способ диагностики туберкулезной инфекции, рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая синтез гибридного белка cfp10-esat6 из mycobacterium tuberculosis, способ его получения, гибридный белок cfp10-esat6 и его применение

Формула изобретения

1. Гибридный белок CFP10-ESAT6, способный индуцировать специфическую в отношении M.tuberculosis реакцию гиперчувствительности замедленного типа, содержащий полный белок CFP10 из M.tuberculosis, слитый с полным белком ESAT6 из M.tuberculosis через линкерную аминокислотную последовательность.

2. Применение гибридного белка CFP10-ESAT6, содержащего полный белок CFP10 из M.tuberculosis, слитый с полным белком ESAT6 из M.tuberculosis через линкерную аминокислотную последовательность, в качестве диагностикума туберкулезной инфекции у млекопитающих и человека.

3. Применение гибридного белка CFP10-ESAT6 по п.2, отличающееся тем, что в качестве линкерной последовательности гибридный белок CFP10-ESAT6 содержит сайт гидролиза энтерокиназой.

4. Способ диагностики туберкулезной инфекции путем индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа при подкожном введении антигенов CFP10 и ESAT6, специфичных в отношении M.tuberculosis, с последующей положительной оценкой туберкулезного процесса визуально по диаметру эритемы в 10-15 мм, отличающийся тем, что антигены CFP10 и ESAT6 пациенту вводят в эффективной дозе в виде водного раствора гибридного белка CFP10-ESAT6, который специфичен в отношении M.tuberculosis, и содержит полный белок CFP10 из M.tuberculosis, слитый с полным белком ESAT6 из M.tuberculosis через линкерную аминокислотную последовательность.

5. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTBD16 для экспрессии гибридного белка CFP10-ESAT6 M.tuberculosis, представляющая собой векторную плазмиду pQE30, содержащую репликон ColE, lac промотор, ген устойчивости к ампициллину, инициирующий кодон ATG, последовательность из 18 нуклеотидов, кодирующих 6-гистидиновых остатков, в которую оперативно встроен участок ДНК, кодирующий белки CFP10 и ESAT6, фланкированный сайтами для рестрикции BamHI и KpnI и содержащий между генами CFP10 и ESAT6 последовательность нуклеотидов, кодирующую сайт гидролиза энтерокиназой.

6. Способ получения гибридного белка CFP10-ESAT6 для диагностики туберкулезной инфекции, включающий культивирование штамма E.coli DLT1270, трансформированного рекомбинантной плазмидной ДНК pTBD16 для экспрессии гибридного белка CFP10-ESAT6, разрушение клеток штамма E.coli DLT1270 в буферном растворе ультразвуком и выделение белка из очищенных телец включения и из промывок телец включения методом лигандообменной хроматографии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, конкретно к специфическим способам диагностики туберкулезного процесса и новому диагностикуму, позволяющему осуществить этот способ: гибридному белку, специфичному только к М.tuberculosis, полученному с помощью сконструированной in vitro рекомбинантной плазмидной ДНК.

Исследования, проведенные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), показали, что проблема туберкулеза (ТБ) по-прежнему стоит чрезвычайно остро, о чем свидетельствует уровень инфицированности населения земного шара, составляющий свыше 1 миллиарда человек. Около 8 миллионов человек заболевают туберкулезом каждый год. При этом 44% болеют легочной формой этого заболевания. Около 2 млн. человек умирает ежегодно, что составляет 23% смертельных исходов в мировом масштабе и превышает 50% летальности в Африканских странах (Dye С, Scheele S, Dolin P, Pathania V and Ravinglione М С, 1999, JAMA, 282, 7, 677-686).

Для контроля за распространением ТБ и значительного снижения риска распространения этого заболевания необходимо, в том числе, создание эффективных реагентов для специфичной диагностики.

Базовым лабораторным методом выявления туберкулезной инфекции многие годы является реакция Манту.

В основе этого метода лежит определение гиперчувствительности замедленного типа в отношении антигенных детерминант микобактерий. Реагент для постановки кожной пробы представляет собой суммарный экстракт антигенов из Mycobacterium bovis, что предопределяет очень низкий уровень специфичности реакции Манту. Положительная проба не выявляет различий между активной формой заболевания, предварительной сенсибилизацией в результате контакта с M.tuberculosis, БЦЖ (BCG) вакцинацией или перекрестной сенсибилизацией другими видами микобактерий. Более того, антигенные компоненты пробы не стандартизованы и поэтому пробы из разных источников могут различаться по кожной реакции (Mustafa A S, Т-cell subsets and cytokines interplay in infectious diseases, pp.201-211). Таким образом, сложилась настоятельная необходимость идентифицировать антигены M.tuberculosis, которые могут стать кандидатами для производства улучшенных вакцин с универсальной эффективностью и специфических диагностических реагентов для детекции ТБ.

Развитие биотехнологии, в частности использование технологий ДНК клонирования и экспрессии, значительно облегчило идентификацию нескольких основных антигенов M.tuberculosis.

На основе некоторых из идентифицированных антигенов M.tuberculosis (в основном это белки "теплового шока", такие как hsp18, hsp60, hsp70 и секретируемые белки-антигены) были разработаны методы диагностики гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (см., например, патент US 6458366, патент-аналог - опубликованная заявка России №98105682, Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods of their use. Патент WO 0021983 ТВ vaccine and diagnostic based on antigens from M.tuberculosis cell. Патент US 6120776 Diagnostic skin test for tuberculosis).

Однако общим недостатком этих подходов является отсутствие полной специфичности используемых белковых, полипептидных в том числе гибридных реагентов в отношении M.tuberculosis, так как подобные белки-полипептиды имеются в штаммах других микобактерий и в вакцинном штамме БЦЖ. В случае наличия последнего обстоятельства, разработанные подходы не годятся для дифференциальной диагностики инфекционного иммунитета от вакцинального.

В последние годы в результате сравнительного анализа геномов различных микобактерий было установлено, что M.tuberculosis обеспечивает синтез двух секреторных белков ESAT6 и CFP10, которые отсутствуют у M.Bovis и большинства непатогенных бактерий (Mustafa A.S., 2001, Carrent Pharmaceutical Biotechnology, 2, 157-173).

На основе только пептидов белка ESAT6 была создана специфическая диагностическая система, позволяющая уверенно дифференцировать гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) поствакцинального происхождения и ГЗТ, появляющуюся при инфицировании M.tuberculosis (Патент WO 00262248 Tuberculosis diagnostic test), - принята заявителем в качестве прототипа.

На основе предложенного диагностикума был разработан метод диагностики туберкулезной инфекции путем индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа инкубацией Т-лимфоцитов преимущественно периферической крови пациента в условиях in vivo или in vitro со смесью указанных выше антигенов. В случае положительной реакциии с помощью чувствительных иммунологических методов фиксировался повышенный уровень синтеза -интерферона.

Такой метод очень сложен в постановке, требует дорогостоящего оборудования и реагентов, а потому не пригоден для массового применения в качестве скринингого метода.

Как указано в описании, пептиды белка ESAT6 могут быть получены в том числе и генноинженерными способами, однако описания конкретных генноинженерных конструкций в материалах заявки нет.

Задачей настоящего изобретения является разработка специфичного сравнительно недорогого и простого метода тестирования туберкулезного процесса на основе отечественного диагностикума.

Задача решается тем, что in vitro сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК (рТВР16), кодирующая синтез гибридного белка CFP10-ESAT6 из M.tuberculosis, состоящая из фрагмента ДНК векторной плазмиды pQE30, содержащей репликон ColE, гена -лактамазы, определяющей устойчивость к ампициллину, lac промотора, и фрагмента ДНК, кодирующего синтез белков CFP-10 и ESAT6, начинающегося с инициирующего кодона ATG, последовательности из 6-гистидиновых остатков, фланкированного сайтами для рестриктаз BamHI и KpnI, содержащий между генами CFP10 и ESAT6 последовательность нуклеотидов, кодирующую сайт гидролиза энтерокиназой.

Патентуется также способ получения гибридного белка CFP10-ESAT6 путем культивирования штамма DLT1270 E.coli, имеющего lac1 ген в хромосоме, трансформированного рекомбинантной плазмидной ДНК (рТВD16)), кодирующей гибридный белок CFP10-ESAT6, разрушения культивируемых клеток в буферном растворе ультразвуком, последующего выделения гибридного белка из очищенных телец включения и промывок телец включения методом лигандообменной хроматографии.

Патентуемый способ диагностики туберкулезной инфекции на основе предлагаемого диагностикума состоит в индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа и заключается в покожном введении пациенту водного раствора гибридного белка CFP10-ESAT6 из М.tuberculosis в эффективной дозе, после чего (по истечении 12-48 часов) положительную оценку туберкулезного процесса осуществляют визуально по диаметру эритемы в 10-15 мм.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, способ получения гибридного белка осуществляют следующим образом.

Для конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК использовали экспрессионный вектор pQE30, позволяющий экспрессировать белки с добавлением 6 HIS на N-конце.

Принципиальная схема конструкций:

1. pQE-cfp

ATG-6xHIS-(BamHI)-EK-CFP10-(KpnI)

2. pQE-cfp-esat

ATG-6xHIS-(BamHI)-EK-CFP10-(KpnI)-EK-ESAT6-(HindIII)

EK - сайт действия энтерокиназы, DDDDK, режет после К.

Ген cfp10 был амплифицирован на ДНК М.tuberculosis линий H37Rv с помощью нуклеотидных праймеров CFP-F и CFP-R, имеющих в своей структуре сайты гидролиза для эндонуклеаз BamHI и Kpn1 (см. фиг.1)

Полученный фрагмент был обработан BamHI+KpnI и клонирован между BamHI и KpnI сайтами pQE30.

Рекомбинанты отбирались с помощью рестрикционого анализа. Отобранный клон рQЕ30-cfp обеспечивал синтез белка ожидаемого размера (около 15 кД по PAGE).

Ген esat-6 был амплифицирован на ДНК M.tuberculosis линий H37Rv с помощью нуклеотидных праймеров ESAT-F и ESAT-R, имеющих в своей структуре сайты гидролиза для эндонуклеаз BamHI и HindIII (см. фиг.2).

Полученный фрагмент был обработан KpnI+HindIII и клонирован между KpnI и HindIII сайтами рQЕ30-cfp.

Рекомбинанты отбирались с помощью рестрикционого анализа. Отобранный клон рQЕ30-cfp-esat обеспечивал синтез гибридного белка CFP-ESAT ожидаемого размера (около 27 кД по PAGE).

Лигазной смесью, содержащей отобранные рекомбинанты, трансформируют штамм DLT1270 Е.coli, производное DH10B, имеющее lас1 ген в хромосоме.

Ночные культуры засевали 1:100 в LB-агаре и выращивали на шейкере при 37°С до OD 600=0,4. 3атем вносили индуктор экспресии (IPTG) до 0,05 мМ и продолжали инкубацию в течение 3 часов.

Из влажной биомассы, содержащей буфер 0,02 М Трис-HCl, 0,3М NaCl, 2 мМ PMSF, рН 8,0 центрифугированием после УФ разрушения клеток получают отмытые тельца включения, которые содержат основную очищенную фракцию гибридного белка; методом многостадийной лигандообменной хроматографии получают основную фракцию гибридного белка с выходом 65% и с чистотой не менее 98% (определяют с помощью электрофореза по Лэмми в 13% ПААГ, см. фиг 4).

Дополнительную очищенную фракцию гибридного белка получают из промывок телец включения повторением операций, предусмотренных для очистки белка из телец включения.

Сущность изобретения поясняется с помощью графических материалов:

- фиг.1 содержит пары праймеров для cfp10-гена;

- фиг.2 содержит пары праймеров для esat 6-гена;

- фиг.3 приведены данные по молекулярной массе гибридного белка, полученные методом электрофореза;

- фиг.4 - данные о чистоте выделяемого гибридного белка по электрофореграмме по Лэмми в 13% ПААГ.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК (pTBD16) in vitro.

Для приготовления вектора ДНК плазмиды pQE30 (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой BamHI, а затем - в 40 мкл буфера О (50 мМ трис-HCl, рН 7, 5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой KpnI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент величиной 3,7 т.п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле электрофоретически перемещают в слой DEAE-бумаги, затем элюируют 1М NaCl и осаждают ДНК из раствора этанолом.

Для приготовления фрагмента гена CFP-10 проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК M.tuberculosis (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды CFP-F и CFP-R (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, содержащем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед.акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 с при 60°С, элонгация - 40 с при 72°С, 30 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют хлороформом, упаривают досуха, остаток растворяют в 20 мкл воды, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые использовались при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.

Полученный синтетический фрагмент с геном CFP-10 в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl ₂, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреит) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli DLT1270. Трансформанты высевают на чашки с YT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Полученная рекомбинантная плазмида pQEcfp обрабатывалась рестриктазами BamHI и HindIII для клонирования в ней последовательности гена ESAT6. Ген esat6 был амплифицирован из ДНК M.tuberculosis H37Rv с помощью праймеров ESAT-F и ESAT-R. Полученный синтетический фрагмент ДНК в количестве 2 пмоль прибавляют к 1 мкг описанного выше вектора pQEcfp и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т-4-ДНК лигазы в течение 12 часов при 10°С. Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток DLT1270. В результате была получена плазмида рТВD16.

Пример 2.

Получение гибридного белка ESAT6-CFP10.

Индукция синтеза белка.

Получали ночные культуры DLT1270 E.coli (производное DH10B, имеющее lac1 ген в хромосоме), несущие плазмиду рТВD16.

Ночные культуры засевали 1:100 в LB-агаре и выращивали на шейкере при 37°С до OD600=0,4. Затем вносили IPTG до 0,5 мМ и продолжали инкубацию в течение 3 часов. Синтез целевого белка контролировали при помощи ПААГ-электрофореза, сопоставляя спектр белков до и после индукции. Наблюдали синтез белка ожидаемого размера: 27 kD (соответствует данным Berthet, et al., 1998 о подвижности cfp10 и esat6 в ПААГЭ). См. Фиг.3.

Пример 3.

Технология выделения белка CFP10-ESAT6.

Протокол выделения рекомбинантного белка CFP10-ESAT6 из биомассы штамма-продуцента Е.Coli методом лигандообменной хроматографии.

Буферные растворы.

А. 0.1М трис-HCl буфер, 6М гуанидинхлорид, рН 8,0.

В. 0.02М Трис-HCl, 0.3М NaCl, 2 мМ PMSF, рН 8.0

С. 0.05М трис-HCl буфер, 6М мочевины, 0.4М NaCl и 0.02М имидазола, рН 8.0.

D. 0.05М трис-HCl буфер, 6М мочевины, 0.4М NaCl и 0.3М имидазола, рН 8.0.

Е. 0.05М трис-HCl буфер, 6М мочевины и 0.4М NaCl, рН 8.0.

F. 0.1М трис-HCl буфер, 0.5М NaCl и 2 мМ ЭДТА, рН 8.0.

G. 0.01М трис-HCl буфер, 0.15М NaCl, рН 8.0.

Подготовка сорбента к работе.

1 мл коммерческой иминодиацетат-сефарозы Chelating Sepharose CL-6B (Amersham Pharmacia Biotech) помещают в Column Linbro Plastics колонку (ICN, каталожный номер 158690) и отмывают от консерванта (20%-ный этанол) 10 мл деионизованной воды (здесь и далее все процессы на колонке проходят самотеком). Затем через колонку пропускают 2 мл раствора (10 мг/мл) NiSO₄·7H₂O (ГОСТ 446574), после чего сорбент промывают 10 мл деионизованной воды и уравновешивают колонку 5 мл буфера А.

Колонка используется для выделения белка из 150 мл биомассы.

Получение телец включения.

1. К влажной биомассе из 150 мл культуральной среды добавляют 5 мл буфера В, гомогенизируют ультразвуком в течение 1 мин (22-23 кГц, 100 Вт), гомогенат разливают по 1.5 мл пластиковым пробиркам типа "Eppendorf" и центрифугируют при 10000 об/мин 10 мин на настольной центрифуге "Eppendorf С5415" или аналогичной. Супернатант собирают отдельно.

2. Осадок суспендируют в 3 мл буфера В без PMSF и снова центрифугируют при 14000 об/мин (30 мин, +4°С) на центрифуге "Eppendorf MiniSpin" или аналогичной. Процедуру промывки осадка повторяют 5 раз. Отмытые тельца включения тщательно отделяют от супернатанта и хранят при - 30°С.

Выделение белка из тел включения.

1. Осадок телец включения из 150 мл культуральной среды растворяют в 5 мл буфера А при перемешивании на магнитной мешалке в течение 2 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугируют при 14000 об/мин (20 мин, +20°С) на центрифуге "Eppendorf MiniSpin", осадок отбрасывают, супернатант используют для получения рекомбинантного белка CFP10-ESAT6.

2. Супернатант из п.1. наносят на колонку с 1 мл подготовленного сорбента с помощью автоматической пипетки "Ленпипет".

3. Колонку промывают 10 мл буфера А, затем 10 мл буфера С, нанося растворы на колонку с помощью автоматической пипетки "Ленпипет" порциями по 2 мл, не давая сорбенту просохнуть.

4. Белок элюируют 5 мл буфера D в пенициллиновый флакон на 10 мл.

5. Элюат разбавляют 5 мл буфера Е, затем диализуют (18 ч, +40°С) сначала против 1 л буфера F, затем дважды против 1 л буфера G (2×18 ч, +4°С).

6. Диализат центрифугируют при 4000×g (30 мин, +4°С), осадок отбрасывают, к супернатанту добавляют азид натрия до 0,02% и хранят при +4°С.

7. В супернатанте измеряют концентрацию белка методом ВСА (калибровка по бычьему сывороточному альбумину), чистоту белка определяют с помощью электрофореза по Лэмми в 13%-ном ПААГ.

Выделение рекомбинантного белка CFP10-ESAT6 из промывок телец включения.

Все промывки телец включения разбавляют в 2 раза буфером А, центрифугируют при 14000 об/мин (20 мин, +20°С) на центрифуге "Eppendorf MiniSpin", осадок отбрасывают, супернатант используют для получения рекомбинантного белка CFP10-ESAT6, начиная с п.2. Далее по методике.

Данные о чистоте полученного продукта приведены на электрофореграмме белка в 13%-ном ПААГ по Лэмми (см. фиг.4).

Пример 4.

Тестирование диагностического реагента на основе гибридного белка ESAT6-CFP10 для определения гиперчувствительности замедленного типа к M.tuberculosis.

В качестве модели использовали морских свинок, которых внутрикожно сенсибилизировали живыми M.bovis BCG, M.avium и M.tuberculosis H37RA в количестве 10 ⁷ микробных клеток в 0,2 мл фосфатного буфера рН 7,2.

На шестой неделе после сенсибилизации в выбритый участок кожи экспериментальным животным вводили внутрикожно по 2 мкг антигенов в 0,1 PBS и по 10 ед туберкулина, полученного из штаммов M.bovis BCG, M.avium и M.tuberculosis. Через 24 часа оценивали диаметр эритемы, образовавшейся в месте инъекции.

Таблица 1. Оценка гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок с помощью кожного теста с реагентом, содержащим рекомбинантные белки CFP10-ESAT6 из M.tuberculosis.
Антиген	Диаметр кожной реакции у морских свинок, иммунизированных
	M.bovis	M.avium	M.tuberculosis
PPD-t	8,9±1,3	8,0±1,4	12,9±1,2
PPD-b	12,1±1,3	9,5±1,5	9,8±1,5
PPD-a	8,8±1,5	12,6±1,4	9,2±1,3
Hsp70	6,5±1,3	7,2±1,4	10,1±1,4
CFP10-ESAT6	0,5±1,0	0,6±1,0	11,2±1,3

Как следует из приведенных результатов, диагностический реагент для кожной пробы на основе гибридного белка ESAT6-CFP10 позволяет достоверно дифференцировать гиперчувствительность замедленного типа, обусловленную инфицированием M.tuberculosis, от реакций, связанных с вакцинальным иммунитетом (БЦЖ) и инфекцией M.avium.

Далее, известна диагностика туберкулезной инфекции путем подкожного введения комбинации антигенов ESAT6 и CFP10, специфичных в отношении M.tuberculosis и М.Bovis. При этом показана чувствительность (73%) и специфичность (93%) указанного диагностикума для человека по сравнению с PPD (Laurens A.H. van Pinxteren, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Март, 2000, стр.155-160) (D1).

В параллельных экспериментах на модели морских свинок исследовали два основных параметра, характеризующих кожный тест:

1. специфичность и

2. чувствительность.

Специфичность теста оценивали на морских свинках зараженных М.Bovis (БЦЖ), M.avium, так как именно эти два типа микобактерий индуцируют перекрестные иммунологические реакции. M.bovis, в силу использования его для производства вакцины БЦЖ, a M.avium в изобилии присутствует в окружающей среде и очень часто инфицирует человека, не вызывает клинической симптоматики, но индуцирует иммунологические реакции, вызывая положительные реакции Манту. В качестве положительного контроля использовали морских свинок, инфицированных M.tuberculosis. В каждом опыте было по 20 животных. После постановки кожной пробы положительную реакцию оценивали через 5 дней как воспалительную в месте инъекции размером более 5 мм. Как показали эксперименты, кожная проба (КП), содержащая гибридный белок ESAT6-CFP10, давала положительный результат только у животных, инфицированных M.tuberculosis, тогда как проба Манту давала положительную реакцию у всех групп животных. Таким образом, специфичность КП составила 100%, тогда как реакция Манту была положительна в 60% в случае М.avium и 80% в случаев М.Bovis (БЦЖ).

Чувствительность теста оценивали на модели морских свинок, предварительно инфицированных различными дозами M.tuberculosis. Как мы уже упоминали ранее, использование индивидуальных белков при постановке кожных проб может привести к снижению чувствительности теста за счет существенного снижения общей антигенной массы, имеющейся в КП. В опыте использовали две группы животных, инфицированных двумя дозами микобактерий по 40 животных в каждой группе (10000 и 1000000 микробных тел). Тестирование чувствительности КП проводили с препаратами, содержащими

1. CFP10,

2. ESAT6,

3. ESAT6-CFP10,

4. туберкулиновый тест.

Результаты тестирования на животных с низкой дозой инфицирования

№ пробы	количество животных	положительн.	чувствительность %
1	10	4	40
2	10	6	60
3	10	8	80
4	10	10	100

Результаты тестирования на животных с высокой дозой инфицирования

№ пробы	количество животных	положительн.	чувствительность, %
1	10	6	60
2	10	7	70
3	10	9	90
4	10	10	100

Таким образом, предлагаемый диагностикум по своим техническим показателям лучше чем тот, который указан в D1 (специфичность 100%, чувствительность не ниже 80%), а также по своим технологическим, а следовательно, и стоимостным показателям, он является предпочтительным.

Получаемый диагностикум является новым веществом, биологическая активность которого (по крайней мере, в количественном отношении) не вытекает из известного уровня техники.