биотрансплантат, способ его получения и способ лечения хронического гепатита и цирроза печени (варианты)

Формула изобретения

1. Биотрансплантат для лечения хронического гепатита и цирроза печени, характеризующийся тем, что он содержит культуру фетальных гепатоцитов человека из печени эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности, селективно размноженных в условиях культивирования и представляет собой суспензию клеточной культуры в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн клеток на 1 кг веса пациента.

2. Биотрансплантат по п.1, содержащий свежеприготовленную культуру.

3. Способ получения биотрансплантата для лечения хронического гепатита и цирроза печени, характеризующийся тем, что ткань печени эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности измельчают, дезагрегируют, полученную суспензию первичных диссоциированных клеток культивируют в ростовой среде RPMI+F12 (1:1), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (1 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл трансферрина, селенит), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением дексаметазона 0,00125 мл/мл и глутамина 0,11 мг/мл, до достижения клеточной культурой конфлюэнтного состояния.

4. Способ по п.3, где для дезагрегации измельченную ткань печени инкубируют в ферментном растворе, содержащем 0,25%-ный раствор диспазы и 0,05%-ный раствор коллагеназы в соотношении 1:1 в течение 30-40 мин, с последующим измельчением ткани путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии, далее последнюю трижды отмывают центрифугированием при 700 об/мин.

5. Биотрасплантат для лечения хронического гепатита и цирроза печени, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала путем дезагрегации ткани с последующим культивированием на ростовой среде, содержащей трансферрин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления гомогенной клеточной культуры с содержанием агрекан- и коллаген II экспрессирующих клеток не менее 80%, и представляет собой суспензию указанных клеток в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн клеток на 1 кг веса пациента.

6. Биотрансплантат по п.5, в котором в качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировую ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

7. Биотрансплантат по п.5, в котором в качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировую ткань.

8. Биотрансплантат по п.5, в котором в качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировую ткань.

9. Способ получения биотрансплантата для лечения хронического гепатита и цирроза печени, характеризующийся тем, что мехенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн мононуклеарных клеток на 1 см² и инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂, по достижении культурой 50%-ной конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см² на ростовую среду, содержащую 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы.

10. Способ лечения хронического гепатита и цирроза печени, характеризующийся тем, что используют биотрансплантат по п.1 и/или 5, при этом суспензию мезенхимальных стволовых или фетальных гепатоцитов или их комбинацию вводят в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн клеток на 1 кг веса пациента.

11. Способ лечения по п.10, где мезенхимальные стволовые клетки и фетальные гепатоциты берут в соотношениях от 1:1 до 1:15.

12. Способ лечения по п.10, где указанные биотрансплантаты вводят с помощью венозного катетера или пункционно в вены портальной системы; с помощью артериального катетера в селезеночную артерию; пункционно в паренхиму селезенки; интраперитониально; пункционно в большой сальник.

13. Способ лечения по п.10, который может быть использован при лечении хронического гепатита и цирроза печени, развившихся вследствие воздействия гепатотропных вирусов, а именно вируса гепатита В, С, D, G, F, TTV, CMV, EBV; токсического фактора, такого, как алкоголь, лекарства, промышленные вещества, метаболических нарушений вследствие гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность ₁-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии; аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и биотехнологии и касается получения культур генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток, гепатоцитов и способа лечения хронических гепатитов и циррозов печени.

Рост заболеваемости при различных патологиях печени и тяжелые последствия в виде циррозов, хронических гепатитов, печеночной недостаточности и др. обуславливает актуальность поиска новых более эффективных способов лечения. Только в нашей стране количество больных с печеночно-клеточной недостаточностью достигает 200000 человек в год, при этом использование стандартных терапевтических приемов не позволяет достичь удовлетворительных результатов и смертность сохраняется на уровне 80-90%.

В структуре заболеваний печени среди хронических гепатитов и циррозов можно выделить заболевания, развившиеся вследствие воздействия гепатотропных вирусов, токсического фактора (алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.), метаболических нарушений (гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность ₁-антитрипсина; гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии), аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит) и многих других факторов.

В настоящее время, в связи с развитием клеточной биологии в медицине изучаются альтернативные пересадке печени, экстракорпоральной детоксикации методы клеточной заместительной терапии, направленные на стимуляцию процессов регенерации и нормализации функции печени [Н. Mali, S. Gupta, 2001].

Как метод трансплантация клеток печени имеет ряд преимуществ. Клеточная трансплантация, в отличие от сложной хирургической операции пересадки печени, технически проще выполнима, не требует массивной иммуносупрессивной терапии, в связи с чем вероятность развития осложнений минимальна. Кроме того, выделение и культивирование клеток печени из одного донорского органа позволяет обеспечить лечение нескольких пациентов.

По мнению некоторых авторов истинными региональными стволовыми клетками печени являются так называемые овальные клетки, располагающиеся в пространствах Диссе, которые могут дифференцироваться в клетки печени различного фенотипа. Однако до настоящего момента эти клетки не были выделены и охарактеризованы в культуре. В ряде работ последних лет было показано, что для заместительной клеточной терапии могут быть использованы гепатоциты, клетки дуктулярного эпителия, мезенхимальные стволовые клетки стромы печени, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (гемопоэтические и мезенхимальные) [Xin Wang, Eugenio Montini, Mushen Al-Dhalimy et al. 2002]. Получены достоверные данные о возможности дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток из разных источников в гепатоциты и дуктулярный эпителий, как in vivo, так и in vitro.

При трансплантации клетки по портальной системе проникают в синусоиды, где происходит экстравазация их в паренхиму печени. Клеточные биологи последние годы дискутируют на тему - способны ли стволовые клетки (в частности, костного мозга) непосредственно дифференцироваться в другой тип клеток, или это происходит только путем клеточного слияния. Существует мнение, что гепатоциты, происходящие из костного мозга, образуются путем клеточного слияния, а не прямой дифференцировки. Последние работы свидетельствуют о возможностях прямой дифференцировки стволовых клеток костного мозга в клетки других типов [Martin Korbling, Ruth L. Katz, Abha Khana et al. 2001]. Причем в ряде исследований ученые специально акцентируют внимание на отсутствие слияния стволовых клеток при их дифференцировке in vivo или in vitro. Таким образом, стволовые клетки способны образовывать новый тип клеток путем прямой дифференцировки и клеточного слияния. Интеграция трансплантируемых клеток в паренхиме печени приводит к физиологической регуляции экспрессии генов донорских и клеток реципиента. Донорские клетки активно пролиферируют и синтезируют различные факторы роста, гормоны, цитокины, стимулирующие регенерацию клеток печени хозяина, участвуют в морфогенезе печеночных долек, биллиарных протоков, синусоидов.

В экспериментальных работах по трансплантации клеток при наследственных [Moscioni AD, Rozga J, Chen S et al. 1996] и моделированных [Vogels BA, Maas MA, Bosma A et al. 1996] заболеваниях печени у животных получены достоверные данные о выживаемости, пролиферации, дифференцировки донорских клеток in situ и стимуляции регенерации поврежденной ткани печени.

Mito et al. впервые в 1992 г. осуществил пересадку гепатоцитов группе пациентов с хроническими заболеваниями печени (10 пациентов с циррозом печени и хроническим гепатитом). В дальнейшем накоплен значительный опыт трансплантации клеток печени при метаболических заболеваниях, вирусных острых и хронических гепатитах, токсических поражениях печени (Strom SC et al. 1999., Bilir BM et al. 1997). Описаны случаи эффективной трансплантации гепатоцитов человека группе пациентов с фульминантной печеночной недостаточностью (Habibullah CM et al. 1994). Проводились клинические исследования с использованием как ауто-, так и аллогенных клеток печени. Трансплантация генетически модифицированных гепатоцитов при наследственных заболеваниях печени является эффективным способом коррекции метаболических нарушений (Grossman M et. al 1995). По результатам этих работ получена достоверная положительная динамика клинико-лабораторных показателей цитолиза, холестаза и синтетической функции печени. В 1998 году Fox IJ et al. описали случай трансплантации гепатоцитов пациентке с синдромом Клиглера - Найяра I типа, после трансплантации наблюдалось длительное снижение уровня билирубина.

Клеточная трансплантация обладает рядом важных преимуществ по сравнению с пересадкой целого органа (печени):

заместительная клеточная терапия позволяет культуральными методами избавиться от примеси сверхантигенных донорских клеток, которые в первую очередь вовлекаются в процесс иммунного отторжения;

подсадку клеток можно регулировать по дозам и многократно повторять;

стоимость клеточной трансплантации значительно ниже, чем пересадки органа.

Большинство исследователей предпочитают аутогенные клетки (костный мозг, клетки периферической крови). Преимущества аутотрансплантатов не вызывают сомнений, однако имеется ряд ограничений по их применению. В частности, длительность выращивания клеточных культур - более 2 месяцев - может являться критической для ряда пациентов;

клетки, полученные от пожилых и тяжелобольных людей обладают низкой способностью к пролиферации и самообновлению.

В сравнении с аутологичным клеточным трансплантационным материалом донорские (в том числе фетальные) клетки обладают рядом преимуществ:

фетальные клетки имеют больший потенциал роста и пролиферации, выраженную способность к дифференцировке и функционально более активны, продуцируют факторы роста и регенерации;

пересаженные фетальные клетки стимулируют ангиогенез;

фетальные клетки и ткани лучше переносят гипоксию и холодовую консервацию;

культуры донорских клеток могут быть приготовлены заранее и использоваться по первому требованию.

Наиболее выраженным терапевтическим потенциалом при патологиях печени обладают генетически немодифицированные гепатоциты и мезенхимальные стволовые клетки.

Мезенхимальные стволовые клетки, в основном, получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых являются стволовыми. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются.

При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.

Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.

В настоящее время существуют несколько способов трансплантации клеток печени: введение в вены портальной системы, в паренхиму селезенки [Rosental RJ, Chen SC, Hewitt W et al. 1996], интраперитонеально. Преимущества методов введения определяются простотой выполнения и обеспечением выживаемости трансплантируемых клеток.

Задачей настоящего изобретения является получение биотрансплантата для наиболее эффективного (комплексного) воздействия на пораженную печень человека и разработка наиболее эффективного способа введения при хронических гепатитах и циррозах.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.

Предложен биотрансплантат для лечения хронического гепатита и цирроза печени, который содержит культуру фетальных гепатоцитов человека из печени эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности, селективно размноженных в условиях культивирования, и представляет собой суспензию клеточной культуры в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента. Биотрансплантат содержит свежеприготовленную культуру. Предложен способ получения биотрансплантата для лечения хронического гепатита и цирроза печени, заключающийся в том, что ткань печени эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности измельчают, дезагрегируют, полученную суспензию первичных диссоциированных клеток культивируют в ростовой среде RPMI+F12 (1:1), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (1 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл трансферрина, селенит), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением дексаметазона 0.00125 мл/мл и глутамина 0.11 мг/мл, до достижения клеточной культуры конфлюэнтного состояния.

Для дезагрегации измельченную ткань печени инкубируют в ферментном растворе, содержащем 0.25% раствор диспазы и 0.05% раствор коллагеназы в соотношении 1:1 в течение 30-40 минут с последующим измельчением ткани путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии, далее последнюю трижды отмывают центрифугированием при 700 об/мин.

Предложен также биотрансплантат для лечения хронического гепатита и цирроза печени, заключающийся в том, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала путем дезагрегации ткани с последующим культивированием на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления гомогенной клеточной культуры с содержанием агрекан- и коллаген П экспрессирующих клеток не менее 80%, и представляет собой суспензию указанных клеток в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента.

В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.

В качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировая ткань.

Предложен способ получения биотрансплантата для лечения хронического гепатита и цирроза печени, заключающийся в том, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн. мононуклеарных клеток на 1 см² и инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂, по достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см² на ростовую среду, содержащую 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы.

Предложен способ лечения хронического гепатита и цирроза печени, заключающийся в том, что используют ранее указанные биотрансплантаты, при этом суспензию мезенхимальных стволовых или фетальных гепатоцитов или их комбинацию вводят в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента.

Мезенхимальные стволовые клетки и фетальные гепатоциты берут в соотношениях от 1:1 до 1:15.

Указанные биотрансплантаты вводят: с помощью венозного катетера или пункционно в вены портальной системы; с помощью артериального катетера в селезеночную артерию; пункционно в паренхиму селезенки; интраперитониально; пункционно в большой сальник.

Способ может быть использован при лечении хронического гепатита и цирроза печени, развившихся вследствие воздействия гепатотропных вирусов, а именно вирус гепатита В, С, D, G, F, TTV, CMV, EBV; токсического фактора, такого как алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.; метаболических нарушений вследствие гемохроматоза, болезни Вильсона-Коновалова, недостаточности ₁-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземии, наследственного тирозиноза, наследственных гипербилирубинемий; аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит).

Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей, например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1500×g, 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см² в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО ₂. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см² в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см² и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.

Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного биоматериала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов.

Система последовательной ферментативной дезагрегации исходной ткани позволяет получать максимальное количество жизнеспособных клеток одинакового фенотипа с незначительной примесью гетеротопных клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют максимально наращивать количество, аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получать гомогенную клеточную культуру с содержанием аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток не менее 80%.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.

В качестве биотрансплантата используют свежеполученную клеточную культуру или после ее криоконсервации. В качестве криопротектора используют 7% диметилсульфоксид.

Для приготовления биотрансплантата, содержащего культуру фетальных гепатоцитов, используют фетальный абортивный материал (ткань печени эмбрионов человека 1-2 триместра беременности), полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций женщин. Фетальный материал переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и гентамицина (80 мг/л). Дальнейшая работа производится в стерильных условиях ламинарного бокса. Выделенная с помощью хирургических инструментов ткань печени тщательно отмывается от сгустков крови, максимально отделяется соединительнотканная капсула и ее перемычки. Полученную ткань печени измельчают до кусочков не менее 1 мм. куб. Затем подвергают ферментативной и механической дезагрегации - освобождение клеточных элементов от тканевого матрикса.

Способ дезагрегации заключается в использовании 0,25% раствора диспазы, 0,05% раствора коллагеназы, в одномоментном инкубировании кусочков ткани печени в течение 30-40 мин в двухкомпонентном (1:1) ферментном растворе с последующим измельчением путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии. Полученная суспензия трижды отмывается путем центрифугирования при 700 оборотов в минуту. Суспензию первичных диссоциированных клеток печени, полученных из фетальной ткани печени, культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри в среде, содержащей ростовую среду RPMI+F12 (1:1), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НПП ПанЭко), 1% ИТС (1 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл трансферрина, селенит), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением дексаметазона 0.00125 мл/мл и глутамина 0.11 мг/мл, через 24-48 часов неприкрепленные клетки смывают с культуральных чашек и продолжают культивировать. Замену среды производят каждые 3 дня. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния следует криоконсервация. Пассирование не проводят вследствие изменения фенотипа получаемых клеток.

Способ лечения хронических гепатитов и циррозов печени заключается в том, что ранее указанные биотрансплантаты вводят:

с помощью венозного катетера или пункционно в вены портальной системы;

с помощью артериального катетера в селезеночную артерию;

пункционно в паренхиму селезенки;

интраперитониально;

пункционно в большой сальник.

Биотрансплантаты вводят соответственно в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента.

Мезенхимальные стволовые клетки и фетальные гепатоциты берут в соотношениях от 1:1 до 1:15.

Эффективность предложенного способа подтверждается уменьшением проявлений синдромов цитолиза, холестаза, портальной гипертензии, достоверным улучшением функции печени по биохимическим показателям.

Данный способ лечения эффективен при хронических гепатитах и циррозах печени, развившихся вследствие воздействия гепатотропных вирусов (вирусы гепатита В, С, D, G, F, TTV, CMV, EBV), токсического фактора (алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.), метаболических нарушений (гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность ₁-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии), аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит) и многих других факторов.