способ получения экстракта автолизированных дрожжей

Формула изобретения

1. Способ получения экстракта автолизированных дрожжей, включающий автолиз дрожжевой суспензии в присутствии олеиновой кислоты при рН 6,0-7,5, прогревание ее при 90-95°С, отделение жидкой фазы, ее упаривание, осветление и высушивание готового продукта, отличающийся тем, что после прогревания суспензии автолизированных дрожжей ее подвергают высушиванию, а затем готовят водную суспензию автолизата в соотношении сухой автолизат: вода 1:(6-10) с добавлением 0,1-1,0% NaCl, или уксусной кислоты до достижения рН 4,0-4,5, или NaOH до достижения рН 8,0-8,5 и осуществляют ферментативный гидролиз с помощью протеазы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что протеазу используют из расчета 4-8 ед. протеолитической активности на 1 г а.с.в.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области микробиологии и пищевой промышленности и может быть использовано для получения компонентов микробиологических питательных сред, в т.ч. диагностических, а также продуктов питания.

Известен способ получения функционального белкового гидролизата для использования в продуктах питания, заключающийся в том, что исходный микробный белок экстрагируют спиртово-аммиачной смесью для удаления липидов и нуклеиновых кислот, белковую массу разбавляют до содержания сухих веществ 10-20%, доводят рН до 7-8 и добавляют при 30-50°С одну часть протеазы на 500-1000 частей субстрата. Протеолиз ведут 15-240 мин, затем раствор нагревают до 80-90°С и выдерживают 5 мин для инактивации протеазы. Сепарацией отделяют высокомолекулярные частицы, имеющие свойства первоначального гидролизата, а осветленный гидролизат фракционируют, например ультрафильтрацией, на пермеат, содержащий водорастворимые низкомолекулярные пептиды (М.м. 100-5000 Да), и концентрат, обладающий повышенной вязкостью, для использования в качестве эмульгатора (1).

Недостатком способа является использование жестких условий обработки (спиртово-аммиачной смесью), в результате чего происходит частичная денатурация белка, затрудняющая его дальнейшее расщепление в нужных участках молекул белка.

Ближайшим аналогом является способ получения осветленного экстракта автолизированных дрожжей, заключающийся в том, что водную суспензию дрожжей с содержанием 6-18% а.с.в. подвергают автолизу в присутствии олеиновой кислоты в течение 4-12 ч при рН 6,0-7,5. После достижения содержания аминного азота 1,5-3,5 мг/мл добавляют протеолитический фермент из расчета 4-8 ед. активности на 1 г а.с.в. После прогревания автолизированной суспензии при 90-95°С отделяют водный раствор экстракта центрифугированием или сепарацией, концентрируют его упариванием до содержания сухих веществ 8-20%, осветляют прогреванием при 90-100°С, дополнительно очищают фильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,1-0,4 мкм и при необходимости высушивают (2).

Однако, используя данный способ, можно извлечь из клеток не более 25% сухих веществ от общей массы сухих дрожжей, что приводит к незначительному увеличению аминного азота в готовом продукте. Это объясняется наличием в клеточных стенках нативных дрожжей молекул полисахаридов, несущих заряженные группы, что приводит к селективной сорбции и агрегации свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов, образовавшихся в процессе автолиза, на клеточных оболочках. В результате существенно снижается растворимость и экстрагируемость этих продуктов при сепарации, центрифугировании или фильтрации. Получают продукт более низкого качества, чем необходимо для использования в жидких диагностических питательных средах.

Следует отметить, что аминный азот в данном способе определялся с ТНБС, что давало в 1,5-2,5 раза завышенные результаты по сравнению с общепринятым способом определения аминного азота формольным титрованием.

Технический результат от осуществления предлагаемого способа выражается в том, что в 1,2-1,5 раза повышается общий выход дрожжевого экстракта из автолизированной биомассы за счет аминокислот и низкомолекулярных пептидов с содержанием аминного азота, оптимальным для использования в диагностических питательных средах.

Этот результат достигается тем, что предлагается способ получения экстракта автолизированных дрожжей, включающий автолиз дрожжевой суспензии в присутствии олеиновой кислоты при рН 6,0-7,5, прогревание ее при 90-95°С, отделение жидкой фазы, ее упаривание, осветление и высушивание готового продукта, отличающийся тем, что после прогревания суспензии автолизированных дрожжей ее подвергают высушиванию, а затем готовят водную суспензию автолизата в соотношении сухой автолизат: вода 1:(6-10) с добавлением 0,1-1,0% NaCl, или уксусной кислоты до достижения рН 4,0-4,5, или NaOH до достижения рН 8,0-8,5 и осуществляют ферментативный гидролиз с помощью протеазы.

Обычно протеазу используют из расчета 4-8 ед. протеолитической активности на 1 г а.с.в.

Для повышения степени экстракции в суспензию дрожжевого автолизата рекомендуется в качестве экстрагента использовать воду, или 0,1-1,0% раствор хлорида натрия, или раствор уксусной кислоты с рН 4,0-4,5, или раствор гидроокиси натрия с рН 8,0-8,5 при соотношении автолизат: экстрагент 1:6-1:10.

Для увеличения количества свободных аминокислот в конечном продукте суспензию сухого дрожжевого автолизата подвергают протеолизу. Фермент вносят из расчета 4-8 ед. протеолитической активности на 1 г а.с.в. Эту стадию обычно проводят в течение 2-3 ч при 30-50°С.

Практически способ осуществляют следующим образом. Дрожжевую суспензию подвергают автолизу в присутствии олеиновой кислоты в течение 6-8 ч, при рН 6,0-7,5, температуре 45-55°С и перемешивании, подвергают плазмолизу и высушивают. Затем из сухого автолизата готовят 6-18% водную суспензию, которую подвергают прогреванию при 30-120°С в течение 0,5-4 ч при перемешивании и отделяют экстракт, который концентрируют упариванием до содержания сухих веществ 8-20% и при необходимости высушивают.

Для удаления опалесценции в водных растворах экстракт после концентрирования осветляют прогреванием с последующим отделением выпавшего осадка любым способом.

После осветления экстракт для дополнительной очистки и снижения обсемененности может быть подвергнут фильтрации на мембранах с размером пор 0,1-0,4 мкм или порогом задержания 5 кДа.

Для осуществления способа могут быть использованы хлебопекарные, пивные, винные, кормовые дрожжи родов Saccharomyces, Candida, Rhodotorula, получаемые в промышленных условиях.

В качестве ферментов, обладающих протеолитической активностью, могут быть использованы такие ферменты, как протосубтилин, пепсин, трипсин, лизоцим, папаин и др.

Экстракт автолизированных дрожжей может быть получен и использован как в сухом, так и в жидком виде.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (по прототипу). Из 4 кг прессованных хлебопекарных дрожжей готовят суспензию с содержанием а.с.в. 14%, которую подвергают автолизу в течение 8 ч в присутствии олеиновой кислоты, при температуре 54°С, рН 7,0 и перемешивании. Через 3 ч после начала автолиза в суспензию вносят протосубтилин из расчета 4 ед.акт./г а.с.в. По окончании гидролиза суспензию прогревают при температуре 90°С в течение 30 мин, отделяют раствор экстракта от остатков дрожжевой биомассы центрифугированием, концентрируют его упариванием до содержания сухих веществ 18% и высушивают на распылительной сушилке.

Получают 205 г дрожжевого экстракта с содержанием аминного азота 2,8%* (*Здесь и далее в примерах определение аминного азота осуществляли формольным титрованием), или 5,6% (по методу, указанному в прототипе), выход экстракта 20,5%.

Пример 2. Аналогично примеру 1 ведут автолиз 4 кг прессованных хлебопекарных дрожжей в течение 6 ч, в присутствии олеиновой кислоты, при температуре 54°С, рН 7,0 и перемешивании. По окончании автолиза суспензию прогревают при 90°С в течение 30 мин и высушивают в сушилке "кипящего слоя". Затем готовят 14% водную суспензию автолизата, вносят протосубтилин (4 ед.акт./г) и прогревают в течение 1 ч при 30°С. Раствор экстракта отделяют центрифугированием, концентрируют упариванием до содержания а.с.в. 18% и высушивают на распылительной сушилке.

Получают 312 г дрожжевого экстракта (выход 31,2%) с содержанием аминного азота 2,9%.

Пример 3. 20 л 16%-ной суспензии дрожжей Candida utilis, выращенных на сульфитных щелоках, подвергают автолизу в течение 6 ч, при температуре 52°С, рН 6,8 и периодическом перемешивании, а затем прогреванию при 95°С в течение 40 мин. После этого 10 л автолизированной суспензии высушивают на вальцевой сушилке.

Последующее получение дрожжевого экстракта ведут параллельно из оставшихся 10 л автолизированной суспензии и вновь растворенного в воде высушенного автолизата. В обоих случаях к дрожжевой суспензии добавляют протосубтилин (8 ед.акт./г) и NaCl до конечной концентрации 1,0% и выдерживают 3 ч при температуре 45°С. Затем растворы экстрактов отделяют на микрофильтрационной установке, упаривают до 20% а.с.в. и высушивают на распылительной сушилке. Получают в первом случае (без высушивания автолизата) - 288 г экстракта (выход 18% от а.с.в. дрожжей) с содержанием аминного азота 2,51%, или 5,38% (по методу, указанному в прототипе); во втором случае (из высушенного автолизата) - 416 г экстракта (выход - 26% от а.с.в. дрожжей) с содержанием аминного азота 2,52%.

Пример 4. Из прессованных хлебопекарных дрожжей получают автолизат с содержанием аминного азота 1,8%, который высушивают на распылительной сушилке. Из сухого автолизата готовят 17% суспензию. В качестве экстрагента используют воду, или раствор уксусной кислоты рН 4,0, или 0,3% раствор хлорида натрия, или раствор гидроокиси натрия рН 8,5. Экстракцию ведут при 54°С и перемешивании в течение 4 ч. Растворимую часть отделяют центрифугированием, концентрируют выпариванием до содержания сухих веществ 10% и осветляют прогреванием при 100°С в течение 15 мин с последующим отделением выпавшего осадка. Полученные растворы осветленного экстракта имеют следующие качественные показатели (табл.1).

Таблица 1
Показатели качества экстрактов
Экстрагент	Содержание аминного азота, % от а.с.в.	Прозрачность растворов, %
Вода	2,8	97,0
Раствор уксусной кислоты	3,4	96,5
Раствор NaCl	3,6	98,0
Раствор NaOH	3,0	97,6

Пример 5. Готовят 10% по содержанию а.с.в. суспензию сухого дрожжевого автолизата, полученного из дрожжей Candida utilis, выращенных на сульфитных щелоках, для чего 105,2 г сухого автолизата суспендируют в 1 л 0,3%-ного водного раствора NaCl. Полученную суспензию выдерживают при 30°С в течение 2 ч при перемешивании, после чего в нее вносят 5 г Протосубтилина Г10х с активностью 120 ед./г (из расчета 6 ед.акт./г а.с.в.), предварительно растворенного в небольшом объеме воды. Суспензию тщательно перемешивают и протеолиз ведут при рН 6,8 в течение 3 ч при температуре 30°С.

По окончании протеолиза суспензию нагревают до 95°С, выдерживают при этой температуре 15 мин, затем охлаждают и центрифугируют.

Недосадочную жидкость - экстракт в количестве 670 мл с содержанием а.с.в. 6,3% концентрируют методом вакуум-выпаривания при температуре 50°С до содержания а.с.в. 18,2%. Полученный концентрат прогревают в течение 1 ч при 97°С и охлаждают. Выпавший осадок отделяют центрифугированием.

Осветленный концентрат фильтруют через ультрафильтрационную мембрану УПМ-5, задерживающую вещества с М.м выше 5 кДа.

Пермеат в количестве 220 мл с содержанием 15% а.с.в. лиофилизируют. Получают 35,8 г сухого осветленного экстракта с содержанием аминного азота 2,82%, прозрачность 1%-ного раствора экстракта - 98,7%.

Пример 6. Из сухого автолизата пекарских дрожжей готовят суспензию с содержанием а.с.в. 15%. Для этого 78,9 г сухого автолизата с влажностью 5% суспендируют в 0,5% растворе NaCl с температурой 55°С. Полученную суспензию в объеме 500 мл выдерживают при 120°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем охлаждают до 20°С и центрифугируют.

Полученный экстракт в количестве 335 мл упаривают до содержания а.с.в. 16,9% и прогревают при 100°С в течение 1 ч. Затем концентрат экстракта охлаждают, центрифугируют, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость - осветленный экстракт - очищают путем микрофильтрации через мембрану типа МФЦ-n с размером пор 0,15 мкм. Полученный микрофильтрат подвергают ультрафильтрации на мембране УПМ-5.

Пермеат в количестве 96 мл с содержанием а.с.в. 14,9% лиофилизируют. Получают 14,6 г экстракта с содержанием аминного азота 3,3%. Прозрачность 2%-го раствора экстракта автолизированных дрожжей - 99,2%.

Пример 7. Готовят 10% суспензию сухого автолизата пивных дрожжей в воде с температурой 50°С, используя 105,2 г сухого автолизата и 1 л воды. Полученную суспензию выдерживают 2 ч при рН 7,5. Затем, не снижая температуры, в суспензию вносят пепсин, предварительно растворенный в небольшом объеме воды из расчета 6 ед.акт./г а.с.в. Смесь выдерживают 3 ч при температуре 50°С и перемешивании.

По окончании протеолиза суспензию нагревают для инактивации фермента, охлаждают и центрифугируют.

Полученный экстракт в количестве 670 мл с содержанием 5,1% а.с.в. концентрируют вакуум-вапариванием до содержания а.с.в. 18,3% и лиофилизируют.

Получают 26,6 г сухого экстракта автолизированных дрожжей. В готовом продукте содержание аминного азота составляет 3,14%.

Возможность использования экстракта, полученного из сухого автолизата, для микробиологических целей подтверждается следующими результатами (табл.2, 3).

Таблица 2
Результаты использования экстракта автолизированных дрожжей в качестве стимулятора в ростовых питательных средах
Наименование тест-штамма		D600 через 18 ч культивирования на средах*
		с препаратом по примеру 3		с препаратом по примеру 6		мясопептонный бульон
Е.coli К m-802		0.59		0.60		0.45
S.aureus -75		1.14		1.10		0.33
D600 - оптическая плотность при длине волны 600 нм
Таблица 3
Результаты испытания экстракта автолизированных дрожжей в качестве основы жидких питательных сред
Наименование тест-штамма	D600 через 18 ч культивирования на средах
	с препаратом по примеру 7		с препаратом по примеру 5		мясопептонный бульон		бульон из компонентов фирмы "Дифко"
Е.coli AB 2463	0,32		0,35		0,06		0,35

Результаты испытаний показывают, что экстракт автолизированных дрожжей, полученный из сухого автолизата, может быть использован в качестве стимулятора в ростовых питательных средах, что позволяет ускорять рост тест-культур в 1,3-3,5 раза по сравнению с тривиальными средами.

Использование экстракта в качестве основы жидких питательных сред дает возможность повысить ростовые свойства в 5,3-6,8 раза.

Источники информации

1. Заявка ФРГ №3143947, кл. А 23 1/00, опубл. 11.05.83.

2. Патент РФ №2084171, кл. С 12 N 1/20, С 12 N 1/06, С 12 Р 13/04, опубл. 20.07.97.