способ молекулярного маркирования пола хмеля обыкновенного (humulus lupulus l)

Формула изобретения

Способ молекулярного маркирования пола хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L), включающий проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), отличающийся тем, что используют комбинацию олигонуклеотидных праймеров 5' GGG ACT CGG TAA CAC AGA AAG GCA и 5'-AGC CCC ACC TAC ACC ACG ACA ACC, которая обеспечивает синтез специфичного для мужских растений хмеля фрагмента ДНК размером 542 пн, и комбинацию олигонуклеотидных праймеров 5'CAG TGT TTC TCT CGG GTT CTC TTG и 5' AAC CAC ACA TAA TTC CCA TCT TGC, которая обеспечивает синтез специфичного для мужских растений хмеля фрагмента ДНК размером 387 пн.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в селекции хмеля для определения пола растений хмеля на стадии проростков. Хмель обыкновенный, Humulus lupulus L. (Cannabiaceae) - многолетняя двудомная лиана. Шишки хмеля (соплодия), образующиеся на женских растениях, являются важнейшим сырьем для пивоварения, применяется в медицине, парфюмерной и хлебопекарной промышленности. В производственных целях возделывают женские растения хмеля, которые размножают вегетативно. Мужские растения используют только в селекции для проведения гибридизации.

Известные способы определения пола растений хмеля:

1. По морфологии мужских и женских цветков.

При высоком уровне питания и выращивании в теплице сеянцы зацветают в первый год жизни (Либацкий Е.П. Хмелеводство. - М.: Колос, 1993. -287с.). Однако для экономии материальных ресурсов и затрат труда желательно, чтобы пол сеянцев был определен на ранних этапах их развития, и для дальнейшего выращивания и оценки были отобраны только женские растения.

2. С помощью молекулярных маркеров (Polley A., Seigner E., Ganal M.W. Identification of sex in hop (Humulus lupulus) using molecular markers. Genome, 1997, v.40, p.p.357-351). Маркер, полученный этими исследователями, разработан на основе RAPD - анализа. Он был опробован на небольшом количестве образцов хмеля немецкого происхождения. По сведениям CERENAK, Andreja, JAVORNIK, Branka (Application of male STS marker in hop (Humulus lupulus L.) breeding. Proceedings of the Scientific Commission, Pulawy, Poland, 27-30 July 1999. [S.1.]: International Hop Growers' Convention, 1999, p.39-42), данный маркер не пригоден для ряда сортов.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению относится способ, предложенный в вышеуказанной статье Polley A., Seigner E., Ganal M.W. Identification of sex in hop (Humulus lupulus) using molecular markers. Genome, 1997, v.40, p.p.357-351. Пол растений предлагается определятся с помощью молекулярных маркеров, разработанных на основе сиквенса специфичных для мужских растений хмеля продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) со случайными праймерами (RAPD).

Предлагаемая авторами пара олигонуклеотидных праймеров

5'- ACAGAGTACAACTCAGAAACAAACC-3'

5'-AAGGTCGCACAATGACCG-3'

обеспечивает амплификацию в процессе ПЦР специфичного для мужских растений фрагмента ДНК, который выявляется с помощью электрофореза в агарозном геле. В указанной статье авторы приводят следующие методики:

Выделение ДНК:

1. 9 г свежих листьев хмеля замораживали в жидком азоте и измельчали до порошкообразного состояния.

2. Добавляли к измельченным листьям 19 мл экстрагирующего буфера (Буфер содержит 100 мМ ацетата натрия, 50 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 2% поливинил пиролидона, 1,4% SDS, 60 мМ цистеина, рН 5,5).

3. Смесь инкубировали 30 мин при 65°С.

4. Дважды проводили очистку смесью хлороформ / изоамиловый спирт (24:1).

5. Преципитация ДНК этанолом.

6. Осажденную ДНК растворяли в буфере, содержащем 10 мМ Tris и 1 мМ ЭДТА рН 8.

Условия проведения ПЦР с STS праймерами:

Начальная денатурация: 3 мин, 94°С.

35-45 циклов:

1 мин 94°С,

1 мин 65°С,

2 мин 72°С.

Конечный синтез: 7 мин, 72°С.

Предлагаемый нами способ определения пола у растений хмеля также основан на применении молекулярного маркирования. Маркер разработан на основе ISSR-ПЦР анализа (Inter simple sequence repeats или межмикросателлитный анализ) при исследовании молекулярно-генетического полиморфизма сортов и мужских образцов хмеля. Праймеры были получены после выделения и секвенирования (определения нуклеотидной последовательности) специфичных для мужских растений продуктов ПНР, полученных с двумя микросателлитными праймерами. На фиг.1 стрелкой указан специфичный для мужских растений фрагмент ДНК размером около 700 пн (1,2 - фореграммы мужских растений, 4,5 - женских растений хмеля), полученный с микросателлитным праймером [AC]₈ YG. На фиг.2 стрелкой указан специфичный для мужских растений фрагмент ДНК размером около 500 пн (обозначения те же, что на фиг.1), полученный с микросателлитным праймером [CA]₈ GT.

Предлагаемые нами молекулярные маркеры (две комбинации олигонуклеотидных праймеров) пригодны для определения пола у широкого спектра сортообразцов хмеля. Они были опробованы на 33 мужских линиях и 53 сортобразцах (женских растениях) хмеля. Были испытаны образцы местных популяций, сорта хмеля различного эколого-географического происхождения, в том числе российские, некоторые европейские и американские сорта (см. прилагаемую таблицу). Во всех случаях пол растений был определен правильно.

Заявляемое решение направлено на решение задачи - повышение эффективности селекции хмеля за счет сокращения затрат труда, средств, площадей (в теплицах или в поле) и времени, требуемых на возделывание мужских гибридных растений хмеля до начала цветения, когда появляется возможность их отобрать. Хмель является двудомным растением. В результате гибридизации селекционер получает, как правило, 50% мужских и 50% женских растений. Селекционную ценность представляют женские растения хмеля. Если селекционное учреждение имеет возможность возделывать гибридные растения в теплице, то они зацветают через год, если гибридные сеянцы высаживают в поле, то большинство растений зацветает на второй год. Таким образом, в течение одного года в теплице или двух лет в поле приходится выращивать около 50% балластных растений. Молекулярное маркирование позволяет определить пол растения хмеля на стадии сеянцев. Для этого требуется растительный материал (молодой лист сеянца хмеля), сухая масса которого не превышает 25 мг.

Для решения указанной задачи предлагаются две комбинации олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих амплификацию специфичных для мужских растений фрагментов ДНК:

11 OF 5' GGG ACT CGG TAA CAC AGA AAG GCA

110R 5' AGC CCC ACC TAC ACC ACG АСА АСС

(амплификация фрагмента ДНК длиной 542 пар нуклеотидов)

422F 5' CAG TGT TTC TCT CGG GTT CTC TTG

422R 5' ААС CAC АСА TAA TTC CCA TCT TGC

(амплификация фрагмента ДНК длиной 387 пар нуклеотидов)

Для предлагаемых комбинаций праймеров: 110F, R и 422F,R были подобраны условия проведения ПЦР, обеспечивающие хорошо воспроизводимую амплификацию специфичного фрагмента у мужских растений хмеля, проявляющегося при форезе в виде яркой полосы. На фиг.3 стрелками указаны специфичные для мужских растений (обозначены цифрами 1, 2, 3) фрагменты ДНК размером около 542пн и 387пн, полученные с комбинациями праймеров 110F,R и 422F,R соответственно. У женских растений (обозначены цифрами 4, 5, 6) указанные фрагменты ДНК не амплифицируются.

Для определения пола растений необходимо:

1) выделить ДНК,

2) провести ПЦР,

3) провести форез в агарозном геле.

Выделение ДНК (метод SDS).

1. Смешать измельченный образец (10-20 мг высушенных лиофилизацией листьев хмеля) с 600 мкл SDS-буфера (100 мМ Трис-PH, рН 8, 50 мМ Na₂EDTA, 500 мМ NaCI, 1,25% SDS, 2% поливинил пиролидона, непосредственно перед использованием добавить в буфер 40-50 мг Na₂S₂O₅ на каждые 10 мл). Пробирки инкубировать 45 мин в водяной бане при 60°С, переворачивая каждые 15 мин.

2. Добавить 1 объем смеси хлороформ / изоамиловый спирт (24:1), перемешивать 10-15 мин, затем центрифугировать 10 мин при 10000 об/мин.

3. К надосадочной жидкости, перенесенной в новую пробирку, добавить 0,7 объема изопропанола, центрифугировать 10 мин при 10000 об/мин.

4. ДНК промыть в течение 30 мин в 500 мкл 76% этанола с 0,2М NaAc, затем 5 мин - в 100 мкл 70% этанола. Высушенную ДНК растворить в H₂O mQ.

Условия проведения ПЦР

Полимеразная цепная реакция проводилась в амплификаторе Терцик МС2 (АО ДНК-технология, Москва). Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл включает: Taq-буфер (Силекс М) (70 мМ Трис-HCl, рН 8,6 (25°С), 0,001% Тритон X 100, 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 2,5 мМ MgCl₂ ),

0,25 мМ каждого dNTP (Силекс М),

0,5 мкМ каждого праймера (ЗАО Синтол),

100-150 нг ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы (Силекс М),

2% Formamide (Serva).

В пробирки поверх раствора добавить 25 мкл минерального масла.

Циклы ПЦР:
начальная денатурация: 94°С	5 мин
30 циклов:
94°С	1 мин
110F, R-58° 422F,R-60°C	1,5 мин
72°С	45 сек
конечный синтез: 72°С	7 мин

Для фореза можно использовать 1.5% агарозный гель и 0,5х Трис-борат буфер (0,089М Трис, 0,089М борная кислота, 0,002М ЭДТА).

Таким образом, способ молекулярного маркирования позволяет определять пол гибридных растений хмеля на стадии сеянцев, что повышает эффективность селекции за счет сокращения затрат труда, средств, площадей (в теплицах или в поле) и времени (1-2 года), требуемых на возделывание мужских гибридных растений хмеля до начала цветения, когда появляется возможность их отбраковки.

Таблица 1 Перечень и происхождение сортов и линий хмеля, использованных для тестирования молекулярных маркеров пола.
№п/п		№ДНК		Название образца		Место оригинального происхождения		Родословная
1		21		Аполлон		Югославия		Brewer's Gold (Англия) × 3/3 (югославский дикорастущий)
2		22		Коно		Бельгия		Возможно, происходит от Brewer's Gold
3		26		Полюншер		Австрия		-
4		27		Порфир 16		Украина		-
5		114		Клон 18		Украина, УИСХ		Индивидуальный отбор из сортосмеси Житомирской области чешского происхождения
6		112		Орловский		Россия		-
7		30		Нордгаард 978		Дания		-
8		127		Крылатский (1992)		Россия, Моск. обл., РНИСХ		Гибрид 38-4 от свободного опыления сорта Мурановский (Россия, РНИХС)
9		25		Лейт Кластер		США		Гибрид от свободного опыления европейского English cluster с дикорастущим американским хмелем
10		28		Сполэчны		Украина		-
11		120		Э 88/20		Россия, Чувашия		Образец из местной популяции
12		124		Цивильский 1996		Россия, Чувашия, НИПТИХ		Надеждинский (гибридный сорт получен в РНИСХ) × 14-13 (происходит из гибридной комбинации Серебрянка × Смолистый (свободное опыление))
13		121		Сумерь 1993		Россия, Моск. обл., РНИСХ		Гибрид 38-11 от свободного опыления гибрида 14-38(Россия, РНИХС), происхождение которого не указывается
14		23		К 692266		Япония		-
15		128		ЧА89/19		Алтай		Образец из местной популяции
16		29		Заклад		Украина		-
17		122		Подвязный(1990)		Россия, Моск. обл., РНИСХ		Гибрид 14-17 от свободного опыления бельгийского сорта Юроп
18		111		Ранний 1972		Россия, Моск. обл., РНИСХ		Индивидуальный отбор из сортосмеси Кировской области
19		115		Чувашский местный		Россия, Чувашия		Образец из местной популяции
20		113		Литовский местный		Литва		-
21		116		Гуслицкий		Россия		Местный стародавний сорт Московской области
22		118		Жатецкий поздний		Чехословакия		-
23		123		Э 88/12		Россия, Чувашия		Образец из местной популяции
24		125		Михайловский 2000		Россия, Чувашия, НИПТИХ		Истринский 16 (МОВИР) × 24-10 (Ранний × свободное опыление)
25		126		Дружный 1996		Россия, Чувашия, НИПТИХ		Смолистый × 14-13 ((Серебрянка × Смолистый) × свободное опыление)
26		119		Свалеф		Швеция		-
27		109		Смолистый 1985		РНИХС		Гибрид 11-36 Шпальтский (Германия) × 58-32 (Уштецкий (Чехия) × 20-4 × 7-33 (происхождение не уточняется)
28		110		Истринский 15 1980		МОВИР		Заацер (Чехия) × (Клон 18 × дикорастущий из Тибета)
29		20		Ахилл		Словения		Brewer's Gold × 3/3
30		133		Northern Brewer		Германия		Canterbury Golding × OB21 (от Brewer's Gold)
31		134		Oswald clone 114		Германия		-
32		135		Original Saazer		Чехия		Местный сорт
33		136		US Hallertauer		США		-
34		137		Fuggle		Англия		Местный сорт
35		138		Spalter		Германия		Местный сорт
36		139		Hallertauer mittelfrueh		Германия		Местный сорт
37		140		Hersbrucker		Германия		Местный сорт
38		141		Perle		Германия		Northern Brewer × 63/5/27M (Hallertauer Mfr, Spalter, Saazer)
39		142		Oswald clone		Германия		-
40		143		Spalter В 1914		Германия		-
41		144		US Tettnanger 1		США		-
42		145		Saazer		Чехия		Местный сорт
43		147		Tettnanger		Германия		Местный сорт
44		149		Liberty		США		Hallertauer Mfr.(2n=4x=40) × 64035M(67% Hallertauer Mfr, 17% German hop, 16%. неизвестно)
45		150		Taurus		Германия		82/39/37 × 85/54/15М
46		151		Hersbruecker spat		Германия		Местный сорт
47		152		Brewer's Gold		Англия		ВВ1 (дикорастущий хмель из Манитобы, Канада) × свободное опыление
48		154		Magnum		Германия		Galena × 75/5/3 немецкого происхождения
49		155		Wye Challenger		Англия		17/54/2 × 1/61/57М
50		156		Density		Англия		Keyworth's Midseason (происходит от Y90 - дикорастущий из Нью Мексико) × мужское растение английского происхождения
51		157		Olympic		США		(Brewer's Gold2 × Fuggle-Fuggle S) × (Brewer's Gold2 × East Kent Golding - Bavarian Seedling)
52		158		Cascade		США		[(Fuggle × (Серебрянка × Fuggle)] × свободное опыление
53		159		Galena		США		Brewer's Gold × свободное опыление
«-» родословная неизвестна
Мужские растения
№п/п	№ДНК		Название образна		Место оригинального происхождения		Родословная
							Материнская форма-сорт		Отцовская форма и ее происхождение
1	31		2-6		НИПТИХ		Истринский 15		ПМФ23 (Истринский 15 × от комбинации сорта Смолистый)
2	32		3-9		НИПТИХ		Аниевский (местный сорт)		ПМФ64 (Кругляк Серяк × от Смолистый)
3	33		9-3		НИПТИХ		Сумерь		ПМФ24 (Истринский 15 × от Серебрянка)
4	34		1-4		НИПТИХ		Гибрид 5642 (Украина)		ПМФ24 (Ф-102 (Литва) × от Серебрянка)
5	35		5-5		НИПТИХ		Роудницкий(Чехия)		ПМФ23 (Истринский 15 × от Смолистый)
6	36		5-24		НИПТИХ		-"-		-"-
7	37		3-1		НИПТИХ		Подвязный		ПМФ2 (Гуслицкий × от Урожайный)
8	38		2-7		НИПТИХ		Югославский красностебельный		ПМФ37 (Серебрянка Калистовская × от Смолистый)
9	39		2-20 (?2-26)		НИПТИХ		-"-		-"-
10	40		6-7		НИПТИХ		Густяк (старинный местный сорт)		ПМФ58 (Смолистый × от Смолистый)
11	41		7-1		НИПТИХ		Сумерь		ПМФ68 (Фредос, Бельгия × от Урожайный)
12	42		7-2		НИПТИХ		-"-		-"-
13	43		8-5		НИПТИХ		Подвязный		ПМФ57 (Смолистый × от Урожайный)
14	44		8-7		НИПТИХ		-"-		-"-
15	45		8-9		НИПТИХ		-"-		-"-
16	46		8-10		НИПТИХ		-"-		-"-
17	47		9-13		НИПТИХ		Лейт Кластер (США)		Свободное опыление
18	48		11-11		НИПТИХ		Сумерь		-"-
19	49		11-17		НИПТИХ		-"-		-"-
20	50		12-2		НИПТИХ		Истринский 15		-"-
21	58		13-9		НИПТИХ		-"-		-"-
22	59		13-11		НИПТИХ		-"-		-"-
23	60		14-9		НИПТИХ		Чувашский местный		-"-
24	61		15-1		НИПТИХ		Смолистый		-"-
25	64		17-5		НИПТИХ		Дружный		-"-
26	68		17-18		НИПТИХ		-"-		-"-
27	76		1-34		НИПТИХ		Югославский красностебельный		-"-
28	77		1-35		НИПТИХ		-"-		-"-
29	78		1-36		НИПТИХ		-"-		-"-
30	79		2-7		НИПТИХ		Подвязный		-"-
31	80		8-19		НИПТИХ		-"-		-"-
32			WH		Университет Хоенхайм, Штуттгарт		Дикорастущий из Германии
33			Воронеж 12		Воронежская область		Дикорастущий из Воронежской области