структурированная эмульсия амфотерицина b с низкой токсичностью для парентерального введения и способ ее получения

Формула изобретения

1. Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии, имеющий LD₅₀ не менее 400 мг/кг при одном вводе дозы и не менее 40 мг/кг при повторном вводе дозы у мышей, содержащий

a) масляную фазу (до 30% мас./об. состава), выбранную из группы растительных масел, таких как соевое масло, сезамовое масло, сафлоровое масло;

b) амфотерицин В (0,05-1% мас./об. состава), диспергированный в масляной фазе;

c) воду водной фазы;

а) модифицирующие тоничность агенты, выбранные из группы соединений, таких как глицерин, маннит, декстроза, растворенные в водной фазе, и

е) эмульгатор, такой как натуральные фосфатиды (до 3% мас./об. состава), диспергированный в водной фазе.

2. Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по п.1, отличающийся тем, что масляная фаза составляет приблизительно 10-20% мас./об. состава.

3. Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что использованным растительным маслом является соевое масло.

4. Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по п.3, отличающийся тем, что содержание соевого масла составляет приблизительно 20% мас./об. состава.

5. Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что содержание амфотерицина В составляет приблизительно 0,5% мас./об. состава.

6. Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что использованным натуральным фосфатидом является очищенный яичный фосфатид.

7. Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по п.6, отличающийся тем, что содержание очищенного яичного фосфатида составляет приблизительно 1,2% мас./об. состава.

8. Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что использованным модификатором тоничности является глицерин.

9. Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по п.8, отличающийся тем, что содержание глицерина составляет приблизительно 2,25% мас./об. состава.

10. Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что эмульсия содержит амфотерицин В (0,5% мас./об. состава), масляную фазу - соевое масло (20% мас./об. состава), эмульгатор - очищенный яичный фосфатид (1,2% мас./об. состава), модифицирующий тоничность агент - глицерин (2,25% мас./об. состава) и воду (до 100% по объему состава).

11. Способ получения парентерального состава покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии, имеющего LD₅₀ по меньшей мере 400 мг/кг у мышей, по любому из пп.1-10, предусматривающий

i) диспергирование амфотерицина В в масляной фазе;

ii) растворение модифицирующего тоничность агента в воде водной фазы;

iii) диспергирование эмульгатора в водной фазе;

iv) регулирование рН водной фазы до приблизительно 8-11;

v) добавление масляной фазы в водную фазу при перемешивании для получения грубой структурированной эмульсии;

vi) гомогенизацию грубой структурированной эмульсии до частиц размером менее 2 мкм;

vii) фильтрование, заполнение гомогенизированной структурированной эмульсией стеклянных емкостей в атмосфере азота, закрывание стеклянных емкостей, герметизацию закрытых стеклянных емкостей и стерилизацию герметизированных заполненных емкостей в автоклаве.

12. Способ получения парентерального состава покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по п.11, отличающийся тем, что масляную фазу и/или водную фазу поддерживают при температуре до 75°С в течение процесса эмульгирования.

13. Способ получения парентерального состава покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по любому из пп.11-12, отличающийся тем, что для регулирования между 8 и 11 рН водной фазы, содержащей эмульгатор - яичный фосфатид, добавляют раствор гидроксида натрия в воде.

14. Способ получения парентерального состава покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии по любому из пп.11-13, отличающийся тем, что он предусматривает диспергирование амфотерицина В в соевом масле; получение водной фазы добавлением глицерина в воду; последующее диспергирование очищенного яичного фосфатида в водной фазе; регулирование рН водной фазы до 10,8; добавление соевого масла, содержащего диспергированный амфотерицин В, в водную фазу, содержащую диспергированный яичный фосфатид, при перемешивании для получения грубой структурированной эмульсии; гомогенизацию грубой структурированной эмульсии до частиц размером менее 2 мкм; фильтрование через 2-микронный фильтр, заполнение гомогенизированной структурированной эмульсией стеклянных емкостей в атмосфере азота, закрывание стеклянных емкостей, герметизацию закрытых стеклянных емкостей и стерилизацию герметизированных заполненных емкостей в автоклаве.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Изобретение относится к композиции амфотерицина В с низкой токсичностью. В частности, изобретение относится к композиции амфотерицина В с низкой токсичностью в структурированной эмульсии типа масло в воде для парентерального введения.

Предпосылки для создания изобретения

Амфотерицин В является макроциклическим полиеновым антибиотиком, продуцируемым Streptomycetes nodosus. Он эффективен по отношению к широкому кругу грибов, дрожжей и некоторым представителям простейших.

Первоначально амфотерицин В был доступен для внутривенного введения в обычной коллоидной форме. Даже в настоящее время, спустя 35 лет после его разработки, он широко используется как жизненно важное противогрибковое средство из-за его надежной терапевтической эффективности. Сообщается о низкой толерантности лекарственного средства ввиду количества неблагоприятных эффектов при клиническом использовании. Почти у всех пациентов, получавших обычный амфотерицин В внутривенно, наблюдалась нефротоксичность. Другие неблагоприятные эффекты включают в себя гипертензию, гипотензию, сердечную аритмию, в том числе фибрилляцию желудочков, остановку сердца, нарушения функции печени. Наблюдали и тубулярное, и гломерулярное повреждения и существование риска постоянного снижения почечной функции. Растворы амфотерицина В раздражают венный эндотелий и могут вызывать боль и тромбофлебит на участке инъекции из-за использования синтетического поверхностно-активное вещества, дезоксихолата, при приготовлении, чтобы солюбилизировать амфотерицин В.

Для снижения токсичных эффектов амфотерицин В приготовляли с использованием различных систем доставки лекарственного средства к участку действия, таких как липидные комплексы, липосомы и эмульсия. Эти композиции имеют более высокую эффективность, более низкую токсичность по сравнению с лекарственным средством, используемым в свободной форме. И липидные комплексы, и липосомальные готовые препаративные формы амфотерицина В в настоящее время доступны на рынке и одобрены в различных странах по всему миру.

Основной недостаток липидных готовых препаративных форм на основе липидных комплексов и липосом - высокая стоимость лечения. Амфотерицин В является липофильным лекарственным средством, которое связывается со стеринами и интеркалирует в липидные двойные слои, и следовательно, амфотерицин В особенно пригоден для использования в липидной системе доставки лекарственного средства.

Была предпринята попытка в этой лаборатории приготовить амфотерицин В в форме эмульсии на основе липида, преимущества которой состоят в низкой токсичности при более низкой стоимости лечения.

Volker Heinemann et al. допускают (Antimicrobial agents and chemotherapy 1997, 41 (4); 728-732), что липидные эмульсии уменьшают количество олигомерного амфотерицина В и тем самым уменьшают взаимодействие амфотерицина В с холестерином клеточных мембран человека. Остаточный мономерный амфотерицин В, однако, сохраняет потенциал связывания с эргостерином грибковых клеточных мембран.

Kirsh R, Goldstein R, Tarloff J, et al. сообщают (J. Infect. Dis. 1988, 158; 1065-1070), что липидная эмульсионная композиция амфотерицина В, полученная смешиванием с жировой эмульсией, проявляет меньшую токсичность без потери противогрибковой активности. Однако найдено, что физическая стабильность такой липидной эмульсии, несущей амфотерицин В, невысока.

Moreau P, et al. сообщают (J. Antimicro. Chemother. 1992, 30, 535-541), что у пациентов, проходящих лечение жировой эмульсией, смешанной с инъекционным раствором амфотерицина В, происходит значительное снижение связанной с инфузией токсичности и почечной дисфункции.

Применение амфотерицина В, смешанного с жировой эмульсией парентерального питания, возрастает и в Европе, и в Соединенных Штатах.

Известные способы получения эмульсии амфотерицина В обсуждаются ниже.

Патент США 5364632 (1994) / Патент Японии JP 2290809 (1990)

Способ получения эмульсии по изобретению описан в типичном примере следующим образом:

Амфотерицин В растворяли в метаноле (0,8 мг/мл) с использованием ультразвука (15 мин). Фосфолипиды Е-80 (содержащие, в основном, 80% фосфатидилхолина и 8% фосфатидилэтаноламина) растворяли в хлороформе. Оба раствора смешивали и фильтровали через комбинированную фильтровальную систему, имеющую предварительный стекловолокнистый фильтр и мембранный фильтр 0,45 мкм из регенерированной целлюлозы (RC 5) (GF92), для удаления пирогенов и агрегаций. Полученный прозрачный липидный раствор осаждали в виде тонкой пленки на стенки круглодонной колбы с использованием роторного испарения при пониженном давлении и 40°С. Водную фазу, содержащую полоксамер (poloxamer), дезоксихолат натрия и глицерин, фильтровали через Millepore фильтр 0,22 мкм, заливали в колбу и подвергали дисперсию воздействию ультразвука до образования гомогенной липосомной смеси.

Масло МСТ (триглицерид со средней длиной цепи), отфильтрованное через Millepore фильтр 0,22 мкм и содержащее -токоферол, нагревали до 70°С и затем подмешивали в липосомную смесь, нагретую до 45°С, и диспергировали в ней с использованием магнитной мешалки.

Эмульгирование осуществляли, поддерживая такую же температуру, с использованием смесителя с высоким усилием среза, Polytron. Полученную грубую эмульсию быстро охлаждали. Тонкую монодисперсную эмульсию получали в двухступенчатом гомогенизаторе.

Окончательно регулировали рН эмульсии и фильтровали через Millepore фильтр 0,45 мкм, чтобы отделить крупные капли и продукты распада, образующиеся в процессах эмульгирования и гомогенизации.

Все операции обработки проводили в асептических условиях.

Относительные количества различных ингредиентов в конечных эмульсиях в примере и диапазоны, данные в описании, приведены ниже:

Амфотерицин В 0,075% (0,015-0,15%), масло МТС 20% (3-50%), фосфолипид Е80 0,5% (0,5-20%), полоксамер 2% (0,3-10%), дезоксихолат натрия 1% (0,5-5%), глицерин 2,25%, -токоферол 0,02% и дважды дистиллированная вода 200%.

Недостатки процесса патента США 5364632 (1994)/патента Японии JP 2290809(1990):

i. Так как растворимость амфотерицина В в метаноле невысока, то необходимо использовать большое количество метанола, чтобы растворить требуемое количество амфотерицина В. Это ограничивает уровень лекарственного средства в конечной композиции.

ii. В этом способе сначала необходимо было сформировать тонкую пленку лекарственного средства, амфотерицина В и фосфолипидов и затем гидратировать эту пленку с использованием водной фазы. Водная фаза содержит неионогенный эмульгатор - полоксамер, поверхностно-активное вещество - дезоксихолат натрия и глицерин.

iii. Использованной масляной фазой является масло МСТ с добавленным -токоферолом. Эмульсию получали добавлением масляной фазы, поддерживаемой при 70°С, в водную фазу, поддерживаемую при 45°С. Это не гарантировало, что амфотерицин В сохраняется в масляной фазе. Способ не использует весь потенциал снижения токсичности амфотерицина В, если он находится в масляной фазе.

iv. Продукт по способу патента США 5364632 (1994) получали в асептических условиях для придания ему стерильности. Предпочтительный способ стерилизации, установленный в фармакопее, - это обработка продукта в конечной емкости в автоклаве. Так как амфотерицин В обычно вводят внутривенно, то конечная стерилизация является предпочтительной единственной альтернативой, которая предлагает более высокую гарантию соблюдения стерильности.

v. Эмульсионный продукт, хотя стоек к механическому напряжению, все же не был исследован на токсичность. Следовательно, токсичность продукта не известна. Однако сравнительные исследования in vivo были осуществлены с мышами Balb/c для сравнения с Fungizone, который является промышленной готовой препаративной формой амфотерицина В, содержащей дезоксихолат натрия. Эти исследования показали, что продукт менее токсичен, чем Fungizone.

vi. Применение масла МСТ и полоксамера увеличивает концентрацию лекарственного средства в плазме из-за снижения поглощения лекарственного средства ретикулоэндотелиальной системой (RES). В случае грибковой инфекции необходимо, чтобы амфотерицин В распределялся в ретикулоэндотелиальной системе, которая является местоположением инфекции.

Патент Японии 11-60491 (1989)

В патенте Японии описана лекарственная препаративная форма, содержащая амфотерицин В в форме эмульсии. Эмульсия содержит:

i) Амфотерицин В (1-10 мг/мл готовой эмульсии)

ii) Масляную фазу - масляная фаза содержит растительные масла, рыбий жир или триглицериды (1-50%, предпочтительно 5-30%). Предпочтительным используемым маслом является соевое масло или сезамовое масло.

iii) Эмульгаторы - использованные эмульгаторы представляют собой фосфолипиды. Дополнительно также применяли нетоксичные эмульгаторы. Используемыми фосфолипидами являлись фосфолипиды яичных желтков, фосфолипиды соевых бобов или гидрогенизированный продукт, полученный из этих материалов. Фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, фосфатидилсерин, фосфатидная кислота, фосфатидилглицерин также можно использовать. Рекомендованное количество 1-50 мас.% масляного компонента, предпочтительно 10-30 мас.% масляного компонента или 1-10 мас./об.%, предпочтительно 4-6 мас./об.% эмульсии.

Применяли также неионогенные эмульгаторы, такие как полиалкиленгликоль (мол. масса 1000-10000, предпочтительно 4000-6000); или полимер - полиоксиэтилен или полиоксипропилен (мол. масса 1000-20000, предпочтительно 2000-10000), полиоксиалкиленовые производные гидрогенизированного касторового масла, такие как полиоксиэтилен-20-эфир, -40-эфир, -100-эфир гидрогенизированного касторового масла, в количестве менее 5 мас./об.%, предпочтительно менее 1 мас./об.%. Также можно использовать сочетания двух неионогенных эмульгаторов.

iv) Жирные кислоты и их соли (фармацевтически приемлемые) - до 1%, предпочтительно 0,5 мас./об.%.

v) стабилизаторы - менее 5 мас./об.%, предпочтительно менее 1 мас./об.%, которые включают в себя

а) высокомолекулярные полимерные вещества, такие как альбумин человеческого происхождения, виниловый сополимер, например поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, алифатические амины.

b) желатин, гидроксиэтилированный крахмал, разновидности холестерина.

vi) изотонические агенты - менее 5 мас./об.%, предпочтительно менее 1 мас./об.%;

vii) глицерин или его моноэфиры типа моноолеина, монопальмитина;

viii) сахариды, такие как моно- и дисахариды, сорбит, ксилит, менее 5 мас./об.%, предпочтительно менее 1 мас./об.%;

ix) антиоксиданты, такие как токоферол, менее 5 мас./об.%, предпочтительно менее 1 мас./об.%;

х) агенты регулирования рН, такие как кислоты, щелочи и буферы.

О способе получения, изложенном ниже, уже сообщалось ранее. Способ предусматривает сначала формирование эмульсии типа вода в масле (w/o) и затем превращение ее в эмульсию типа масло в воде (o/w) разбавлением водой. В способе соевое масло, фосфолипид, амфотерицин В и некоторое количество воды, а также другие добавки (если их использовали) смешивали вместе и нагревали при необходимости. Смесь затем гомогенизировали в гомогенизаторе высокого давления. Добавляли еще воды в требуемом количестве, чтобы превратить эмульсию w/o в эмульсию o/w, которую снова гомогенизировали.

В типичном примере 200 г соевого масла, 50 г фосфолипида и 2,5 г амфотерицина В и 750 мл воды обрабатывали, как указано выше.

В другом примере в приведенный выше состав вводили глицерин в количестве 2,2 мас./об.% композиции.

Средний размер капли эмульсии 0,1-0,2 мкм. Эмульсия и размер капель сохраняются вплоть до 10 дней в условиях охлаждения.

Недостатки способа по патенту Японии 11-69491 (1989):

Известно, что амфотерицин В в эмульсионной готовой препаративной форме менее токсичен, чем обычный препарат амфотерицина В. Однако готовые препаративные формы патента Японии 11-69491 (1989) не используют полного потенциала снижения токсичности, обусловленного идеей использования эмульсии, из-за способа получения эмульсии в этом патенте.

i. Из-за того, что средний размер частицы эмульсии, получаемой в патенте Японии 11-69491 (1989), составляет 0,1-0,2 мкм, невозможно использовать хорошо известное преимущество предпочтительного поглощения ретикулоэндотелиальной системой частиц большего размера. Требуется предпочтительное поглощение амфотерицина В ретикулоэндотелиальной системой, так как она является местоположением большинства грибковых инфекций.

ii. Стабильность исследуемой эмульсии до 10 дней в холодильнике.

iii. Для добавления в эмульсионный препарат предложено большое количество добавок, в том числе поддерживающих эмульгирование агентов, таких как алифатические амины, высокомолекулярные полимеры, неионогенные природные поверхностно-активные вещества, разновидности холестерина, сахариды, такие как моно- и дисахариды, антиоксиданты.

iv. Технологическая стадия придания продукту стерильности не оговаривается.

В патенте Японии 4-173736 (1992) описан продукт, содержащий 0,005-5% амфотерицина В, 0,5-25% фосфолипида, предпочтительно яичного лецитина. Композиция имеет средний размер диаметра частиц 100 нм. Композиция не является эмульсией и не содержит масляной фазы.

В патенте США 5389373 (1995) описан способ получения эмульсии слаборастворимых лекарственных средств типа масло в воде (o/w). Способ предусматривает растворение амфотерицина В в водном растворе с высоким или низким рН, добавление полученного раствора с концентрацией не более чем 100 мг/мл к предварительно приготовленной эмульсии, добавление к эмульсии некоторого количества кислоты, основания или буфера, пригодного для нейтрализации и регулирования рН продукта до нужного значения.

Недостатки способа по патенту США 5389373 (1995):

Основной недостаток способа состоит в ограничении низкой концентрации амфотерицина В в эмульсии. В этом способе концентрация амфотерицина В составляет порядка 100 мг/мл. Исходя из этого необходимо инъектировать большие объемы композиции, что является недостатком для лечения.

В патенте США 5534502 (1996) амфотерицин В декристаллизуют с помощью кислоты и этанола и затем гомогенно диспергируют в липиде с последующим эмульгированием. В этом способе необходимо растворять амфотерицин В в этаноле, наиболее предпочтительное количество этанола 400-600 мл/г амфотерицина В. Основной недостаток способа состоит в том, что амфотерицин В не стабилен в кислой области рН.

Европейский патент 0700678 (1996) описывает липидную эмульсию, которая, в основном, содержит лимонную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, включающей в себя метионин, фенилаланин, серин, гистидин и их фармацевтически приемлемые соли, при условии, что эмульсия не содержит одновременно и метионин и фенилаланин.

Существенным требованием является одновременное использование лимонной кислоты и по меньшей мере одной из указанных аминокислот. Способ приготовления эмульсии в соответствии с этим изобретением описан следующим образом.

Фосфолипиды и вспомогательные агенты для эмульгирования, такие как олеиновая кислота, растворяли в подходящем органическом растворителе, таком как гексан, и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении, чтобы получить липидную пленку. К полученной липидной пленке добавляли масляный компонент и воду и смесь предварительно эмульгировали энергичным перемешиванием путем встряхивания. Полученную жидкость эмульгировали с использованием применяемых в настоящее время эмульгаторов. По завершении эмульгирования значение рН полученной эмульсии регулировали до заданного уровня добавлением хлористоводородной кислоты или гидроксида натрия. Лимонную кислоту и аминокислоты добавляли к эмульсии, чтобы получить липидную эмульсию. В варианте липидную эмульсию получали таким же образом, добавляя масляный компонент и водный раствор лимонной кислоты и аминокислоты к липидной пленке, полученной согласно указанной выше процедуре, и затем подвергали полученную смесь эмульгированию.

Недостатки способа по европейскому патенту 0700678 (1996):

Способ получения эмульсии амфотерицина В подробно не описан. Амфотерицин В является одним в перечне примерно из 70 лекарственных средств, на которое указывается как на средство, которое «может быть приготовлено в липидной эмульсии».

i) Способ получения липидной эмульсии предусматривает растворение фосфолипидов в подходящем органическом растворителе, таком как гексан.

ii) В примерах патента аминокислоты и лимонную кислоту добавляли к предварительно полученной липидной эмульсии и исследовали стабильность при 60°С на обесцвечивание.

Требуется, чтобы внутривенные эмульсии были стабильны при температурах стерилизации в автоклаве.

iii) Способ стерилизации, представленный в одном из примеров, предусматривает нагревание при 60°С в течение 1 час и повторение процесса стерилизации три раза каждые 24 часа. Этот способ не подходит для получения внутривенных инъекционных растворов.

Главная задача настоящего изобретения -создать способ получения эмульсии амфотерицина В, пригодной для парентерального введения и имеющей очень низкую токсичность, а также преодоление недостатков и пробелов известных способов, приведенных выше.

Таким образом, основная часть главной задачи - разработать способ покрытия маслом твердого порошка амфотерицина В и размещения покрытого маслом твердого порошка амфотерицина В в масляной фазе эмульсии типа масло в воде при условии сохранения амфотерицина В, внедренного в масляную фазу эмульсии, в течение всего способа получения, в том числе при стерилизации обработкой в автоклаве и в течение последующего срока хранения и использования.

Другая часть главной задачи - разработать способ получения такой структурированной эмульсии типа масло в воде со средним размером капель масла в эмульсии, регулируемым в оптимальном диапазоне, чтобы происходило преимущественное распределение в ретикулозндотелиальной системе при низкой концентрации в плазме. Таким образом, для более успешного выполнения инъекций такая эмульсия действует подобно эмульсии с водной внешней фазой, несущей масляные глобулы, содержащие покрытый маслом амфотерицин В.

Следующая часть главной задачи - разработать способ получения такой структурированной эмульсии амфотерицина В, который требует только минимума добавок, необходимых для получения эмульсии типа масло в воде.

Краткое изложение сущности изобретения

Соответственно этому, настоящее изобретение относится к парентеральному составу покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии, имеющему LD ₅₀ по меньшей мере 400 мг/кг у мышей и содержащему:

а) масляную фазу (вплоть до 30 мас./об.% состава), выбранную из группы растительных масел, таких как соевое масло, сезамовое масло, сафлоровое масло;

b) амфотерицин В (0,05% до 1 мас./об.% состава), диспергированный в масляной фазе;

c) воду водной фазы;

d) модифицирующие тоничность агенты, выбранные из группы соединений, таких как глицерин, маннит, декстроза, растворенные в водной фазе, и;

e) эмульгатор, такой как натуральные фосфатиды (вплоть до 3 мас./об.% состава), диспергированный в водной фазе.

В другом примере осуществления изобретение относится к способу получения парентерального состава покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии, имеющего LD₅₀ по меньшей мере 400 мг/кг у мыши, предусматривающему диспергирование амфотерицина В в масляной фазе, получение водной фазы растворением модифицирующего тоничность агента в воде; диспергирование эмульгатора в водной фазе; регулирование рН водной фазы приблизительно до 8-11; добавление масляной фазы в водную фазу при перемешивании, чтобы получить грубо структурированную эмульсию; гомогенизирование грубо структурированной эмульсии до размера частиц менее 2 мкм, фильтрование, заливку гомогенизированной структурированной эмульсии в стеклянные емкости в атмосфере азота; закрывание стеклянных емкостей, герметизацию закрытых стеклянных емкостей и стерилизацию герметизированных заполненных емкостей обработкой в автоклаве. Важно соблюдать порядок выполнения стадий способа. Изменение порядка стадий приводит к изменению структуры эмульсии, как показано исследованиями токсичности.

Характерно для способа настоящего изобретения, что яичный фосфатид диспергируют в водной фазе, в то время как порошок амфотерицина В диспергируют в масляной фазе, и следовательно, продукт обозначается как покрытый маслом амфотерицин В в форме структурированной эмульсии.

В следующем примере осуществления изобретение относится к парентеральному составу покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии, полученному приведенным выше способом.

Приготовление амфотерицина В в форме структурированной эмульсии типа масло в воде по способу настоящего изобретения приводит к значительному снижению его токсичности и гарантирует стерильность состава без изменения его противогрибковой активности. Состав настоящего изобретения, будучи менее токсичным, создает возможности для увеличения уровней доз при лечении определенных инфекций.

Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии настоящего изобретения является менее токсичным и отличается тем, что

a) имеет LD₅₀ по меньшей мере 400 мг/кг массы тела при исследовании токсичности однократной дозы и по меньшей мере 40 мг/кг массы тела при исследовании токсичности повторной дозы у мышей;

b) имеет LD₅₀ по меньшей мере 150 мг/кг массы тела при исследовании токсичности однократной дозы у крыс;

c) проявляет не менее чем в 20 раз меньшее гемолитическое воздействие на эритроциты человека по сравнению с обычным составом, содержащим дезоксихолат натрия;

d) имеет преимущественное распределение в тканях ретикулоэндотелиальной системы и имеет не менее двойного t_1/2 в органах ретикулоэндотелиальной системы по сравнению с обычным составом, содержащим дезоксихолат натрия, при исследовании однократной дозы у мышей.

e) не имеет токсических симптомов кардиальной токсичности после инъекции у мышей, таких как тяжелый респираторный дистресс-синдром, местное раздражение, абдоминальный дистресс и возбуждение.

Подробное описание примеров осуществления изобретения

Содержание амфотерицина В в парентеральном составе покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии изобретения находится в широком диапазоне от 0,05% до 1 мас./об.% состава. Предпочтительно, от 0,1 до 0,5 мас./об.% и, в частности, приблизительно 0,5% или приблизительно 0,25 мас./об.% состава.

В способе настоящего изобретения амфотерицин В диспергируют в масляной фазе перед эмульгированием. Амфотерицин В используют как таковой или очень тонко размельчают перед диспергированием в масляной фазе. Масляная фаза присутствует в количестве, составляющем вплоть до 30 мас./об.% состава, предпочтительно от 5 до 25 мас./об.% и более предпочтительно 10-20 мас./об.%, в частности, приблизительно 10 мас./об.% или приблизительно 20 мас./об.%. Обычно используемая масляная фаза представляет собой растительное масло и может быть одним из растительных масел, таких как соевое масло, сезамовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло, кукурузное масло, касторовое масло или оливковое масло.

Предпочтительным растительным маслом является соевое масло.

В изобретении эмульгатор растворяют в водной фазе. Пригодными эмульгаторами являются натуральные фосфатиды и модифицированные фосфатиды. Предпочтительными эмульгаторами являются фосфатиды натурального происхождения, такие как яичные фосфатиды и соевые фосфатиды. Эмульгатор, используемый в изобретении, может представлять собой смесь двух или более упомянутых выше эмульгаторов. Предпочтительным натуральным фосфатидом является очищенный яичный фосфатид.

Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии настоящего изобретения приготовляют для диапазона рН 6,0-8,5. В способе настоящего изобретения рН водной фазы регулируют между 8 и 11 щелочью, такой как раствор гидроксида натрия или гидроксида калия в воде, так что рН состава настоящего изобретения после обработки в автоклаве сохраняется в диапазоне 6-8,5.

Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии настоящего изобретения приготовляют изотоническим относительно крови введением модифицирующего тоничность агента, такого как глицерин, маннит, декстроза или их сочетания. Предпочтительный модифицирующий тоничность агент-глицерин. Глицерин присутствует в количестве от 2-3 мас./об.% состава. Предпочтительно используемое количество глицерина приблизительно 2,25 мас./об.% состава.

Парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии настоящего изобретения содержит, в частности, стерильные эмульсии типа масло в воде, приготовленные согласно процедуре получения в регулируемых условиях и подвергаемые конечной стерилизации в автоклаве. Когда эмульгирование осуществляют при высоких температурах, то водную фазу, или масляную фазу, или обе фазы поддерживают при температуре до 75°С.

Средний размер частиц состава изобретения преднамеренно поддерживают вплоть до 2 мкм, так чтобы создать распределение амфотерицина В, предпочтительно в ретикулоэндотелиальной системе, и тем самым обеспечить низкую концентрацию в плазме.

Настоящее изобретение описывается в типичном примере, где структурированную эмульсию, содержащую амфотерицин В (0,5 мас./об.%), масляную фазу - соевое масло (20 мас./об.%), эмульгатор - очищенный яичный фосфатид (1,2 мас./об.%), модифицирующий тоничность агент-глицерин (2,25 мас./об.%) и воду (сколько понадобиться до 100% по объему), получают способом, предусматривающим диспергирование амфотерицина В в соевом масле; приготовление водной фазы добавлением глицерина к воде; последующее диспергирование очищенного яичного фосфатида в водной фазе; регулирование рН водной фазы до 10,8; добавление соевого масла, содержащего амфотерицин В, к водной фазе при перемешивании с целью получения грубой эмульсии; гомогенизирование полученной эмульсии до размера частиц менее 2 мкм; фильтрование через фильтр 2 мкм, заливку в стеклянные емкости в атмосфере азота; закрывание стеклянных емкостей; герметизацию закрытых стеклянных емкостей и стерилизацию герметизированных заполненных емкостей обработкой в автоклаве.

Структурированная эмульсия парентерального состава покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной типа масло в воде эмульсии настоящего изобретения имеет низкую токсичность и небольшой размер частиц и пригодна для парентерального применения. Стерильность состава изобретения обеспечена благодаря стерилизации продукта конечной обработкой в автоклаве без значительной потери активности амфотерицина В и без дестабилизации эмульсии. Состав настоящего изобретения легко использовать, так как продукт может быть разбавлен инъекционным 5%-ным раствором декстрозы или физиологическим раствором, чтобы получить требуемую концентрацию для парентерального введения. Состав изобретения также имеет длительный срок хранения и, следовательно, пригоден как готовый рыночный продукт.

Был исследован профиль токсичности эмульсий, полученных по способам, в которых были сделаны изменения, касающиеся добавления амфотерицина В и очищенного яичного фосфатида. Результаты исследований приведены в примерах в следующей ниже таблице.

Пример	Амфотерицин В	Яичный лецитин	Токсичность
I	В масляной фазе	В водной фазе	Не показывает симптомов кардиальной токсичности
IV	В водной фазе	В водной фазе	Показывает симптомы кардиальной токсичности
V	В водной фазе	В масляной фазе	Показывает симптомы кардиальной токсичности
VI	В масляной фазе	В масляной фазе	Показывает симптомы кардиальной токсичности

В способе настоящего изобретения наблюдали при суспендировании амфотерицина В в водной фазе образование продукта, который при инъецировании мышей вызывает симптомы кардиальной токсичности, такие как тяжелый респираторный дистресс-синдром, местное раздражение, абдоминальный дистресс и возбуждение. Однако эти токсичные симптомы не наблюдаются, когда амфотерицин В суспендируют в масляной фазе. Это может происходить благодаря резервуарному эффекту как масляных капель эмульсии, так и клеток Купфера. Такое медленное высвобождение может привести к наличию мономерного амфотерицина В в плазме после инъекции эмульсионного состава, тем самым к снижению токсичности [Ref. Antimicrobial agents and chemotherapy, 1997; Vol.41 (4): Pg.728-732].

Найдено, что состав, приготовленный добавлением эмульгатора - яичного лецитина в масляную фазу, также вызывает симптомы кардиальной токсичности, как упоминалось выше. После проведения обширных опытов эта проблема была преодолена добавлением яичного лецитина в водную фазу. Исследования этих процессов описаны в примерах I-VI. Пример II и пример III, которые являются вариантами примера I, все представляют настоящее изобретение, в то время как примеры IV, V и VI не входят в сферу изобретения. В примере VII приведено исследование in-vitro токсичности по отношению к эритроцитам человека. Пример VIII и пример XI описывают исследование токсичности у мышей, крыс и собак. Пример IX описывает фармакокинетическое исследование у кроликов и пример Х описывает исследование распределения в органах у мышей.

Наблюдение, что амфотерицин В, диспергированный в масле, и яичный лецитин, диспергированный в воде, дает эмульсию с очень низкой токсичностью, предполагает сильное взаимодействие между каплями масла и амфотерицином В. Следовательно, эмульсию амфотерицина В можно рассматривать как резервуар мономерной формы амфотерицина В, и вследствие высокой стабильности состава только ограниченное количество свободного амфотерицина В будет постепенно высвобождаться. Мономерная форма амфотерицина В способна связываться с эргостеролом грибковых клеток, но инертна к холестерину клеток хозяина-млекопитающего и, следовательно, вызывает меньшую токсичность. В случае обычного состава амфотерицина В высвобождение высоких уровней свободного амфотерицина В в плазме приводит к наличию самоассоциированных олигомеров в системе кровообращения. Эти олигомерные формы взаимодействуют с содержащими холестерин хозяйскими клеточными мембранами и, следовательно, вызывают большую токсичность. Это объясняет механизм низкой токсичности эмульсии амфотерицина В настоящего изобретения по сравнению с обычным составом. Более низкие пиковая концентрация и значения AUC в сыворотке (пример IX) и соответственно более быстрое отложение амфотерицина В в тканях (пример Х-А) также объясняют причину более низкой токсичности эмульсии амфотерицина В настоящего изобретения. Низкая токсичность подтверждается данными, приведенными в примерах VIII-A, VIII-B и VIII-C.

Эти исследования токсичности показывают, что хотя парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии продукта изобретения, по-видимому, аналогичен продукту, приведенному в патенте Японии 11-60491 (1989), продукт настоящего изобретения имеет характерную биологическую низкую токсичность благодаря способу получения.

Способ настоящего изобретения обеспечивает эмульсионный продукт, который содействует образованию мономеров из-за медленного высвобождения амфотерицина В в плазме при инъекционном применении, что не происходит с продуктом, полученным по способу, приведенному в патенте Японии 11-60491 (1989). Таким образом, структура эмульсии настоящего изобретения отличается от той, которая получена по патенту Японии, как характеризуется исследованиями токсичности. Следовательно, эмульсию настоящего изобретения обозначают как структурированную эмульсию.

В основном примере осуществления изобретения амфотерицин В диспергируют в масляной фазе, так что порошок амфотерицина В покрывается маслом. Яичный лецитин, используемый как эмульгатор, диспергируют в водной фазе.

В другом примере осуществления изобретения гомогенизирование осуществляют в ходе повторяющихся циклов, чтобы достичь распределения частиц по размеру менее 2 мкм.

В следующем примере осуществления изобретения конечный парентеральный состав покрытого маслом амфотерицина В в форме структурированной эмульсии стерилизуют обработкой в автоклаве на конечной стадии процесса получения.

Отличия от известного уровня техники:

Можно увидеть из следующего ниже, что способ настоящего изобретения отличается от указанных патентов.

а) Способ настоящего изобретения отличается от патента США 5364632 (1994) тем, что в нем не используют растворитель для амфотерицина В; не осуществляют процесса приготовления пленки амфотерицина В и фофсолипида с последующей гидратацией; не используют масло МСТ с добавленным -токоферолом; регулируют рН водной фазы, содержащей яичный фосфатид, до 8-11; осуществляют конечную стадию стерилизации с образованием продукта, который имеет низкую токсичность и хорошее распределение в ретикулоэндотелиальной системе (RES).

Использование такого большого количества растворителя затрудняет промышленное применение способа. Оказалось, что размер частиц в различных примерах менее 100 нм, однако нет сообщений о токсичности состава.

В способе настоящего изобретения низкая токсичность сохраняется даже при 5 мг/мл, что является преимуществом при лечении, так как требуется небольшой инъецируемый объем.

b) Способ настоящего изобретения отличается от патента Японии 11-60491 (1989) тем, что размер глобулы/частицы эмульсии составляет 0,1-0,2 мкм в патенте Японии, а в настоящем изобретении до 2 мкм.

В способе настоящего изобретения яичный фосфатид добавляют в водную фазу и регулируют рН водной фазы до 8-11.

Срок хранения продукта настоящего изобретения свыше 2 лет, а продукта патента Японии - порядка 10 дней или нескольких недель.

Большое число поддерживающих эмульсию агентов необходимо использовать в способе патентов Японии, что не требуется для лекарственной эмульсии настоящего изобретения.

Способ настоящего изобретения создает стерильный продукт, стерилизуемый на конечной стадии процесса в автоклаве, тогда как продукт по патенту Японии не стерилизуется.

c) Продукт, полученный по способу патента Японии 4-173736 (1992), не содержит частиц, имеющих диаметр более 1 мкм, и этот продукт не содержит масляного компонента и, следовательно, отличается от состава настоящего изобретения.

d) В патенте США 5389373 (1995) амфотерицин В добавляли в предварительно полученную эмульсию, тогда как в способе настоящего изобретения амфотерицин В диспергируют в масляной фазе.

e) В европейском патенте ЕР 0700678 (1996) эмульсия амфотерицина В как таковая не описана. Одно лекарственное средство приблизительно из 70 лекарственных средств определено в патенте как средство, которое «может быть приготовлено как липидная эмульсия».

Эмульсия, приведенная в этом патенте, по существу должна содержать аминокислоты и лимонную кислоту или их соли, которые вообще не требуются в способе настоящего изобретения.

Способ получения эмульсии в данном патенте, в основном, начинается с получения фосфолипидной пленки с лекарственным средством или без него. Эта процедура совсем не нужна в способе настоящего изобретения.

В способе получения эмульсии процедура предусматривает различные схемы добавления эмульгатора, тогда как в способе настоящего изобретения процедура устанавливает добавление эмульгатора только в водную фазу.

Целью изобретения, упоминаемой в европейском патенте ЕР 0700678 (1996), является, в основном, преодоление проблемы обесцвечивания липидной эмульсии с использованием лимонной кислоты и аминокислот, тогда как задачей настоящего изобретения является создание структурированной типа масло в воде эмульсии покрытого маслом амфотерицина В, имеющей низкую токсичность, характеризуемую LD₅₀ по меньшей мере 400 мг/кг у мышей.

Хотя настоящее изобретение описано относительно конкретных примеров осуществления, специалистам в данной области техники понятно, что могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за пределы существа и объема изобретения.

Примеры

Изобретение далее поясняется посредством примеров. Примеры являются только иллюстрацией и не ограничивают объем изобретения.

Все исходные материалы, использованные в примере, имели чистоту, пригодную для парентерального введения. Было использовано обычного типа оборудование. Всю обработку осуществляли в зоне с контролируемой средой. Защитную азотную атмосферу применяли при обработке проб.

Амфотерицин В, использованный в примерах и пригодный для парентерального введения, получен от Alpharma и удовлетворяет спецификации USP (фармакопея США).

Очищенный яичный лецитин, использованный в примерах и пригодный для парентерального введения, был получен из липоидов.

Промышленно доступный инъекционный раствор амфотерицина В, содержащий дезоксихолат, обозначается как обычный инъекционный раствор амфотерицина В повсюду в фармакокинетических исследованиях, исследованиях распределения в органах и исследованиях токсичности. Только один сорт обычного состава используют в ходе всех исследований.

Пример 1

Масляную фазу получают диспергированием 1 г амфотерицина В в 40 г соевого масла.

Водную фазу получают добавлением 4,5 г глицерина в 150 мл воды и затем диспергируют в ней 2,4 г яичного фосфатида. Регулируют рН до 10,6 с использованием водного раствора гидроксида натрия.

Масляную фазу, полученную, как указано выше, добавляют в водную фазу при перемешивании с высокой скоростью. Объем доводят до 200 мл водой. Полученную эмульсию пропускают через гомогенизатор высокого давления. Гомогенизацию повторяют до получения размера глобул/частиц менее 2 мкм. Продукт охлаждают приблизительно до 20°С сразу после каждого цикла гомогенизации.

Гомогенизированную эмульсию фильтруют через 2-микронный фильтр и заливают в емкости в атмосфере азота, герметизируют и стерилизуют в автоклаве.

Полученный по этому процессу продукт имеет следующий состав, г:

a) Амфотерицин В	1,0
b) Соевое масло	40,0
c) Очищенный яичный фосфатид	2,4
d) Глицерин	4,5
e) Гидроксид натрия	по потребности для
	регулирования рН
f) Вода	по потребности до 200 мл

Полученный стерилизованный продукт подвергают исследованиям на токсичность у мышей, крыс и собак (примеры VIII-A, VIII-B, VIII-C, VIII-D), фармакокинетическим исследованиям (пример IX), исследованиям распределения в органах (пример Х-А, Х-В). Исследование стабильности проводили путем хранения продукта в пробирках при 2-8°С, и результаты представлены ниже

ДАННЫЕ СТАБИЛЬНОСТИ ПРОДУКТА ПРИМЕРА I

Период	Внешний вид	Содержание Амфотерицина В
исходный	Желто окрашенная однородная эмульсия	104,6%
6 месяцев	Желто окрашенная однородная эмульсия	101,3%
1 год	Желто окрашенная однородная эмульсия	99,4%

Исследования токсичности ясно показывают, что эмульсия, полученная по способу изобретения, является синергическим составом.

Пример II

Порошок амфотерицина В тонко размельчают с использованием струйной мельницы до частиц размером менее 10 мкм.

Масляную фазу получают диспергированием 1 г амфотерицина В (размельченного) в 40 г соевого масла.

Водную фазу получают добавлением 4,5 г глицерина в 150 мл воды и затем диспергируют в ней 2,4 г яичного фосфатида. Регулируют рН до 10,8 с использованием водного раствора гидроксида натрия.

Масляную фазу, полученную, как указано выше, добавляют в водную фазу при перемешивании с высокой скоростью. Объем доводят до 200 мл водой. Полученную эмульсию пропускают через гомогенизатор высокого давления. Гомогенизацию повторяют до получения глобул/частиц размером менее 2 мкм. Гомогенизированную эмульсию фильтруют через 2-микронный фильтр и заливают в емкости в атмосфере азота, герметизируют и обрабатывают в автоклаве.

Полученный по этому процессу продукт имеет следующий состав, г:

a) Амфотерицин В (размельченный)	1,0
b) Соевое масло	40,0
c) Очищенный яичный фосфатид	2,4
d) Глицерин	4,5
e) Гидроксид натрия	по потребности
	для регулирования рН
f) Вода	по потребности до 200 мл

Пример подтверждает, что охлаждение во время гомогенизации не требуется, если используют тонко размельченный амфотерицин В.

Пример III

Масляную фазу получают диспергированием 1 г амфотерицина В в 40 г соевого масла, предварительно нагретого до 70°С.

Водную фазу получают добавлением 4,5 г глицерина в 150 мл воды, предварительно нагретой до 65°С, и затем диспергируют в ней 2,4 г яичного фосфатида. Регулируют рН до 10,8 с использованием водного раствора гидроксида натрия.

Масляную фазу при 70°С добавляют в водную фазу при 65°С при перемешивании с высокой скоростью. Объем доводят до 200 мл водой. Полученную эмульсию пропускают через гомогенизатор высокого давления. Гомогенизацию повторяют до получения глобул/частиц размером менее 2 мкм. Продукт охлаждают приблизительно до 20°С сразу после каждого цикла гомогенизации.

Гомогенизированную эмульсию фильтруют через 2-микронный фильтр и заливают в емкости в атмосфере азота, герметизируют и стерилизуют в автоклаве при 110°С в течение 40 мин.

Полученный по этому процессу продукт имеет следующий состав, г:

a) Амфотерицин В	1,0
b) Соевое масло	40,0
c) Очищенный яичный фосфатид	2,4
d) Глицерин	4,5
e) Гидроксид натрия	по потребности
	для регулирования рН
f) Вода	по потребности до 200 мл

Содержание амфотерицина В в полученном продукте анализировали и нашли его удовлетворительным и свидетельствующим о том, что эмульгирование можно проводить при повышенной температуре.

Пример IV

Масляная фаза - 40 г соевого масла

Водную фазу получают добавлением 4,5 г глицерина в 150 мл воды и затем диспергируют в ней 2,4 г яичного фосфатида. 1 г амфотерицина В диспергируют в этом растворе яичного фофсфатида и регулируют рН до 10,8 с использованием водного раствора гидроксида натрия.

Масляную фазу добавляют в водную фазу при перемешивании с высокой скоростью. Объем доводят до 200 мл водой. Полученную эмульсию пропускают через гомогенизатор высокого давления. Гомогенизацию повторяют до получения глобул/частиц размером менее 2 мкм. Продукт охлаждают приблизительно до 20°С сразу после каждого цикла гомогенизации.

Гомогенизированную эмульсию фильтруют через 2-микронный фильтр и заливают в емкости в атмосфере азота, герметизируют и стерилизуют в автоклаве.

Полученный по этому процессу продукт имеет следующий состав, г:

a) Амфотерицин В	1,0
b) Соевое масло	40,0
c) Очищенный яичный фосфатид	2,4
d) Глицерин	4,5
e) Гидроксид натрия	по потребности
	для регулирования рН
f) Вода	по потребности до 200 мл

Стерилизованный продукт был подвергнут исследованиям на токсичность согласно деталям, приведенным в примере XI, и оказалось, что продукт вызывает токсичные симптомы кардиальной токсичности. Следовательно, добавление амфотерицина В в водную фазу не рекомендуется.

Пример V

Масляную фазу получают растворением 2,4 г очищенного яичного фосфатида при перемешивании в 40 г соевого масла, предварительно нагретого до 70°С.

Водную фазу получают добавлением 4,5 г глицерина в 150 мл воды, предварительно нагретой до 65°С, и затем диспергируют в ней 1 г амфотерицина В. Регулируют рН до 11,0 с использованием водного раствора гидроксида натрия.

Масляную фазу при 70°С добавляют в водную фазу при 65°С при перемешивании с высокой скоростью. Объем доводят до 200 мл водой. Полученную эмульсию пропускают через гомогенизатор высокого давления. Гомогенизацию повторяют до получения глобул/частиц размером менее 2 мкм. Продукт охлаждают приблизительно до 20°С сразу после каждого цикла гомогенизации.

Гомогенизированную эмульсию фильтруют через фильтр 2 мкм и заливают в емкости в атмосфере азота, герметизируют и стерилизуют в автоклаве.

Полученный по этому процессу продукт имеет следующий состав, г:

a) Амфотерицин В	1,0
b) Соевое масло	40,0
c) Очищенный яичный фосфатид	2,4
d) Глицерин	4,5
e) Гидроксид натрия	по потребности для
	регулирования рН
f) Вода	по потребности до 200 мл

Стерилизованный продукт был подвергнут исследованиям на токсичность согласно деталям, приведенным в примере XI, и оказалось, что продукт вызывает токсичные симптомы кардиальной токсичности. Следовательно, добавление очищенного яичного фосфатида в масляную фазу и добавление амфотерицина В в водную фазу не рекомендуются.

Пример VI

40 г соевого масла нагревают до 75°С и растворяют в нем 2,4 г яичного лецитина при перемешивании. 1 г амфотерицина В диспергируют при перемешивании в масляной фазе с образованием однородной дисперсии амфотерицина В в масляной фазе. Масляную фазу продувают азотом в течение 15 мин.

150 мл нагревают до 65°С. Добавляют в нее 4,5 г глицерина при перемешивании. Регулируют рН до 10,65 с использованием разбавленного раствора гидроксида натрия. Масляную дисперсию амфотерицина В добавляют в водную фазу при высокоскоростном перемешивании с образованием грубой эмульсии. Объем доводят до 200 мл водой. Грубую эмульсию гомогенизируют с использованием APV-гомогенизатора высокого давления до получения гомогенизированного продукта, фильтруемого через стекловолокнистый 2-микронный фильтр. Продукт охлаждают приблизительно до 20°С сразу после каждого цикла гомогенизации. Фильтрованный продукт заливают в стеклянные емкости в атмосфере азота, герметизируют и стерилизуют в автоклаве.

Полученный по этому процессу продукт имеет следующий состав, г:

a) Амфотерицин В	1,0
b) Соевое масло	40,0
c) Очищенный яичный фосфатид	2,4
d) Глицерин	4,5
e) Гидроксид натрия	по потребности
	для регулирования рН
f) Вода	по потребности до 200 мл

Стерилизованный продукт подвергают исследованиям на токсичность согласно деталям, приведенным в примере XI, и обнаруживают, что продукт вызывает токсичные симптомы кардиальной токсичности. Следовательно, добавление очищенного яичного фосфатида в масляную фазу не рекомендуется.

Парентеральный состав структурированной типа масло в воде эмульсии покрытого маслом амфотерицина В в следующих примерах обозначается как эмульсия амфотерицина В (5 мг/мл).

Пример VII

Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно процессу и прописи примера I, подвергают испытанию in-vitro на токсичность по отношению к эритроцитам человека (RBCs) наряду с обычным составом амфотерицина В, содержащим дезоксихолат натрия.

МАТЕРИАЛ И СПОСОБ

Тест-система: RBCs от обыкновенных доноров-мужчин.

Тест-материал: Эмульсия амфотерицина В (5 мг/мл), полученная согласно процессу и прописи примера I.

Сравнительный материал: обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл).

Планирование исследования: Кровь собирают в гепаризированные пробирки. Эритроциты (RBCs) выделяют центрифугированием при 450 g в течение 10 мин при 4°С. Плазму и лейкоцитную пленку удаляют и эритроциты (RBCs) промывают 3 раза фосфатно-солевым буферным раствором (PBS, рН 7,4) при 4°С перед диспергированием в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS). Затем подсчитывают на счетчике клеток Sysmex KX-21 и используют в день сбора. Для определения чувствительности эритроцитов (RBC) к амфотерицину В 2 мл клеточной суспензии (5×10⁷ клеток/мл) в PBS инкубируют в течение 1 часа при 37°С с эмульсией амфотерицина В или обычным инъекционным раствором амфотерицина В (см.табл.1). Эритроциты (RBCs) центрифугируют в течение 5 мин при 1500 g и промывают 3 раза PBS. Осадок эритроцитов (RBCs) в пробирке, лизированный 2 мл воды, перемешивают и центрифугируют (1500 g, 5 мин), чтобы удалить оболочки. Гемоглобин измеряют на счетчике клеток. Высвобождение рассчитывают как разность между контрольными и обработанными клетками и выражают в процентах от содержания общего гемоглобина.

ТАБЛИЦА 1. Дозы составов амфотерицина В, исследованные in-vitro на токсичность по отношению к эритроцитам человека (RBCS)
№ группы	Группа	Доза (мг/л)
1	Контрольная
2	Обычный состав (5 мг/мл)	5, 50, 100, 200
3	Эмульсия амфотерицина В (5 мг/мл)	5, 50, 100, 200

Статистический анализ:

Полученные данные были проанализированы сравнением обработанных групп с негативной контрольной группой при использовании теста Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ТАБЛИЦА 2 Содержание гемоглобина в г/дл для составов амфотерицина В
Доза (мг/л)	Процент гемолиза
	Обычный инъекционный раствор амфотерицина В	Эмульсия
5	77,5±0,0	2,04±0,0
50	100±0,0	4,08±0,0
100	100±0,0	4,18±0,82
200	100±0,0	9,49±4,48

Утечка гемоглобина увеличивается с увеличением концентраций амфотерицина В в обычном инъекционном растворе амфотерицина В и эмульсии (см. фиг.1). Для обычного инъекционного раствора амфотерицина В средняя утечка составляла 77,55% для 5 мг/л и 100% для 50 мг/л, 100 мг/л, 200 мг/л. Для эмульсии средняя утечка составляла 2,04% для 5 мг/л, 4,08% для 50 мг/л, 4,18% для 100 мг/л и 4,49% для 200 мг/л. Эмульсия амфотерицина В значительно менее токсична, чем обычный инъекционный раствор амфотерицина В при исследованных дозах (Р<0,05), см.табл.2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, данные in vitro токсичности ясно указывают на то, что эмульсия амфотерицина В, приготовленная в примере I, менее токсична, чем обычный инъекционный раствор амфотерицина В, когда клетками-мишенями являются эритроциты человека (RBCs).

Пример VIII

Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), приготовленную согласно процессу и прописи примера I, подвергают исследованию in vitro токсичности у мышей наряду с обычным инъекционным раствором амфотерицина В, содержащим дезоксихолат натрия.

Исследование проводили со следующими целями:

Чтобы установить значения LD₅₀ для указанных выше двух составов на основании исследований однократной дозы.

Чтобы определить влияние на токсичность для указанных выше 2 составов на основании исследований повторной дозы.

VIII-A) ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ОДНОКРАТНОЙ ДОЗЫ У МЫШЕЙ

МАТЕРИАЛ И СПОСОБ

Тест-система: Для исследования использовали женские особи мышей Swiss albino массой 20-22 г, полученные из питомника от Bharat & Vaccines Ltd (BSLV). Животных обеспечивали стандартным кормом и водой Aquaguard , по желанию.

Тест-материал: Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно процессу и прописи примера I, вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Сравнительный материал: Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл) вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Планирование исследования: Животных разделяли на две группы по 8 животных в каждой группе, а именно на группы 1 и 2. Группа 1 получала различные дозы обычного инъекционного раствора амфотерицина В, группа 2 получала дозы эмульсии амфотерицина В.

ТАБЛИЦА 3 Дозы исследуемых составов амфотерицина в для исследования токсичности однократной дозы у мышей
№ группы	Группа	Доза (мг/кг массы тела)
1	Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл)	5, 7, 5, 10, 15, 20
2	Эмульсия амфотерицина В (5 мг/мл)	50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 375

Все группы получали инъекции внутривенно. Всех животных наблюдали в течение 72 часов, чтобы обнаружить признаки клинической токсичности и смертность. Процент смертности рассчитывали для всех доз.

Статистический анализ: Использовали способ анализа Probit для определения значений LD₅₀ для всех составов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ТАБЛИЦА 4 Процент смертности для различных доз двух составов
Группа	Доза (мг/кг)	Процент смертности
Обычный инъекционный раствор амфотерицина В	2,5	33,33
	5	50
	7,5	66,67
	10	83,33
	15	100
	20	100
Эмульсия амфотерицина В	50	0
	100	0
	150	0
	200	0
	250	16,67
	300	16,67
	350	33,33
	375	42,85

Из таблицы 4 видно, что обычный состав обычного инъекционного раствора амфотерицина В более токсичен, чем эмульсия амфотерицина В. Процент смертности для составов увеличивается в зависимости от дозы. Значения LD₅₀ для 2 составов определяли способом анализа Probit. На фиг.2 представлен график зависимости процента смертности от дозы V_s для двух составов.

Состав	Определенный LD50 (мг/кг)
Обычный инъекционный раствор амфотерицина В	5
Эмульсия амфотерицина В	432,62

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: Эмульсия амфотерицина В, приготовленная в примере 1, имеет более высокое значение LD ₅₀ и менее токсична, чем обычный инъекционный раствор амфотерицина В.

VIII-B) ИССЛЕДОВАНИЯ ТОКСИЧНЫХ ПОВТОРНЫХ ДОЗ У МЫШЕЙ

МАТЕРИАЛ И СПОСОБ

Тест-система: Для исследования использовали женские особи мышей Swiss albino массой 20-22 г, поступившие из питомника от Bharat & Vaccines Ltd (BSVL). Животных обеспечивали стандартным кормом и водой Aquaguard , по желанию.

Тест-материал: Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно процессу и прописи примера I, вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Сравнительный материал: Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл) вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Планирование исследования: Животных разделяли на три группы по 6 животных в каждой группе, а именно на группы 1, 2 и 3. Группа 1 получала чистый носитель эмульсии (контрольная), группа 2 получала различные дозы обычного инъекционного раствора амфотерицина В, группа 3 получала различные дозы эмульсии амфотерицина В.

ТАБЛИЦА 5 Дозы обычного состава амфотерицина В и исследуемой эмульсии амфотерицина в для исследования токсичности повторной дозы у мышей
№ группы	Группа	Доза (мг/кг массы тела)
1	Контрольная	носитель
2	Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл)	1,5, 2,5
3	Эмульсия амфотерицина (5 мг/мл)	10, 20, 40

Все группы получали инъекции согласно таблице 5 ежедневно внутривенно. Контрольные группы получали максимальный объем носителя. Всех животных наблюдали, чтобы обнаружить признаки клинической токсичности. Массу тела регистрировали каждый второй день в течение 14 дней. Также животных наблюдали на смертность в течение 14 дней. Процент смертности рассчитывали для всех доз.

Статистический анализ: Полученные данные анализировали для сравнения изменения массы тела во время исследования. Такие изменения сравнивали между обработанными группами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ТАБЛИЦА 6 Процент смертности для различных доз двух составов
Группа	Доза (мг/кг)	Процент смертности
Обычный инъекционный раствор амфотерицина В	1,5	20
	2,5	80
Эмульсия амфотерицина В	10	0
	20	0
	40	30
Контрольная	носитель	0

Из таблицы 6 видно (см. также фиг.3), что обычный инъекционный раствор амфотерицина В более токсичен, чем эмульсия амфотерицина В. Процент смертности для составов увеличивался в зависимости от дозы. Для группы, обработанной носителем в течение 14 дней, наблюдалось отсутствие смертности. Для эмульсии амфотерицина В характерна меньшая токсичность, чем для обычного инъекционного раствора амфотерицина В даже при более высоких дозах.

ТАБЛИЦА 7 Средние массы тела при различных дозах для исследования токсичности при повторных дозах у мышей
Группа	Доза мг/кг	Средняя масса тела±SDEV в GNS за 14 дней
		D0	D2	D4	D6	D8	D9	D11	D12	D14
Обычный инъекционный раствор амфотерицина В	1,5	19,56±2,74	19,01±2,83	18,64±3,81	21,33±14,38	18,92±4,57	19,71±4,36	19,94±4,15	22,88±4,25	19,82±5,014
	2,5	17,54±3,14	15,72±2,92	16,88±3,43	18,85±1,76	16,35±1,62	16,05±1,06	17,3±1,27	19,15±1,34	17,7±1,83
Эмульсия амфотерицина В	10	16,3±1,19	17±2,01	14,46±1,83	19,57±3,04	17,51±2,61	17,96±2,87	19,01±2,59	21,21±2,45	19,76±2,79
	20	16,95±2,33	17,42±1,87	16,96±1,99	20,61±2,53	17,54±2,8	17,91±3,03	18,83±3,06	19,29±3,46	19,03±3,78
	40	19,87±2,83	18,96±3,36	16,43±2,19	19,95±2,56	17,23±2,75	17,53±2,83	17,93±2,65	19,38±3,01	17,88±3,00
Контрольная	0	18,74±1,97	17±2,11	16,42±3,12	16,98±2,87	20,86±3,96	20,08±4,56	21,24±4,39	22,6±4,90	22,74±4,97
D: указывает день наблюдения; SDEV указывает стандартное отклонение.

В группе, обработанной обычным инъекционным раствором амфотерицина В, зарегистрировано снижение массы тела животных при 1,5 мг/кг и 2,5 мг/кг, а для эмульсии амфотерицина В - снижение массы тела животных от 20 мг/кг и 40 мг/кг (см. фиг.4). На шестой и восьмой дни масса тела мышей, обработанных дозой 20 мг/кг и 40 мг/кг эмульсии амфотерицина В, значительно меньше, чем у мышей, обработанных дозой 10 мг/кг эмульсии амфотерицина В (табл.7).

Гистопатологическое исследование показало, что имели место некоторые дегенеративные изменения в паренхиматозных клетках печени и почек, которые могут происходить из-за общего метаболизма у мышей. Старческие миофибриллы, вероятно, были результатом гипоксии при умерщвлении. В основном изменения были обратимого типа. Действие амфотерицина В больше проявлялось на печени и почках и в некоторой степени на сердце, вызывая очень резкие поражения. Интенсивность в основном зависит от дозы. Для обычного инъекционного раствора амфотерицина В поражения проявлялись при более низких уровнях доз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эмульсия амфотерицина В показала меньшую токсичность, чем обычный инъекционный раствор амфотерицина В.

VIII-C) ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ОДНОКРАТНОЙ ДОЗЫ У КРЫС

МАТЕРИАЛ И СПОСОБ

Тест-система: Для исследования использовали крыс любого пола Wistar albino массой 140-160 г, полученных из питомника от Bharat Serums Ltd & Vaccines (BSVL). Животных обеспечивали стандартным кормом и водой Aquaguard , по желанию.

Тест-материал: Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно процессу и прописи примера I, вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Сравнительный материал: Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл) вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Планирование исследования: Животных разделяли на две группы по 6 животных в каждой группе, а именно на группы 1 и 2. Группа 1 получала различные дозы обычного инъекционного раствора амфотерицина В, группа 2 получала дозы эмульсии амфотерицина В.

ТАБЛИЦА 8 Дозы обычного инъекционного раствора амфотерицина В и исследуемой эмульсии амфотерицина в для исследования токсичности однократной дозы у крыс
№ группы	Группа	Доза (мг/кг массы тела)
1	Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (мг/мл)	1,25; 2,5; 5
2	Эмульсия амфотерицина В (мг/мл)	50, 100, 150

Все группы получали инъекции внутривенно согласно таблице 8. Всех животных наблюдали в течение 72 часов, чтобы обнаружить признаки клинической токсичности и смертность. Процент смертности рассчитывали для всех доз.

Статистический анализ: Использовали способ анализа Probit для определения значений LD₅₀ для всех составов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ТАБЛИЦА 9 Процент смертности для различных доз двух составов
Группа	Доза (мг/кг)	Процент смертности
Обычный инъекционный раствор амфотерицина В	1,25	0
	2,5	33,33
	5	100
Эмульсия амфотерицина В	50	0
	100	0
	150	16,67 - через 24 ч 33,33 - через 48 ч 50 - через 72 ч

Из таблицы 9 видно (см. также фиг.5), что обычный инъекционный раствор амфотерицина В более токсичен, чем эмульсия амфотерицина В. Процент смертности для составов увеличивается в зависимости от дозы. Значения LD ₂₀ для 2 составов определяли способом анализа Probit. Для эмульсии амфотерицина В 50%-ную смертность наблюдали через 72 часа. После 72 часов изменений массы тела не обнаружено.

Состав	Определенный LD 50 (мг/кг)
Обычный инъекционный раствор амфотерицина В	2,5-5
Эмульсия амфотерицина В	>100

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эмульсия амфотерицина В менее токсична, чем обычный инъекционный раствор амфотерицина В.

VIII-D) ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ОДНОКРАТНОЙ ДОЗЫ У СОБАК

Данное исследование проводили с целью оценить токсичность и безопасность эмульсии амфотерицина В у собак.

МАТЕРИАЛ И СПОСОБ

Тест-система: Для исследования использовали двенадцать здоровых собак любого пола средней массы 10-15 кг. Животных содержали в стандартных условиях в Kennel с доступом к корму и воде, по желанию.

Тест-материал: Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно процессу и прописи примера I, вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Сравнительный материал: Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл) вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Планирование исследования: Животных разделяли на две группы по 6 животных в каждой группе, а именно на группы 1 и 2. Группа 1 получала обычный инъекционный раствор амфотерицина В, группа 2 получала эмульсию амфотерицина В, приготовленную в примере I.

ТАБЛИЦА 10 Подробные данные о дозах обычного инъекционного раствора амфотерицина в и исследуемой эмульсии амфотерицина в для исследования токсичности однократной дозы у собак

№ группы	Группа	Доза (мг/кг массы тела)
1	Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл)	1
2	Эмульсия амфотерицина В (5 мг/мл)	1

Все группы получали инъекции согласно таблице 10, растворенные в 6-20 мл 5%-ной декстрозы внутривенно. Всех животных наблюдали на признаки клинической токсичности и в течение 21 дня после инъекций. Животных взвешивали при посещениях V0, V2, V4, V6 и V8. Кровь отбирали для гематологического и биохимического исследований (анализ функции печени и функции почек) при V0, V4 и V8.

График посещений:

V0 базисное посещение				V5 через 12 дней после V0
V1 через 2 дня после V0				V6 через 15 дней после V0
V2 через 3 дня после V0				V7 через 18 дней после V0
V3 через 6 дней после V0				V8 через 21 день после V0
V4 через 9 дней после V0
Посещение	V0	V1	V2		V3	V4	V5	V6	V7	V8
Введение		Х	Х		Х	Х	Х	Х	Х	Х
лекарственного
средства
Гематология и	Х					Х				Х
биохимия

Статистический анализ:

Полученные данные анализировали для сравнения изменений параметров от базисной линии во время исследования. Изменения сравнивали между обработанными группами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ТАБЛИЦА 11 Среднепроцентное изменение гематологических параметров от базисной линии при различных посещениях у собак
Группа	Процентное изменение гематологических параметров ±SD
	Посещение	RBC	Гемог лобин	CV	Гемат окрит	WBC (Общ,)	Нейтр офил	Лимф оцит	Моноцит	Эозин офил	Базофил
Обычный инъекционный раствор	V4	-6,61±2,58	-9,37±5,26	-4,29-±3,75	-10,46±4,77	-14,68±16,77	-11,37±4,07	-26,86 ±10,81	-9,36±33,46	23,33±49,15	0,0±0,0
амфотерицина В	V8	-10,24±2,38	-21,68±2,15	-7,31±4,29	-16,91±4,95	-13,66±6,93	-15,07±6,23	-30,02±13,96	-23,13±37,5	6,11±4,83	0,0±0,0
Эмульсия амфотерицина В	V4	-8,69±3,4	-16,28±8,24	-10,31±13,92	-18,13±11,51	-34,91±6,96	-5,65±3,44	-22,23±14,68	13,39±25,39	67,85±68,57	0,0±0,0
	V8	-14,7±5,63	-10,9±4,77	-12,57±6,26	-25,45±13,77	-32,7±8,52	-9,21±7,65	-21,84±18,71	0,69±2,95	25,19±52,32	0,0±0,0
SD обозначает стандартное отклонение.

Обнаружено, что все гематологические параметры показывают изменения от значений базисной линии в обеих группах (табл.11). Процентное падение количества лейкоцитов для эмульсии значительно выше, чем у обычного состава, но находится в пределах стандартного диапазона и, следовательно, не имеет клинического значения.

SD указывает стандартное отклонение.

Параметр функции печени (см. фиг.6 и табл.12), AST, показал увеличение 334,38% при V8 в группе обычного инъекционного раствора амфотерицина В, тогда как в группе эмульсии амфотерицина В параметр ограничен только 108,86%. Подобные результаты наблюдали для ALT и общего билирубина. Увеличение для обычной группы статистически значимо по сравнению с эмульсией.

Параметры функции почек (см. также фиг.7) значительно различались для группы обычного инъекционного раствора амфотерицина В. Отклонения для эмульсии амфотерицина В значительно меньше, чем у группы обычного инъекционного раствора амфотерицина В.

Нефротоксичность, первичная токсичность амфотерицина В, возникает в результате неселективного цитотоксического взаимодействия между амфотерицином В обычного инъекционного раствора амфотерицина В (содержащего дезоксихолат натрия) и холестерином клеток млекопитающего. Цитотоксичность млекопитающего ослабляется введением амфотерицина В в форме эмульсионного состава на основе липида. Это изменяет сродство амфотерицина В и уменьшает его селективный перенос в содержащие холестерин клетки млекопитающего.

ТАБЛИЦА 13 Средняя масса тела при различных дозах для исследования токсичности однократной дозы у собак
Группа	Доза (мг/кг)	Средняя масса тела±SD В GMS для 14 дней V0 V2 V4 V6 V8
Обычный инъекционный раствор амфотерицина В	1	15,0±3,85	14,33±3,38	14,0±3,17	13,66±3,12	13,166±3,12
Эмульсия амфотерицина В (BSVL)	1	15,5±2,96	15,0±3,01	15,0±2,774	14,5±2,68	14,16±2,639
SD указывает стандартное отклонение

Группа получавшая обычный инъекционный раствор амфотерицина В показала большее уменьшение массы тела у животных по сравнению с животными, получавшими эмульсию амфотерицина В (см. фиг.8 и табл.13).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эмульсия амфотерицина В создает значительную защиту против гепатотоксичности и нефротоксичности по сравнению с обычным инъекционным раствором амфотерицина В.

Пример IX

Использовали эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно процессу и прописи примера I, для оценки фармакокинетических параметров у кроликов по сравнению с обычным инъекционным раствором амфотерицина В.

МАТЕРИАЛ И СПОСОБ

Тест-система: Для исследования использовали мужские особи белых кроликов New Zealand массой 1,5-2,0 кг, полученных из питомника от Bharat Serum & Vaccines Ltd (BSVL). Животных обеспечивали стандартным кормом и водой Aquaguard , по желанию.

Тест-материал: Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно процессу и прописи примера I, вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Сравнительный материал: Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл) вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Планирование исследования: Животных разделяли на две группы по 3 животных в каждой группе, а именно на группы 1 и 2. Группы 1 и 2 получали обычный инъекционный раствор амфотерицина В и эмульсии амфотерицина В соответственно. Пробы крови отбирали на 5, 15, 30, 45 и 60 минутах и через 1, 2, 3, 4, 5, 24 и 48 часа после внутривенного введения однократной инъекции ударной дозы. Пробы центрифугировали при 3000-4000 об/мин для отделения плазмы. Плазму хранили при -20°С до анализа.

Способ введения: через вену наружного уха кролика

ТАБЛИЦА 14 Дозы составов амфотерицина в для фармакокинетических исследований у кроликов
№ группы	Группа	Доза (мг/кг массы тела)
1	Обычный инъекционный раствор амфотерицина	1
	В (5 мг/мл)
2	Эмульсия амфотерицина В (5 мг/мл)	5

Анализ содержания амфотерицина В

Содержание амфотерицина В в плазме анализировали способом фазовой ВЭЖХ (HPLC) с использованием колонки С-18. Амфотерицин В выделяли из плазмы с использованием HPLC чистоты диметилсульфоксида и ацетонитрила в соотношении 1:3:1. Пробы центрифугировали при 3000 об/мин и супернатант инжектировали в колонку.

Статистический анализ:

Полученные данные анализировали для сравнения обработанных групп испытанием по t-тесту Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ТАБЛИЦА 15 Приведены фармакокинетические параметры двух составов
Время (час)	Концентрация плазмы (мкг/мл)
	Эмульсия амфотерицина В (5 мг/кг)		Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (1 мг/кг)
0,083	0,387±0,176		0,499±0,133
0,25	0,196±0,101		0,274±0,076
0,5	0,119±0,018		0,313±0,118
0,75	0,103±0,0065		0,463±0,0
1	0,099±0,0078		0,245±0,007
2	0,099±0,0		0,216±0,0035
3	0,094±0,0		0,365±0,159
4	0,093±0,0		0,24±0,081
5	0,092±0,0		0,175±0,012
24	0,0±0,0		0,173±0,155
48	0,0±0,0		0,066±0,0
Параметры		Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (1 мг/кг)	Эмульсия амфотерицина В (5 мг/кг)
СМАХ (мкг/мл)		0,576±0,006	0,387±0,176
Т max(Ч)		0,083±0,0	0,083±0,0
T 1/2 (Ч)		1,89±0,728	6,622±10,63
AUC (мкг-ч/мл)		1,851±0,836	1,115±1,558
Vd(л)		1,47±1,26	26,144±18,522
Cl (мл/ч)		540,25±28,01	16062,31±12510,82

Не обнаружено значительной разницы в значениях С_МАХ, T_max , T_1/2, Vd между двумя составами. Что касается выведения, то эмульсию выводили из плазмы со значительно более высокой скоростью, чем обычный инъекционный раствор амфотерицина В (Р<0,05). Это указывает на то, что распределение эмульсии в тканях происходит более быстро, чем обычного инъекционного раствора амфотерицина В (см. табл.15 и фиг.9).

Пример X

Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно процессу и прописи примера I, использовали для исследования распределения в органах у мышей по сравнению с обычным инъекционным раствором амфотерицина В.

Настоящее исследование осуществляли со следующими целями:

Чтобы установить характер распределения в органах у мышей для двух составов из исследований однократной дозы.

Чтобы определить характер распределения в органах у мышей для двух составов из исследований повторной дозы.

Х-А) ИССЛЕДОВАНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ В ОРГАНАХ ОДНОКРАТНОЙ ДОЗЫ У МЫШЕЙ

МАТЕРИАЛ И СПОСОБ

Тест-система: Для исследования использовали женские особи мышей Swiss albino массой 20-22 г, полученных из питомника от Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL). Животных обеспечивали стандартным кормом и водой Aquaguard , по желанию.

Тест-материал: Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно процессу и прописи примера I, вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Сравнительный материал: Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл) вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Способ введения: внутривенно

Планирование исследования: Животных разделяли на две группы по 20 животных в каждой группе, а именно на группы 1 и 2. Группа 1 получала обычный инъекционный раствор амфотерицина В в дозе 1 мг/кг, а группа 2 получала эмульсию амфотерицина В в дозе 5 мг/кг (табл.16). Каждый раз пробу брали у 4 мыши. Образцы органов, а именно печени, легких, почек, селезенки и мозга, иссекали в конце соответствующих временных периодов, т.е. 0,5, 1, 2, 4, 24 часа. Органы сразу замораживали, чтобы прекратить ферментативные реакции. Органы взвешивали и добавляли трехкратный объем воды. Затем гомогенизировали.

ТАБЛИЦА 16 Дозы обычного инъекционного раствора амфотерицина В и исследуемой эмульсии амфотерицина в для исследования распределения в органах однократной дозы у мышей.
№ группы	Группа	Доза (мг/кг массы тела)
1.	Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл)	1
2.	Эмульсия амфотерицина В (5 мг/мл)	5

Анализ содержания амфотерицина В

Метанол добавляли к гомогенату в соотношении 3:1. Затем центрифугировали при высокой частоте оборотов 13000-14000 об/мин. Супернатант затем инжектировали в колонку ВЭЖХдля анализа амфотерицина В.

Статистический анализ:

Полученные данные анализировали для сравнения обработанных групп по способу t-теста Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ТАБЛИЦА 17 Приведены параметры распределения в органах для двух составов
Орган	Параметр	Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (1 мг/кг)	Эмульсия (5 мг/кг)
Печень	СМАХ (мкг/мл)	3,53	26,95
	Т max (ч)	1,0	24
	Т1/2 (ч)	14,5	34,61
	AUC (мкг-ч/мл)	79,97	1227,68
	Cl (мл/ч)	12,51	4,07
Селезенка	СМАХ (мкг/мл)	2,02	29,3
	Т max (ч)	0,5	24
	T1/2 (ч)	48,98	-113,88*
	AUC (мкг-ч/мл)	88,58	1836
	Cl (мл/ч)	11,29	-2,72*
Легкие	СМАХ (мкг/мл)	1,29	1,64
	Т max (ч)	2,0	4
	Tl/2 (ч)	48,87	212,63
	AUC (мкг-ч/мл)	89,69	510,93
	Cl (мл/ч)	11,15	9,786
Почка	С МАХ (мкг/мл)	1,15	0,437
	Тmax (ч)	0,5	4
	T1/2 (ч)	59,27	6,69
	AUC (мкг-ч/мл)	75,45	0,632
	Cl (мл/ч)	13,26	7911,39
Знак * указывает накопление амфотерицина В в тканях.

По сравнению с обычным инъекционным раствором амфотерицина В эмульсия амфотерицина В показывает более высокие уровни во всех органах за исключением почек (см. фиг.10а-10d и табл.17). Более высокие значения полупериода существования и низкие скорости выведения эмульсии дополнительно подтверждают эти данные. Таким образом, обнаружено, что поглощение органами амфотерицина В из эмульсии выше, чем из обычного инъекционного раствора амфотерицина В, что статистически существенно для селезенки (Р<0,05).

Нефротоксичность является основным недостатком, ассоциированным с лечением амфотерицином В, и из-за высоких уровней амфотерицина В в почках. Из AUC(_0- ) очевидно, что эмульсия достигает значительно более низких уровней амфотерицина В, чем обычный инъекционный раствор амфотерицина В (Р<0,05). Также эмульсия быстрее выводится из почек, что объясняет низкую токсичность и более высокие значения LD₅₀ по сравнению с составом обычного инъекционного раствора амфотерицина В.

Несмотря на уменьшение концентрации в плазме, уровни в печени и селезенке продолжают увеличиваться. Были сообщения о таких наблюдениях для липосом, а это позволяет предположить, что липосомальные лекарственные средства в ретикулоэндотелиальных тканях не находятся в свободном равновесии с плазмой, как нелипосомальные лекарственные средства (Feilding, RM, et al, 1998). Это, возможно, объясняет высокую степень удерживания амфотерицина В в ретикулоэндотелиальных тканях в случае эмульсии по сравнению с обычным инъекционным раствором амфотерицина В.

Х-В) ИССЛЕДОВАНИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВТОРНОЙ ДОЗЫ В ОРГАНАХ У МЫШЕЙ

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБ

Тест-система: Для исследования использовали женские особи мышей Swiss albino массой 20-22 г, полученные из питомника от Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL). Животных обеспечивали стандартным кормом и водой Aquaguard , по желанию.

Тест-материал: Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно процессу и прописи примера I, вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Сравнительный материал: Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл) вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Планирование исследования: Животных разделяли на две группы по 24 животных в каждой группе, на группы 1 и 2. Группа 1 получала дозу 1 мг/кг обычного инъекционного раствора амфотерицина В, а группа 2 получала дозу 5 мг/кг эмульсии амфотерицина В. (табл.18) 12 животным вводили дозы в течение 7 дней и другим 12 животным - в течение 14 дней. Печень, легкие, почки и селезенку иссекали через 6 час после последней дозы. Органы сразу замораживали, чтобы прекратить какие-либо ферментативные реакции. Органы взвешивали и добавляли трехкратный объем воды относительно массы органов. Затем гомогенизировали.

Способ введения: внутривенно

ТАБЛИЦА 18 Дозы обычного инъекционного раствора амфотерицина В и исследуемой эмульсии амфотерицина В для исследования распределения однократной дозы в органах у мышей
№ группы	Группа	Доза (мг/кг массы тела)
1.	Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (5 мг/мл)	1
2.	Эмульсия амфотерицина В (5 мг/мл)	5

Анализ содержания амфотерицина В

Содержание амфотерицина В в плазме анализировали способом ВЭЖХ (HPLC) с использованием колонки С-18. Амфотерицин В выделяли из плазмы с использованием метнола HPLC чистоты при соотношении плазмы и метанола 1:3. Образцы центрифугировали при 3000 об/мин и супернатант инжектировали в колонку.

Статистический анализ:

Полученные данные анализировали для сравнения обработанных групп испытанием по t-тесту Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ТАБЛИЦА 19 приведены параметры распределения в органах для двух составов
Орган	Концентрация в органах (мкг/г)
	Обычный инъекционный раствор амфотерицина В (1 мг/кг)		Эмульсия (5 мг/кг)
	7 дней	14 дней	7 дней	14 дней
Печень	15,22±4,34	15,33±3,45	65,34±16,14	63,45±9,86
Селезенка	4,79±1,04	5,05±0,51	109,08±15,5	75,4±11,32
Почки	2,21±0,27	2,53±0,39	2,71±0,5	1,97±0,65
Легкое	3,66±0,75	3,03±0,65	18,12±6,96	11,32±3,08

Представляет интерес наблюдение, что концентрация в тканях незначительно увеличивается от 7-й дозы до 14-й дозы (см. фиг.11а и 11b), и это согласуется с приведенными в литературе данными (Olsen SJ. et al, 1991). В противоположность этому не наблюдается случаев смерти в обработанной эмульсией амфотерицина В группе несмотря на повышенные уровни амфотерицина В в тканях. Обычный инъекционный раствор амфотерицина В показывал случаи смерти в период исследования.

Как можно увидеть, уровни амфотерицина В в почках одинаковы для обычного инъекционного раствора амфотерицина В и эмульсии несмотря на большую наблюдаемую разницу в нефротоксичности (см.табл.19). Возможная причина этого может заключаться в том, что амфотерицин В определяли в органах независимо от того, присутствует ли он как комплекс с липидами или как свободное лекарственное средство. В случае обычного инъекционного раствора амфотерицина В амфотерицин В присутствует преимущественно в свободной форме и, следовательно, нефротоксичен. Но в случае эмульсии на основе липида амфотерицин В, возможно, существует как комплекс с липидами, который не проявляет токсичности в тканях.

Амфотерицин В, будучи амфифильным лекарственным средством, существует как растворимый мономер или как самоассоциированные олигомеры, и при концентрации выше критической он образует мицеллы. Любые факторы, модифицирующие равновесие между различными видами амфотерицина В в водной среде, могут изменять его общую активность и токсичность. Tabosa Do Egito (1996) рассматривает эмульсию амфотерицина В, действующую как резервуар мономерной формы амфотерицина В. Этот высокостабильный состав легко высвобождает только ограниченные количества мономера свободного амфотерицина В. Эта форма, вероятно, может связываться только с эргостеролом грибковых клеток и проявлять пониженное взаимодействие с холестерином клеток млекопитающего (Tabosa Egito, et al., 1996). Следовательно, эмульсия хотя и показывает уровни, аналогичные обычному инъекционному раствору амфотерицина В, не столь сильно токсична.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эмульсию амфотерицина В приготовляли с целью:

1. Улучшить профиль безопасности

2. Обеспечить рентабельную стоимость

Исследования токсичности показали, что безопасная граница эмульсии в действительности превышает таковую у обычного инъекционного раствора амфотерицина В. Это можно объяснить формой, в которой эмульсия сама по себе присутствует в грибковых клетках-мишенях. Обычный инъекционный раствор амфотерицина В высвобождает амфотерицин В в очень больших количествах и высвобождающиеся мономеры ассоциируются, образуя олигомеры, которые связываются с клетками млекопитающего, также приводя к тяжелой токсичности. Эмульсия, напротив, не способна достичь таких высоких концентраций в плазме вследствие быстрого фагоцитоза ретикулоэндотелиальной системой (RES) и показывает медленное постепенное высвобождение мономеров. Это объясняет селективное действие эмульсии на грибковые клетки и, следовательно, низкую токсичность (Tabosa Do Egito, ES, et al., 1996). Низкие уровни в плазме и быстрое распределение эмульсии амфотерицина В в органах также составляет преимущество над обычным инъекционным раствором амфотерицина В с точки зрения возможного достижения требуемой цели. Кроме того, эмульсия амфотерицина В является рентабельным по стоимости продуктом по сравнению с другими составами на основе липидов, типа препаратов липидного комплекса и липосомных.

Таким образом, эмульсия амфотерицина В настоящего изобретения представляет собой многообещающий состав для целевого лечения грибковых инфекций.

Пример XI

Эмульсию амфотерицина В, приготовленную в примере IV, примере V и примере VI, исследовали in-vivo на токсичность у мышей.

Исследование токсичности однократной дозы у мышей

Тест-система: Для исследования использовали женские особи мышей Swiss albino массой 20-22 г, полученные из питомника Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL). Животных обеспечивали стандартным кормом и водой Aquaguard , по желанию.

Тест-материал: Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную в примере IV, примере V и примере VI, вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Сравнительный материал: Эмульсию амфотерицина В (5 мг/мл), полученную согласно способу и прописи примера I, вводили внутривенно как инъекцию ударной дозы.

Все группы получали инъекции внутривенно. Всех животных наблюдали на признаки клинической токсичности и смертности в течение 72 часов. Процент смертности рассчитывали для всех доз.

Наблюдения:

Группы, которые получали пробы из примера IV, примера V и примера VI, обнаружили симптомы кардиальной токсичности, такие как тяжелый респираторный дистресс-синдром, локальное поражение, абдоминальный дистресс и возбуждение. Однако эти токсические симптомы не наблюдались в группе, которая получала пробы, приготовленные согласно способу и прописи примера I.

Преимущества изобретения:

Приготовление амфотерицина В как структурированной эмульсии типа масло в воде для парентерального введения по способу настоящего изобретения значительно снижает его токсичность и обеспечивает стерильность без изменения его противогрибковой активности.

Амфотерицин В, введенный в масляную фазу эмульсии, полученной по способу настоящего изобретения, сохраняет стабильность в течение всего процесса приготовления, в том числе при стерилизации в автоклаве и после этого в процессе срока хранения или использования.

Средний размер масляной капли в парентеральном составе структурированной типа масло в воде эмульсии покрытого маслом амфотерицина В, приготовленном по способу настоящего изобретения, регулируют в оптимальной степени, так что состав преимущественно распределяется в ретикулоэндотелиальной системе, создавая низкую концентрацию в плазме.