способ количественного определения фенозан-кислоты в биологических объектах

Формула изобретения

Способ количественного определения фенозан-кислоты, 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенилпропионовой кислоты в биологических жидкостях, характеризующийся тем, что анализируемую пробу биожидкости после подкисления до рН=1 обрабатывают органическим экстрагентом для извлечения фенозан-кислоты, после чего переводят ее в метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии - способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах.

Фенозан-кислота (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенилпропионовая кислота) является синтетическим антиоксидантом и изучается в качестве потенциального лекарственного препарата [Трещенкова Ю.А., Голощапов А.Н., Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты: Тез. докл. V Межд. конф. - М., 1998, С.182-183].

Известен способ количественного определения соединений, относящихся к пространственно-затрудненным фенолам, хемилюминесцентным методом путем регистрации изменения интенсивности хемилюминесценции модельной цепной реакции инициированного окисления углеводородов после введения в систему антиоксиданта [Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Хемилюминесцентный метод изучения природных антиоксидантов в липидах. // Биофизика. - 1971 - №1.- С.39-43].

Однако данный способ не может быть использован для определения фенозан-кислоты в биологических объектах, поскольку невозможно с необходимой достоверностью предварительно определить общее базисное содержание эндогенных антиоксидантов у каждого животного.

Задачей изобретения является обеспечение возможности количественного определения фенозан-кислоты в сложном многокомпонентном биологическом материале.

Это достигается за счет того, что анализируемую пробу биожидкости после подкисления до рН=1 обрабатывают органическим экстрагентом для извлечения фенозан-кислоты, после чего переводят ее в метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику.

Подкисление анализируемой пробы биожидкости до рН=1 необходимо для того, чтобы полностью подавить ионизацию фенозан-кислоты и тем самым обеспечить полный переход ее в органическую фазу в процессе экстракции. Перевод фенозан-кислоты в ее метиловый эфир осуществляется для того, чтобы повысить летучесть определяемого вещества. Предлагаемый температурный режим газожидкостного хроматографирования аналита необходим потому, что именно в этих условиях происходит удовлетворительное разделение пиков фенозан-кислоты, внутреннего стандарта и эндогенных соединений.

Способ осуществляют следующим образом.

К сухому остатку после эфирной экстракции биожидкости добавляют раствор диазометана. После завершения дериватизации эфир удаляют и к сухому остатку прибавляют хроматографически чистый внутренний стандарт, представляющий собой раствор додекана, например, в метаноле с концентрацией 15 нг/мкл. Пробу полученного раствора сразу же вводят в хромато-масс-спектрометр (например, газовый хроматограф HP 5980 серия II, масс-селективный детектор HP 5971 А и станция обработки данных HP 59970 С).

Пробу анализируют при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику.

Пример. Количественное определение фенозан-кислоты в плазме крови кроликов (модельные растворы). Раствор "стандартной плазмы" готовят из лиофилизированной сухой плазмы добавлением соответствующего количества дистиллированной воды, перемешивания, настаивания, фильтрации. Основной стандартный раствор фенозан-кислоты концентрации 1 мг/мл готовят растворением точно взвешенного количества воздушно-сухого вещества в метаноле. Растворы-метчики получают разведением основного раствора: концентрация метчика от 10 до 1000 мкг/мл в соответствии с данными табл.1. 100 мкл каждого метчика добавляют к 1 мл плазмы для приготовления калибровочных растворов фенозан-кислоты с содержанием от 1 до 100 мкг/мл (С_плазмы). Для каждого значения концентрации готовят три раствора. "Нулевой" раствор содержит 100 мкл чистого метанола в плазме. После введения метчика растворы в плазме выдерживают не менее 1 ч при 20°С для установления равновесия.

Фенозан-кислоту из калибровочных растворов и из биожидкостей выделяют экстракцией эфиром после подкисления растворов до рН=1, эфирные экстракты упаривают в токе воздуха при 40°С. К сухим экстрактам добавляют по 1 мл эфирного раствора диазометана, смеси оставляют на 12 ч. После завершения дериватизации эфир удаляют в токе воздуха, к высушенному остатку приливают от 50 до 200 мкл раствора внутреннего стандарта, а затем 0,6-1,0 мкл полученного раствора сразу же вводят в хроматограф (С_гх).

Воспроизводимость хромато-масс-спектрометрического определения оценивали по стандартному раствору С_гх , содержащему 12,5 нг/мкл метилового эфира фенозан-кислоты (концентрация хроматографируемого раствора С_гх) и 10 нг/мкл внутреннего стандарта, при числе повторностей, равном 7: ; S=1,52; S_r=0,09; =1,4; доверительный интервал 16,5±1,4; W=9,2%.

Воспроизводимость методики оценивали по стандартному раствору 4 мкг/мл фенозан-кислоты в плазме (С_пл) при числе повторностей, равном 7: ; S=1,85; S_r=0,19; =1,7; доверительный интервал 9,8±1,7; W=17%. Здесь W - коэффициент вариации, S - среднее квадратичное отклонение, , , где t - коэффициент Стьюдента при n=7, =0,95.

В табл.2 приведены результаты калибровки. Объединенное уравнение регрессии для интервала концентраций 0,5-100 мкг/мл имеет вид: С_пл=0,245Q+1,515 мкг/мл, коэффициент линейной регрессии r=0,998. Для интервала концентраций 0,5-0,01 мкг/мл: С_пл=0,097Q-0,0051 мкг/мл, коэффициент линейной регрессии r=0,989.

Для оценки методики в целом независимо приготовленный раствор - стандартный образец фенозан-кислоты в плазме концентрации 4 мкг/мл - был проанализирован среди серии калибровочных растворов. В табл.3 приведены значения определенных по калибровочному графику и рассчитанных концентраций фенозан-кислоты, .

Стандартная статистическая обработка полученных результатов показала их достоверность и высокую воспроизводимость для =0,95, максимальное единичное отклонение средней величины от истинной концентрации составляет 18%, отклонение, рассчитанное для средней величины С, составляет 2%.

Из табл.3 видно, что предлагаемый способ количественного определения фенозан-кислоты в биологических объектах методом хромато-масс-спектрометрии обладает высокой чувствительностью и воспроизводимостью, он позволяет надежно и достоверно определять в биологическом материале количественное содержание фенозан-кислоты в различные интервалы времени после его введения.

Разработанный способ может быть использован для количественного определения фенозан-кислоты в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата.

Таблица 1
Приготовление калибровочных растворов фенозан-кислоты в плазме крови.
					А	В		С
№	Cисх мг/мл	Vисх мл	V общ мл (МеОН)	Cметчика мкг/мл	Cплазмы мкг/мл	Cгх , нг/мкл		m (метиловый эфир фенозан-кислоты) нг
						200 мкл	25 мкл	200 мкл	25 мкл
1	1	-	-	1000	100	500		300
2	1	3,5	5	700	70	350		210
3	1	2,5	5	500	50	250		150
4	1	1,0	5	200	20	100		60
5	1	0,5	5	100	10	50		30
6	1	0,25	5	50	5	25		15
7	1	0,10	5	20	2	10		6
8	0,1 мкг/мл	0,5	5	10	1	5		3
9	0,1 мкг/мл	0,25	5	5	0,5	2,5	20	1,5	12
10	0,01 мкг/мл	0,5	5	1,0	0,1	0,5	4	0,3	2,4
11	0,01 мкг/мл	0,25	5	0,5	0,05	0,25	2	0,15	1,2
12	0,001 мкг/мл	0,5	5	0,1	0,01	0,05	0,4	0,03	0,24
А - из расчета объем метчика 100 мкл, объем плазмы 1 мл.
В - из расчета объем реконструирующего раствора 200 мкл и 25 мкл.
С - из расчета объема пробы, вводимой в хроматограф, равной 0,6 мкл.

Таблица 2
Результаты анализа калибровочных растворов фенозан-кислоты в плазме крови.
№		Спл, мкг/мл		Cгх мкг/мл			Q1		Q 2		О3
1		100		500			338		340		351
2		70		350			238		242		242,7
3		50		250			170,7		168,3		190
4		20		100			58,5		51,8		56,4
5		10		50			31,12		39,3		31,6
6		5		25			12,4		10,02		13,6
7		2		10			4,44		4,52		2,66
Таблица 3
Оценка точности методики анализа фенозан-кислоты в плазме крови.
№	Q							S				С
1	13,157		4,74			0,83				0,74		18,5
2	8,93		3,70			0,21				0,30		7,5
3	9,57		3,86			0,05				0,14		3,5
4	9,80		3,92		3,91	0,01		0,455		0,08		2,0
5	7,44		3,34			0,57				0,66		16,5
6	8,56		3,61			0,30				0,39		9,75
7	11,01		4,21			0,30				0,21		5,25