способ получения ликопина, фосфолипидов, жирных кислот и эргостерина путем совместного культивирования (+) и (-) штаммов гриба blakeslea trispora

Формула изобретения

Способ получения биологически активных соединений липидной природы, а именно ликопина, фосфолипидов, жирных кислот и эргостерина, путем совместного культивирования двух штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, микроэлементы, с последующим последовательным выделением из биомассы гриба ликопина, фосфолипидов, жирных кислот и эргостерина путем экстракции и кристаллизации, отличающийся тем, что в качестве продуцента биологически активных соединений используют пару штаммов гриба Blakeslea trispora Б-1(-) и Б-2(+), а процессы экстракции ликопина, фосфолипидов, жирных кислот, эргостерина и кристаллизации ликопина ведут в среде одного и того же гидрофобного органического растворителя.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства витаминов и антиоксидантов, в частности производства ликопина, эргостерина, фосфолипидов, жирных кислот.

В настоящее время установлено, что биологически активные соединения, такие как ликопин, эргостерин, фосфолипиды, жирные кислоты и др., успешно используются для лечения и профилактики различных заболеваний.

Ликопин относится к классу природных соединений - каротиноидам. Это пигмент, который придает здоровую красную окраску фруктам и овощам, таким как помидоры, арбузы, розовые грейпфруты, облепиха и др. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что ликопин наряду с красящей функцией имеет самостоятельное значение как биологически активная добавка. Ликопин оказывает общеукрепляющее действие на организм и обладает большим набором ценных фармакологических свойств. Подавляя в организме свободнорадикальное окисление, ликопин стабилизирует иммунный статус организма, улучшает протекание ряда важнейших биологических процессов в организме, в том числе нормализует уровень глюкозы в крови, липидный обмен, зрение и контролирует пролиферацию (новообразование) клеток. Была установлена высокая эффективность использования ликопина при лечении заболеваний предстательной железы, легких, желудка, катаракты, ишемической болезни сердца, атеросклероза [1-3]. Биологическая активность ликопина связана, прежде всего, с его антиоксидантными свойствами, т.е. способностью ингибировать свободнорадикальные процессы в клетках. При этом было показано, что ликопин обладает более выраженной способностью устранять вредное воздействие синглетного кислорода по сравнению с -каротином [4].

Эргостерин - предшественник витамина Д₂ , который получается при облучении эргостерина ультрафиолетовыми лучами. Д₂ играет важную роль в обеспечении организма кальцием, прежде всего за счет правильного использования кальция, поступающего с пищей. При недостатке витамина Д₂ в организме происходит нарушение минерализации в процессе костеобразования, что приводит к серьезным изменениям в костном скелете.

Любые заболевания печени независимо от этиологии (действие алкоголя, лекарственных препаратов, промышленных и бытовых токсинов, неправильного питания, вирусных инфекций и т.д.) вызывают повреждение мембран клеток с потерей фосфолипидов, которые являются основными структурными компонентами мембран. Потеря собственных фосфолипидов приводит сначала к инактивации, а затем и к гибели клеток печени. Фосфатидилхолин (лецитин), входящий в состав фосфолипидов, является основным структурным компонентом всех клеточных мембран. При пероральном введении в организм фосфатидилхолин восстанавливает целостность мембран клеток, в первую очередь печени. Фосфатидилхолины используют во многих отраслях промышленности благодаря их прекрасным диспергирующим и эмульгирующим свойствам.

Жирные кислоты имеют широкий спектр применения в парфюмерии, фармакологии, медицине. Наиболее ценными являются полиненасыщенные жирные кислоты. Они должны поступать в организм человека с пищей. При их недостаточности наблюдается отставание в росте, развиваются характерные поражения со стороны кожи и волосяного покрова.

Известны многочисленные способы получения отдельных биологически активных соединений, в частности ликопина, эргостерина, фосфолипидов, жирных кислот с использованием различных микроорганизмов - продуцентов.

Известен способ получения эргостерина из дрожжей (Авт. свид. СССР №465812) [5]. Описан штамм микроскопического гриба Hypomyces rosellus, который используется для получения липидов с высокой степенью ненасыщенности жирных кислот (патент РФ №2020155) [6]. Известен штамм Streptomyces chrostomyceticus, который на минеральной среде накапливает 20-50 мг/кг ликопина (патент Италии №343773) [7]. Описан штамм бактерий Mycobacterium rubrum, который на среде с мелассой и кукурузным экстрактом накапливает до 7,05 мг/г суммарных каротиноидов. При этом в пигментном комплексе бактерий помимо ликопина обнаружены , и -каротин, ауроксантин, лютеин, криптоксантин, виолоксантин, зеаксантин, антераксантин, рубиксантин, лепротеин, неоксантин (А.с. СССР №1071636) [8].

Наиболее активными продуцентами ликопина являются грибы Phycomyces blakesleanus и Blakeslea trispora. У гриба Phycomyces blakesleanus в зависимости от особенностей штамма и условий культивирования уровень накапливания ликопина колеблется в интервале 192-600 мкг/г АСВ [9].

Известны способы получения ликопина из биомассы гриба Blakeslea trispora [10-12]. В соответствии с описанными способами выход кристаллического ликопина составляет 31-56% от количества его в биомассе.

Согласно изобретению, описанному в патенте РФ №2102416, выращивают штаммы гриба Blakeslea trispora А-732-3 (+) и А-731-3 (-) или 8А (+) и 8А (-) на кукурузно-соевой среде с добавлением в качестве стимуляторов ликопинообразования соединений класса аминометилпиридинов или табачной крошки. Выращивание (+) и (-) штаммов ведут в течение 48 часов, полученный посевной материал используют в соотношении 1:9 для последующей ферментации. Получение целевого продукта осуществляют экстракцией подсолнечным маслом, кристаллизацией с использованием этанола и толуола и последующей колоночной хроматографией в системе н-гексан - ацетон 50:1.

В соответствии с описанным способом выход ликопина составляет 0,7 г/л среды. Соотношение ликопина и -каротина составляет 11:1 или 92% и 8% соответственно. К сожалению, в патенте не указан уровень накопления биомассы гриба в единице объема питательной среды, что не дает возможность оценить ликопинсинтезирующую активность культуры - продуцента. Кроме того, для накопления ликопина культурой гриба Blakeslea trispora указанными штаммами в среду добавляют стимуляторы: аминометилпиридин или табачную крошку. При этом табачная крошка является более слабым стимулятором в сравнении с аминометилпиридином, так при ее добавлении в среду культивирования уровень накопления ликопина грибом Blakeslea trispora составляет 0,4 г/л, что в 1,7 раза ниже по сравнению с аминометилпиридином. Добавление в среду культивирования производных пиридина несмотря на их низкие концентрации (0,01-0,005%) нежелательно.

Во всех вышеперечисленных способах получения биологически активных соединений используется, как правило, один конкретный штамм микроорганизма - продуцента того или иного вида соединения.

Наиболее близкими к заявленному изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ликопина, описанный в Евразийском патенте №002468 [13] и способ получения антиоксидантов и биологически активных соединений липидной природы, описанный в Евразийском патенте №003212 [14]. Согласно изобретению [13] ликопин получают при совместном выращивании штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) ВСБ-130(+). Выращивание ведут по 2-стадийной схеме культивирования на минеральной среде с глюкозой или кукурузно-соевой среде.

На минеральной среде с глюкозой на 1-ой стадии выращивают (-) штамм гриба в течение 20 часов, затем на 2-ой стадии в среду культивирования добавляют 3% глюкозы и (+) штамм гриба. Совместное выращивание (+) и (-) штаммов ведут в течение 36 часов. При этом в биомассе накапливается до 35 мг ликопина в пересчете на 1 г абсолютно сухого веса (АСВ) биомассы.

На кукурузно-соевой среде на 1-ой стадии выращивают (-) штамм в течение 32 часов, далее, на 2-ой стадии в среду культивирования вносят (+) штамм гриба. Совместное выращивание ведут в течение 48 часов. При этом в биомассе накапливается до 30 мг ликопина в расчете на 1 г абсолютно сухого веса (АСВ) биомассы.

Экстракцию из биомассы гриба проводят смесью растворителей этанол : гексан в соотношении 4:1 в 3 ступени при температуре 60°С в течение 30 минут на каждую ступень. Соотношение биомассы и растворителя 1:5. Кристаллизацию ликопина ведут в этиловом спирте при температуре 5°С в течение 20 часов. При этом выход ликопина составляет 55% от содержания его в биомассе. Доля основного вещества - 90%.

Согласно изобретению [14] биологически активные соединения липидной природы из биомассы гриба Blakeslea trispora получают экстракцией полярным растворителем (например, ацетоном или этанолом) или смесью полярного и неполярного растворителей (например, ацетон : гексан или этанол : гексан) при температуре 40-70°С в три ступени при соотношении биомасса : экстрагент, равном 1:3,5 на первой ступени, до 1:1,5 на последней. Отделяют полученный экстракт от биошрота путем его горячей фильтрации при 50-60°С. После чего экстракт ставят на кристаллизацию каротиноидов в смеси полярного и неполярного растворителей при 5-20°С в течение 3-24 часов при слабом перемешивании. Выпавшие кристаллы каротиноидов отделяют фильтрованием и промывают этанолом. После отделения кристаллов каротиноидов из раствора липидов выделяют фосфолипиды при температуре 5-20°С в течение 1-5 часов при слабом перемешивании. Кристаллизацию фосфолипидов проводят в ацетоне или смеси ацетона и неполярного растворителя (например, гексана). Полученные фосфолипиды направляются на дальнейшее фракционное разделение в растворе этанола с целью выделения фракции лецитина. Полученный раствор нейтральных липидов омыляют в среде ацетона в водном растворе гидроксида калия при 50-70°С в течение 20-60 минут. Затем омыленную фракцию разбавляют водой и гидролизуют серной кислотой для получения смеси жирных кислот. Неомыленную фракцию упаривают, перерастворяют в гексане и кристаллизуют эргостерин при 0-20°С в течение 4 часов при соотношении гексан : неомыляемая фракция, равном 1:3-1:50, а затем отфильтровывают полученный в процессе кристаллизации эргостерин. Эргостерин на фильтре промывают органическим растворителем или проводят, при необходимости, повторную кристаллизацию. Далее эргостерин счищают с фильтра и высушивают при 60°С.

Задачей данного изобретения является получение новых высокоэффективных штаммов - продуцентов биологически активных соединений, в частности ликопина, эргостерина, фосфолипидов, жирных кислот, разработка более эффективного способа их получения, расширение числа продуцентов, упрощение и удешевление процесса экстракции.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в результате многоступенчатой селекции и отбора получена пара гриба Blakeslea trispora Б-1(-) и Б-2(+), которая при совместном глубинном культивировании на минеральной среде с глюкозой через 26 часов культивирования накапливает до 40 мг/г АСВ ликопина, на среде с гидролом и кукурузным экстрактом (отходами крахмалопаточного производства) через 30 часов от начала культивирования - до 50 мг/г АСВ ликопина. Содержание ликопина составляет 92-96% от суммы каротиноидов.

Штаммы гриба Б-1(-) и Б-2(+) получены из штаммов гриба Blakeslea trispora ВКПМ F - 414 (-) и ВКПМ F - 414 (+) в результате многоступенчатой селекции с последовательным применением ультрафиолетовых лучей, N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина и дифениламина в качестве мутагенных факторов и рассевом на чашки Петри с питательной средой сусло-агар (7°Б). Через 18-24 часа выращивания изолированные колонии отсевали в пробирки на скошенный сусло-агар. Отбор колонии производили после 8-10 дневного выращивания их в пробирках при 26°С по признаку наибольшего пигментообразования с последующим определением продуктивности выделенных вариантов. Штаммы Б-1 и Б-2 имеют следующие морфологические характеристики:

Сусло-агар. Штамм Б-2(+) форма. Рост штамма интенсивный. Воздушный мицелий развит слабо. Субстратный мицелий хорошо развит, плотный, желтовато-бежевого цвета. Спорообразование слабое.

Штамм Б-1(-) форма. Рост менее активный по сравнению со штаммом Б-2. Воздушный мицелий отсутствует. Спорообразования на данной среде не обнаруживается. Субстратный мицелий штамма красновато-оранжевого цвета.

При совместном росте на среде сусло-агар в месте соприкосновения (+) и (-) штаммов не образуется характерной полосы черных зигоспор. После соприкосновения с (+) штаммом вся поверхность мицелия (-) штамма окрашивается в бордово-красный цвет.

Штаммы хранятся в коллекции компании ООО «Биосинтез-Мт», авторами штаммов является коллектив авторов Авчиева П.Б., Буторова И.А. и др.

Для получения биомассы с наивысшим содержанием жирорастворимых биологически активных соединений - ликопина, фосфолипидов, жирных кислот и эргостерина процесс культивирования штаммов Blakeslea trispora Б-1(-) и Б-2(+) проводят на специально подобранных питательных средах и режимах выращивания. Питательная среда должна содержать в своем составе легкодоступные источники углерода и азота, а также микроэлементы.

Подготовку посевного материала осуществляют путем раздельного выращивания Б-1(-) и Б-2(+) форм на косяках с сусло-агаром в течение 10 суток при температуре 26-28°С. Далее штаммы раздельно засевают в качалочные колбы со стерильными средами, содержащими в своем составе кукурузную и соевую муку в количестве 1-10% каждого компонента, КН₂ PO₄ от 0,01 до 1,00%, тиаминхлорида - 2×10 ^-5-2×10^-4%, оптимальным значением рН для роста культур является рН 6,0-8,0. На данной среде (-) штамм гриба Blakeslea trispora Б-1 выращивают в течение 60-92 часов при температуре 26-28°С, при оборотах качалки 150-250 об/мин. (+) Штамм гриба выращивают при тех же условиях, но в течение 36-72 часов. Полученная в результате раздельного культивирования биомасса используется в дальнейшем для совместной ферментации Б-2(+) и Б-1(-) штаммов граба Blakeslea trispora. Совместную ферментацию проводят в стерильных условиях на минеральной среде, содержащей легко доступные источники углерода и азота, а также микроэлементы, или на средах, содержащих отходы крахмалопаточного производства (гидрола и кукурузного экстракта), при тех же значениях рН, температуры и оборотах качалки, причем сначала в среду культивирования вносят (-) штамм гриба и только после 12-36 часов от начала культивирования вносят (+) штамм в количестве 0,1-20% (объем.) от первоначально внесенного объема (-) штамма. Совместное культивирование (+) и (-) форм ведут в течение 24-72 часов.

Способы получения биомассы гриба Blakeslea trispora, содержащей в своем составе ликопин, фосфолипиды, жирные кислоты и эргостерин, иллюстрируются в примерах 1 и 2.

Для получения биологически активных соединений (ликопина, эргостерина, фосфолипидов, жирных кислот) биомассу совместно выращенных (+) и (-) штаммов отделяют от культуральной жидкости и высушивают. Экстракцию липидов из биомассы (влажностью 10-15%) проводят любым гидрофобным растворителем при температуре 40-65°С в несколько ступеней при соотношении биомасса : экстрагент от 1:1 до 1:20 (мас.). Наиболее подходящими экстрагентами являются: нефрас, гексан, четыреххлористый углерод, хлороформ. Полученный экстракт отделяют от биошрота путем его горячей фильтрации при 50-60°С.

Кристаллизацию ликопина ведут при 5-20°С в течение 3-24 часов при слабом перемешивании в среде того же органического растворителя, что и процесс экстракции. Данное техническое решение позволяет использовать на первых двух стадиях технологического процесса один и тот же органический растворитель, что приводит к упрощению аппаратурного оформления и снижению затрат на производство целевых продуктов. Выпавшие кристаллы ликопина отделяют фильтрованием. Выход кристаллического ликопина с чистотой 92-96% в результате проведения предлагаемого процесса составляет 70-72% от содержания этого каротиноида в биомассе. После отделения кристаллов ликопина последовательно осуществляют следующие стадии:

- выделение и очистка фосфолипидов;

- выделение и очистка жирных кислот;

- выделение и очистка эргостерина.

Выделение и очистку указанных выше веществ осуществляют методами, предложенными нами ранее [15, 16], которые проиллюстрированы примерами 3 и 4.

Пример 1.

Подготовка посевного материала:

Штаммы гриба Blakeslea trispora Б-1 и Б-2 выращивают на косяках сусло-агар в течение 10 суток. Далее штаммы засевают в качалочные колбы на кукурузно-соевой среде следующего состава:

Соевая мука	- 4,5%
Кукурузная мука	- 2,3%
КН2PO 4	- 0,05%
Тиаминхлорид	- 2×10-4 %
рН среды	- 6,8

Выращивание (-) штамма ведут при 26-27°С на качалке при 200 об/мин в течение 72 часов, (+) штамм выращивают в течение 48 часов. Выросшую культуру гриба Б-1(-) использовали как засевной материал для основной ферментации.

Ферментацию ведут на минеральной среде с глюкозой следующего состава:

Глюкоза	- 20 г/л
(NH4) 2SO4	- 9,0 г/л
NaH2PO 4	- 5,8 г/л
К2HPO4	- 2,5 г/л
MgSO4	- 0,34 г/л
Пептон	- 20 г/л
Тиаминхлорид	- 2×10-4%
рН среды	- 6,8

На минеральной среде (-) штамм гриба Blakeslea trispora Б-1 выращивают 18 часов при 27-28°С. Затем в среду культивирования добавляют предварительно выращенный на кукурузно-соевой среде в течение 48 часов (+) штамм гриба в количестве 1% от объема среды и далее ведут совместное выращивание штаммов в течение 28 часов. Через 26 часов от начала совместного выращивания в биомассе накапливается 40 мг ликопина в расчете на 1 грамм абсолютно сухой биомассы.

Пример 2.

То же, что и в примере 1, но для основной ферментации используют среду на основе отходов крахмалопаточного производства (гидрола и кукурузного экстракта) следующего состава:

гидрол	- 6,5 г/л
кукурузный экстракт	- 81 г/л
(NH4 )2SO4	- 4,1 г/л
K2 HPO4	- 1,28 г/л
рН среды	- 6,8

На данной среде (-) штамм гриба Blakeslea trispora Б-1 выращивают 20 часов при 27-28°С. Затем в среду культивирования добавляют предварительно выращенный на кукурузно-соевой среде в течение 48 часов (+) штамм гриба в количестве 1% от объема среды и далее ведут совместное выращивание штаммов в течение 30 часов. Через 30 часов от начала совместного выращивания в биомассе накапливается 50 мг ликопина в расчете на 1 грамм абсолютно сухой биомассы.

Пример 3.

Биомассу гриба Blakeslea trispora в количестве 110 г (влажность 10,0%) экстрагируют в три ступени гексаном (соотношение биомасса : экстрагент - 1:6) при 60,0°С. Затем полученные экстракты объединяют. В результате получают 29,7 грамм липидов, имеющих представленный фракционный состав (см. табл.1).

Таблица 1. Фракционный состав липидов гриба Blakeslea trispora (экстрагент гексан).*
Компоненты	Содержание в % от суммы липидов
Фосфолипиды	28,8
Моноглицериды	4,0
Диглицериды	4,0
Эргостерин	4,7
Свободные жирные кислоты	23,2
Триглицериды	18,4
Ликопин	11,7
Углеводороды	5,2
*состав представлен на липиды, очищенные от органического растворителя.

Раствор липидов в гексане охлаждают до +5°С и выдерживают в течение 3 часов при слабом перемешивании, выпавшие кристаллы ликопина отфильтровывают. Полученный ликопин в количестве 2,9 г промывают этиловым спиртом, в результате получают кристаллы с содержанием основного вещества не менее 92-96%. После отделения ликопина из раствора липидов выделяют фосфолипиды при -5°С, для чего к раствору липидов приливают трехкратный объем ацетона. Кристаллизуют фосфолипиды в течение 2,5 часов. В результате процесса получают 6,1 г фосфолипидов. Раствор липидов в ацетоне упаривают, а затем перерастворяют в этаноле и омыляют в 25% водном растворе гидроксида калия при 50°C в течение 20 минут. Омыленную фракцию разбавляют 200 мл воды и гидролизуют H₂SO ₄. Полученные жирные кислоты экстрагируют гексаном, в результате получают 4,8 грамм смеси жирных кислот. Неомыленную фракцию экстрагируют гексаном в три ступени по 150 мл на каждой, экстракты объединяют, частично упаривают и кристаллизуют эргостерин при 0°С и соотношении гексан : липиды, равном 1:3. Выпавший в осадок эргостерин фильтруют, промывают и сушат при 60°С, в результате получают 0,9 г эргостерина. Содержание основного вещества в образце эргостерина составляет 85,0%.

Пример 4.

То же, что и в примере 3, но экстракцию биомассы проводят в среде нефраса (t кип. = 70-80°С) при соотношении биомасса : экстрагент, равном 1:3, при температуре 65°С, в четыре ступени, длительностью 40 минут каждая. При охлаждении объединенных экстрактов на фильтре собирают осадок, содержащий комплексную фракцию фосфолипидов и ликопина в количестве 11,8 г. Полученный осадок является конечным продуктом технологии, поскольку значительное содержание фосфолипидов защищает ликопин от окисления, т.е. увеличивает его срок хранения.

Список литературы.

1. Minthy L., Steven J. Shwartz // Lycopene: Chemical and Biological Properties. Foodtechnology, 1999, vol.53, №2, p.33-43.

2. Патент ЕП 00544.

3. American Journal of Epidemiology 1999; 149: 168-176.

4. MacioP.D., Devasagayam T.P.A., Kaiser S., Sies H. // Biochem. Soc. Transactions. - 1990 - v.18. N6. - p.1055-1056.

5. A.с. СССР №465812.

6. Патент РФ №2020155.

7. Патент Италии №343773.

8. А.с. СССР №1071636.

9. B.J.Mehta. E.Cerda-Olmedo // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1995. - № 42. - p.836-838.

10. Патент РФ 2112747.

11. Патент РФ №2126806.

12. Патент РФ №2102416.

13. Прототип Евразийский патент №002468.

14. Прототип Евразийский патент №003212.

15. Деев С.В., Буторова И.А., Авчиева П.Б. // Биотехнология. - 2000 - №5 - с.36-40.

16. Деев С.В., Буторова И.А., Авчиева П.Б. // Биотехнология. - 2001 - №4 - С.22-31.