожденных телят возможно при превышении времени агрегации для сочетания АДФ + адреналин короче 33 с, АДФ + коллаген короче 25 с, адреналин + коллаген короче 27 с, АДФ + коллаген + адреналин короче 25 с, АДФ + коллаген + тромбин короче 23 с при применении индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях: АДФ - с одним агонистом 5,0·10^-6 М, двумя - 5·10 ^-7 M, адреналин - с одним агонистом - 5,0·10^-7 М, с двумя - 2,0·10^-7 М, коллаген - разведение основой суспензии с одним индуктором - 1:3, с двумя индукторами - разведение 1:4, тромбин - с одним агонистом - 0,110 ед/мл, с двумя - 0,100 ед/мл.

Пример 1. Гражданка Н. 31 года поступила для санаторно-курортного лечения в санаторий им. И.Д.Черняховского г. Курска. При осмотре и объективном обследовании патологических изменений не было выявлено. Утром натощак было произведено взятие крови для биохимического и гематологического исследования, не выявившего отклонений от общепринятой нормы. Оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с комбинацией индукторов АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов для АДФ - 10 ^-6 М, коллагена - 1:4 разведение основной суспензии, адреналина - 2,5·10^-7 М, для тромбина - 0,100 ед/мл зафиксировала ее развитие на 30 с, 25 с и 31 с соответственно. Для комбинации АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов для АДФ - 5,0·10 ^-7 М, коллагена 1:5 разведения основной суспензии, адреналина - 10^-7 М, тромбина - 0,090 ед/мл агрегация развивалась через 24 с и 22 с соответственно.

Таким образом, патологических изменений агрегации тромбоцитов выявлено не было. Обследованной было рекомендовано и далее вести здоровый образ жизни.

Пример 2. Больная Б., 53 лет, находящаяся на диспансерном учете по артериальной гипертонии в поликлинике МУЗ ГБ СМП г. Курска и имеющая в качестве сопутствующей патологии метаболический синдром, обследована в плановом порядке.

При опросе выявлены жалобы на эпизодические головные боли в затылочной области, мелькание "мушек" перед глазами, связанные с подъемами артериального давления. Больная также предъявляла жалобы на избыточную массу тела с локализацией жира преимущественно на животе.

При объективном осмотре выявлено ожирение по андроидному типу IIа ст. и смещение левой границы сердца влево на 1,5 см. Электрокардиографически выявлено наличие у пациентки гипертрофии левого желудочка. Окулист диагностировал у больной гипертоническую ангиопатию сетчатки. Лабораторное обследование выявило у нее нарушение толерантности к глюкозе, гиперлипидемию IIб типа с легкой гиперхолестеринемией (5,8 ммоль/л).

Агрегация тромбоцитов с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих дозах характеризовалась ее ускорением под влиянием АДФ + адреналин - 17 с, АДФ + коллаген - 14 с, адреналин + коллаген - 11 с, АДФ + коллаген + адреналин - 10 с, АДФ + коллаген + тромбин - 9 с.

У больной было выявлено начало развития гиперагрегации тромбоцитов, что требовало назначения коррекции. С этой целью больной было назначено сочетание индивидуально подобранной гипокалорийной диеты и физических тренировок. Через 1 мес лечения на фоне снижения массы тела и улучшения биохимических показателей крови была достигнута нормализация агрегации тромбоцитов. Проведена оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с комбинацией индукторов АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов. Было зафиксировано ее развитие на 32 с, 26 с и 30 с соответственно. Для комбинации АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов агрегация развивалась через 23 с и 22 с соответственно. Больной было рекомендовано соблюдать в дальнейшем данные рекомендации для профилактики возникновения гиперагрегации.

Пример 3. Больная С. 60 лет, находящаяся на диспансерном учете по артериальной гипертонии в поликлинике МУЗ ГБ СМП г. Курска и имеющая в качестве сопутствующей патологии метаболический синдром, обследована в плановом порядке.

При опросе жалоб не выявлено. При объективном осмотре выявлено ожирение по андроидному типу IIа ст. и смещение левой границы сердца влево на 1,0 см. Электрокардиографически выявлено наличие у пациентки гипертрофии левого желудочка. Окулист диагностировал у больной гипертоническую ангиопатию сетчатки. Лабораторное обследование позволило найти у нее нарушение толерантности к глюкозе, гиперлипидемию IIб типа с легкой гиперхолестеринемией (5,6 ммоль/л).

Агрегация тромбоцитов с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях характеризовалась ее ускорением под влиянием АДФ + адреналин - 19 с, АДФ + коллаген - 17 с, адреналин + коллаген - 13 с, АДФ + коллаген + адреналин - 9 с, АДФ + коллаген + тромбин - 11 с.

У больной было выявлено начало развития гиперагрегации тромбоцитов, что требовало проведения коррекции. С этой целью больной была назначена индивидуально подобранная гипокалорийная диета. Через 1 мес лечения на фоне снижения массы тела и улучшения биохимических показателей крови была достигнута нормализация агрегации тромбоцитов. Проведена оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с комбинацией индукторов АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов составили для АДФ - 10^-6 М, коллагена - 1:4 разведение основной суспензии, адреналина - 2,5·10 ^-7 М, для тромбина - 0,100 ед/мл. Зафиксировано развитие агрегации на 34 с, 28 с и 33 с соответственно. Для комбинации АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов для АДФ - 5,0·10 ^-7 M, коллагена 1:5 разведения основной суспензии, адреналина - 10^-7 М, тромбина - 0,090 ед/мл агрегация развивалась через 21 с и 24 с соответственно. Больной было рекомендовано в дальнейшем следить за артериальным давлением и массой тела, соблюдать гипокалорийную диету, что позволит избежать рецедива развития гиперагрегации.

Пример 4. Больной Т. 50 лет, проходивший лечение в санатории им. И.Д.Черняховского г. Курска, страдал хроническим тонзиллитом.

При опросе жалоб не выявлено. Объективный осмотр не обнаружил отклонений. Стандартные лабораторные и инструментальные обследования не выявили патологии. Осмотр ЛОР-врача позволило определить у пациента наличие хронического тонзиллита в стадии нестойкой ремиссии.

Агрегация тромбоцитов с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях характеризовалась ее замедлением под влиянием АДФ + адреналин - 47 с, АДФ + коллаген - 34 с, адреналин + коллаген - 39 с, АДФ + коллаген + адреналин - 28 с, АДФ + коллаген + тромбин - 27 с.

У больного было выявлено начало развития гипоагрегации тромбоцитов с риском развития кровоточивости, что требовало назначения коррекции. С этой целью больному был назначен дицинон 0,25 мг 1 таб. 3 раза и рибоксин 0,2 мг 2 таб. 3 раза в день. Через 1 мес лечения была достигнута нормализация агрегации тромбоцитов. Оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с комбинацией индукторов АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов зафиксировала ее развитие на 39 с, 28 с и 34 с соответственно. Для комбинации АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов агрегация развивалась через 26 с и 24 с соответственно. Больному было рекомендовано регулярно наблюдаться у ЛОР-врача и решить вопрос о тонзилэктомии.

Пример 5. Новорожденный теленок №12 в возрасте 5 суток, содержавшийся в стандартных условиях коровника опытного хозяйства Курского НИИ Агропроизводства, рожденный от здоровой коровы второго отела с нормально протекавшей беременностью. Теленок не имел врожденных аномалий, травм и инфекций. На фоне кажущегося благополучия у теленка в начале 6-х суток возникла диарея с быстро возникшими признаками обезвоживания. Через 4 часа после начала заболевания осуществлено взятие крови. Оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген зафиксировала ее развитие на 30 с, 23 с и 25 с соответственно. Для комбинации АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин агрегация развивалась через 22 с и 20 с соответственно, что указывало на высокий риск развития внутрисосудистого тромбоза. Теленку на фоне вольного питьевого режима срочно была назначена адекватная инфузионная терапия и антибиотики. Состояние животного было стабилизировано на 8-е сутки жизни. Исследование агрегации тромбоцитов показало ее нормализацию, что указывало на нивелирование риска тромбозов.