4-пиридинил-n-ацил-l-фенилаланины
| Классы МПК: | C07D213/64 в положении 2 или 6 A61P29/00 Анальгетики нецентрального действия, жаропонижающие или противовоспалительные средства, например противоревматические средства; нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) |
| Автор(ы): | КАПЛАН Джералд Льюис (US), СУДДУРИ Ачютарао (US), ТИЛЛИ Джефферсон Райт (US) |
| Патентообладатель(и): | Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH) |
| Приоритеты: |
подача заявки:
2000-11-29 публикация патента:
20.02.2006 |
Предложены 4-пиридинил-N-ацил-L-фенилаланины формулы (I), где R1-7 имеют значения, указанные в формуле, которые являются ингибиторам связывания VCAM-1 с клетками, экспрессирующими VLA-4, и которые в связи с этим применяются для лечения заболеваний, симптомы или проявления которых ассоциированы со связыванием VCAM-1 с клетками, экспрессирующими VLA-4, такими, как хронические воспалительные заболевания. Технический результат: соединения по изобретению используются как лекарственное средство или как фармацевтическая композиция для лечения ревматоидного артрита, рассеянного склероза, астмы. 2 н. и 48 з.п. ф-лы, 3 табл.
Формула изобретения
1. Соединение формулы
где R1 означает группу формулы Y-1
где R22 и R23 независимо означают водород, (низш.)алкил, (низш.)алкокси, циклоалкил, (низш.)алканоил, галоген или перфтор(низш.)алкил, и по меньшей мере один из R 22 и R23 не означает водород, a R24 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкокси; или R1 означает группу формулы Y-3,
где R25 означает (низш.)алкил, или группу формулы R26-(СН2)е-, где R26 означает (низш.)алкокси, или R26 означает группу формулы -NR28R29, где R28 означает водород или (низш.)алкил, R29 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкилсульфонил;
Q означает -(CH2) fO-, -(CH2)f-;
е означает целое число от 0 до 4, a f означает целое число от 0 до 3;
R 2 означает водород, (низш.)алкил, замещенный (низш.)алкил,;
R3 означает водород, галоген, (низш.)алкил, трифторметил;
R4 означает водород, галоген, (низш.)алкил;
R5 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкокси или трифторметил, или ОН;
R6 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкилкарбонилокси(низш.)алкил, или
R6 означает группу формулы Р-3;
где R32 означает водород или (низш.)алкил; R33 означает водород, (низш.)алкил, арил, такой как фенил или нафтил; R34 означает водород или (низш.)алкил; h означает целое число от 0 до 2; g означает целое число от 0 до 2; сумма h и g равна числу от 1 до 3;
R7 означает водород, (низш.)алкокси или (низш.)алкил,
или его фармацевтически приемлемые соли.
2. Соединение по п.1, где R3 означает водород, галоген или (низш.)алкил.
3. Соединение по п.1 или 2, где R1 означает Y-3, где Q означает -(СН2)fO- или -(СН 2)f-.
4. Соединение по п.3, где R 5 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил.
5. Соединение по п.1 или 2, где R1 означает группу формулы Y-1, где R22 и R23 независимо означают водород, (низш.)алкил или галоген, a R24 означает водород, (низш.)алкил или (низш.)алкокси.
6. Соединение по п.5, где R22 и R23 независимо означают водород, (низш.)алкил или галоген, R24 означает водород или (низш.)алкокси.
7. Соединение по п.1 или 2, где R 1 означает группу формулы Y-3, где R25 означает группу формулы R26-(CH2)e-, где R26 означает (низш.)алкокси, Q означает -(CH 2)f-, e означает целое число от 0 до 4 и f означает целое число от 0 до 3.
8. Соединение по п.1 или 2, где R1 означает группу формулы Y-3, а R2 означает водород, (низш.)алкил или замещенный (низш.)алкил.
9. Соединение по п.8, где R1 означает группу формулы Y-3, где R 25 означает группу формулы R26-(СН2 )е-, где R26 означает (низш.)алкокси, Q означает -(CH2)f-, e означает целое число от 0 до 4 и f означает целое число от 0 до 3.
10. Соединение по п.1 или 2, где R2 означает водород или (низш.)алкил;
R3 означает водород;
R4 означает водород или галоген;
R5 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил, или (низш.)алкокси;
R6 означает водород или (низш.)алкил; и R7 означает водород, (низш.)алкокси или (низш.)алкил.
11. Соединение по п.10, где R1 означает группу формулы Y-1.
12. Соединение по п.11, где R1 означает группу формулы Y-1, где R22 и R23 независимо означают водород, (низш.)алкил или галоген, a R24 означает водород, (низш.)алкил или (низш.)алкокси.
13. Соединение по п.12, где R1 означает группу Y-1, где R24 означает водород.
14. Соединение по п.10, где R1 означает группу формулы Y-3.
15. Соединение по п.14, где R1 означает группу формулы Y-3, где R25 означает группу формулы R26-(CH2)e-, где R 26 означает (низш.)алкокси, Q означает -(CH2 )f-, е означает целое число от 0 до 4 и f означает целое число от 0 до 3.
16. Соединение по п.10, где R 2 означает водород или (низш.)алкил;
R3 означает водород;
R4 означает галоген;
R5 означает водород;
R6 означает водород или (низш.)алкил; и R7 означает водород, (низш.)алкокси или (низш.)алкил.
17. Соединение по любому из пп.1, 3 или 4, где R1 означает группу формулы Y-1 или группу формулы Y-3;
R3 означает водород или (низш.)алкил;
R3 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил;
R4 означает водород или галоген;
R 5 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил;
R6 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкилкарбонилокси(низш.)алкил или группу формулы Р-3 и
R7 означает водород или (низш.)алкил.
18. Соединение по п.17, где
R 2 означает (низш.)алкил или арил(низш.)алкил;
R 6 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкилкарбонилокси(низш.)алкил или группу формулы Р-3 и
R7 - означает водород.
19. Соединение по п.18, где R1 означает группу формулы Y-1, где R22 и R23 означают водород, галоген или (низш.)алкил, R24 означает водород или (низш.)алкокси, или R1 означает Y-3, где R25 означает группу формулы R26-(СН2) е-, где R26 означает (низш.)алкокси, Q означает -(CH2)f-, e означает целое число от 0 до 4 и f означает целое число от 0 до 3.
20. Соединение по п.19, где R2 означает (низш.)алкил, R4 означает водород, а R3 и R5 означают (низш.)алкил или трифторметил.
21. Соединение по п.20, где R6 означает водород.
22. Соединение по п.21, где R1 означает Y-1.
23. Соединение по п.22, где R22 и R23 означают галоген или (низш.)алкил.
24. Соединение по п.23, которое означает
N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин,
N-[(2-этил-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин,
N-[(2-(1-метилэтил)-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин,
N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин,
N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин или
N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин.
25. Соединение по п.21, где R1 означает Y-3.
26. Соединение по п.25, которое означает N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]-карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин.
27. Соединение по п.20, где R6 означает (низш.)алкил.
28. Соединение по п.27, которое означает
этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина или
этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина.
29. Соединение по п.20, где R6 означает (низш.)алкилкарбонилокси(низш.)алкил.
30. Соединение по п.29, которое означает
1-(ацетокси)этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
1-(ацетокси)этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
1-(ацетокси)этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина или
1-(ацетокси)этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина.
31. Соединение по п.20, где R6 означает группу формулы Р-3, где R32 означает водород; R33 и R34 означают (низш.)алкил; один из g и h означает 1, а другой равен 0.
32. Соединение по п.31, которое означает
2-[(N,N-диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
2-[(N,N-диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
2-[(N,N-диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина или
2-[(N,N-диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина.
33. Соединение по п.19, где R6 означает водород.
34. Соединение по п.33, где R2 означает (низш.)алкил, R3 означает водород, R4 означает водород или галоген, a R5 означает водород или (низш.)алкил.
35. Соединение по п.34, где R1 означает Y-1.
36. Соединение по п.35, где R22 и R23 означают (низш.)алкил или галоген, а R24 означает водород.
37. Соединение по п.36, которое означает
N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин,
N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин или
N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин.
38. Соединение по п.37, где R22 и R23 означают галоген, а R24 означает водород.
39. Соединение по п.38, которое означает N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин.
40. Соединение по п.35, где R22 и R23 означают галоген или водород, а R24 означает (низш.)алкокси.
41. Соединение по п.40, которое означает
N-[(2-бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин или
N-[(2-бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин.
42. Соединение по п.34, где R1 означает Y-3.
43. Соединение по п.42, которое означает 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланин.
44. Соединение по п.18, где R22 и R23 означают галоген или (низш.)алкил, R24 означает водород или (низш.)алкокси, R25 означает группу формулы R 26-(СН2)е-, где R26 означает (низш.)алкокси, Q означает -(CH2)f-, e означает целое число от 0 до 4, и f означает целое число от 0 до 3.
45. Соединение по п.44, где R2 означает арил(низш.)алкил, R3 означает водород, R4 означает галоген, a R5, R6 и R7 означают водород.
46. Соединение по п.45, где R1 означает Y-1.
47. Соединение по п.46, которое означает
4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-L-фенилаланин или
4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланин.
48. Соединение по любому из пп.1-47, обладающее свойством ингибирующего взаимодействия альфа-интегринов с VCAM-1 и предназначенное для приготовления фармацевтического средства для лечения хронических воспалительных заболеваний.
49. Фармацевтическая композиция, обладающая свойством ингибирующего взаимодействия альфа-интегринов с VACM-1, предназначенная для лечения хронических воспалительных заболеваний, включающая соединение по любому из пп.1-47 или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель.
50. Соединение по любому из пп.1-47 для использования при лечении патологических состояний, опосредованных связыванием VCAM-1 с VLA-4 или с экспрессирующими VLA-4 клетками, прежде всего при лечении ревматоидного артрита, рассеянного склероза, воспаления кишечника и астмы.
Описание изобретения к патенту
Белок-1 адгезии клеток сосудов (VCAM-1), член суперсемейства иммуноглобулинов (Ig), экспрессируется активированным, но не покоящимся эндотелием. Главным рецептором VCAM-1 является интегрин VLA-4 (4
1), который экспрессируется многими типами клеток, включая лимфоциты крови, эозинофилы, базофилы и моноциты, но не нейтрофилы. Антитела к VCAM-1 или VLA-4 могут блокировать адгезию этих одноядерных лейкоцитов, а также клеток меланомы на активированном эндотелии in vitro. На ряде моделей воспалительного процесса у животных антитела к любому из этих белков ингибировали инфильтрацию лейкоцитов и предотвращали повреждение тканей. Установлено, что моноклональные антитела к VLA-4 блокируют эмиграцию Т-клеток при артрите, индуцированном адъювантом, предотвращая накопление эозинофилов и сужение бронхов на модели астмы, снижают паралич и ингибируют инфильтрацию моноцитов и лимфоцитов при экспериментальном аутоиммунном энцефалите (ЭАЭ). Установлено, что моноклональные антитела к VCAM-1 пролонгируют время выживания сердечных аллотрансплантатов. Недавние исследования показали, что моноклональные антитела к VLA-4 могут предупреждать инсульт и диабет у мышей с моделью диабета без ожирения и значительно ослаблять воспаление на модели колита у одного из видов тамарина (cotton-top tamarin). Кроме того, установлено, что VCAM экспрессируется эндотелиальными клетками воспаленной толстой кишки на модели воспаления кишечника у крыс с генотипом TNB/этанол (Gastroenterology, 116, 874-883 (1999)).
Таким образом, соединения, ингибирующие взаимодействие 4-интегринов с VCAM-1, могут применяться в качестве терапевтических агентов для лечения хронических воспалительных заболеваний, таких, как ревматоидный артрит (РА), рассеянный склероз (PC), астма, воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). Этим действием обладают соединения по настоящему изобретению.
Если не указано иное, термин «галоген», используемый в описании изобретения, означает любой из четырех галогенов, бром, хлор, фтор и иод. Предпочтительными галогенами являются бром, фтор и хлор. Термин «(низш.)алкил», применяемый отдельно или в различных сочетаниях, означает прямую или разветвленную алкильную группу, содержащую от одного максимум до шести атомов углерода (С1-С6), такую, как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, н-гексил и т.п.
Термин «замещенный (низш.)алкил» означает группу (низш.)алкил, имеющую значения, указанные выше, замещенную одной или более группами, независимо выбранными из группы, включающей циклоалкил, нитро, арилокси, арил, гидрокси, галоген, циано, (низш.)алкокси, (низш.)алканоил, (низш.)алкилтио, (низш.)алкилсульфинил, (низш.)алкилсульфонил, амино или моно- или ди(низш.)алкиламино. Примеры замещенных (низш.)алкильных групп включают 2-гидроксиэтил, 3-оксобутил, цианометил и 2-нитропропил. Хотя настоящее изобретение прежде всего относится к замещенной (низш.)алкильной группе трифторметил в положениях R3 и R5, в этих положениях предполагается также пентафторэтил. Это также относится к R 22 и R23.
Термин «циклоалкил» (или (низш.)циклоалкил) означает незамещенный или замещенный 3-7-членный углеродный цикл. Заместителями, используемыми по настоящему изобретению, являются гидрокси, галоген, циано, (низш.)алкокси, (низш.)алканоил, (низш.)алкил, ароил, (низш.)алкилтио, (низш.)алкилсульфинил, (низш.)алкилсульфонил, арил, гетероарил и моно- или ди(низш.)алкиламино.
Термин «(низш.)алкенил» означает группу алкилен, содержащую от 2 до 10 атомов углерода с двойной связью между двумя соседними атомами углерода.
Термин «(низш.)алкокси» означает прямую или разветвленную алкоксигруппу, содержащую максимум до шести атомов углерода, такую, как метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, трет-бутокси и т.п.
Термин «(низш.)алкилтио» означает группу (низш.)алкил, связанную с остатком молекулы через двухвалентный атом серы, например метилмеркапто или изопропилмеркаптогруппу. Термин «(низш.)алкилсульфинил» означает группу (низш.)алкил, имеющую значения, как указано выше, связанную с остатком молекулы через атом серы сульфинильной группы. Термин «(низш.)алкилсульфонил» означает группу (низш.)алкил, имеющую значения, указанные выше, связанную с остатком молекулы через атом серы сульфонильной группы.
Термин «арил» означает моно- или бициклическую ароматическую группу, такую, как фенил или нафтил, незамещенную или замещенную обычными заместителями. Предпочтительными заместителями являются (низш.)алкил, (низш.)алкокси, гидрокси(низш.)алкил, гидрокси, гидроксиалкокси, галоген, (низш.)алкилтио, (низш.)алкилсульфинил, (низш.)алкилсульфонил, циано, нитро, перфтор(низш.)алкил, алканоил, ароил, арил, алкинил, (низш.)алкинил и (низш.)алканоиламино. Примерами арильных групп, которые могут использоваться по изобретению, являются фенил, пара-толил, пара-метоксифенил, пара-хлорфенил, мета-гидроксифенил, мета-метилтиофенил, 2-метил-5-нитрофенил, 2,6-дихлорфенил, 1-нафтил и т.п.
Термин «арилалкил» означает группу (низш.)алкил, имеющую значения, указаннные выше, в которой один или более атомов водорода замещен/замещены группой арил или гетероарил, имеющей значения, указанные выше. По изобретению может быть использована любая аралкильная группа, такая, как бензил и т.п.
Термин «гетероарил» означает незамещенное или замещенное 5- или 6-членное моноциклическое гетероароматическое кольцо или 9- или 10-членное бициклическое гетероароматическое кольцо, содержащее 1, 2, 3 или 4 гетероатома, которые независимо означают N, S или О. Примерами гетероарильных циклов являются пиридин, бензимидазол, индол, имидазол, тиофен, изохинолин, хинолин и т.п. В определение гетероарила включены заместители, указанные выше в определении группы «арил».
Термин «(низш.)алкоксикарбонил» означает (низш.)алкоксигруппу, связанную через карбонильную группу. Примеры алкоксикарбонильной группы включают этоксикарбонил и т.п.
Термин «(низш.)алкилкарбонилокси» означает (низш.)алкилкарбонилоксигруппы, связанные через атом кислорода, например ацетоксигруппу. Аналогичное значение имеет термин «ацилокси».
Термин «(низш.)алканоил» означает группы (низш.)алкил, связанные через карбонильную группу, и включает такие из вышеуказанных групп, как ацетил, пропионил и т.п. Термин «перфтор(низш.)алканоил» означает группу перфтор(низш.)алкил (замещенную группу (низш.)алкил, в которой все атомы водорода замещены на атом фтора, предпочтительно трифторметил или пентафторэтил), связанную с остатком молекулы через карбонильную группу. Термин «перфтор(низш.)алканоиламино» означает перфтор(низш.)алканоильную группу, связанную с остатком молекулы через аминогруппу.
Термин «(низш.)алкилкарбониламино» означает группу (низш.)алкилкарбонил, связанную с остатком молекулы через атом азота, такую, как ацетиламино. Термин «(низш.)алкиламинокарбонил» означает группу (низш.)алкиламино, связанную с остатком молекулы через карбонильную группу. Термин «ариламинокарбонил» означает арильные группы, связанные с аминогруппой, присоединенной к остатку молекулы через карбонильную группу.
Термин «ароил» означает моно- или бициклическую арильную или гетероарильную группу, связанную с остатком молекулы через карбонильную группу. Примерами ароильных групп являются бензоил, 3-цианобензоил, 2-нафтоил, никотиноил и т.п.
Фармацевтически приемлемые соли известны в данной области техники и могут быть получены обычными способами с учетом химических свойств соединения. Примерами фармацевтически приемлемых солей кислотных соединений являются соли щелочных или щелочно-земельных металлов, таких, как натрий, калий, кальций, магний, а также соли с основными аминами или основными аминокислотами, соли аммония или алкиламмония. Для соединений по изобретению, например, где R6 означает Н, прежде всего предпочтительны соли натрия. Натриевую соль любой кислоты по настоящему изобретению получают при ее взаимодействии с гидроксидом натрия. Для основных соединений примерами солей являются соли неорганических или органических кислот, таких, как хлористоводородная, бромистоводородная, серная, азотная, фосфорная, лимонная, муравьиная, фумаровая, малеиновая, уксусная, янтарная, винная, метансульфоновая и пара-толуолсульфоновая кислоты.
Настоящее изобретение включает соединение формулы I
и его фармацевтически приемлемые соли. Изобретение также включает содержащие их фармацевтические композиции, их применение в качестве лекарственных средств при лечении некоторых заболеваний и способы и промежуточные соединения для их получения.
Согласно изобретению R1 означает группу формулы Y-1, Y-2 или Y-3, имеющую значения, указанные ниже: Y-1 означает группу формулы
где R22 и R23 независимо означают водород, (низш.)алкил, (низш.)алкокси, циклоалкил, арил, арилалкил, нитро, циано, (низш.)алкилтио, (низш.)алкилсульфинил, (низш.)алкилсульфонил, (низш.)алканоил, галоген или перфтор(низш.)алкил и по меньшей мере один из R22 и R23 не означает водород, и R24 означает водород; (низш.)алкил, (низш.)алкокси, арил, нитро, циано, (низш.)алкилсульфонил или галоген,
Y-2 означает группу формулы Y-2, которая является пяти- или шестичленным гетероароматическим циклом, связанным через атом углерода с амидокарбонилом, причем вышеупомянутый цикл содержит один, два или три гетероатома, выбранных из группы, включающей N, О и S, и один или два атома вышеупомянутого цикла независимо замещены группами (низш.)алкил, циклоалкил, галоген, циано, перфтор(низш.)алкил или арил и по меньшей мере один из вышеупомянутых замещенных атомов является соседним с атомом углерода, связанным с амидокарбонилом;
Y-3 означает 3-7-членный цикл формулы
где R25 означает (низш.)алкил, незамещенный или фторзамещенный (низш.)алкенил или группу формулы R26 -(CH2)e-, где R26 означает арил, гетероарил, азидо, циано, гидрокси, (низш.)алкокси, (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоил, (низш.)алкилтио, (низш.)алкилсульфонил, (низш.)алкилсульфинил, перфтор(низш.)алканоил, нитро или R26 означает группу формулы -NR28R29, где R28 означает водород или (низш.)алкил, R29 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоил, ароил, перфтор(низш.)алканоиламино, (низш.)алкилсульфонил, (низш.)алкиламинокарбонил, ариламинокарбонил, или R28 и R29 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 4, 5 или 6-членное насыщенное гетероциклическое кольцо, необязательно содержащее один дополнительный гетероатом, выбранный из О, S, и N-R40, Q означает -(CH2)fO-, -(CH2)f S-, -(CH2)fN(R27)-, -(CH 2)f-, R27 означает Н, (низш.)алкил, арил, (низш.)алканоил, ароил или (низш.)алкоксикарбонил, R 40 означает Н, (низш.)алкил, арил, (низш.)алканоил, ароил или (низш.)алкоксикарбонил, атомы углерода в цикле являются незамещенными или замещенными (низш.)алкилом или галогеном, е означает целое число от 0 до 4, a f означает целое число от 0 до 3;
R 2 означает водород, (низш.)алкил, замещенный (низш.)алкил, арил или арил(низш.)алкил,
R3 означает водород, галоген, (низш.)алкил или арил, или также может включать трифторметил,
R4 означает водород, галоген, (низш.)алкил или арил,
R5 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкокси, трифторметил или ОН,
R6 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкилкарбонилокси(низш.)алкил или R6 означает группу формулы Р-3
где R32 означает водород или (низш.)алкил, R33 означает водород, (низш.)алкил, арил, R34 означает водород или (низш.)алкил, h означает целое число от 0 до 2, g означает целое число от 0 до 2, сумма h и g равна от 1 до 3, или R6 означает группу формулы Р-4
где R32, g и h имеют значения, указанные выше, Q' означает О, S, -(СН2)j- или группу формулы N-R35, где R35 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алканоил, (низш.)алкоксикарбонил, j означает 0, 1 или 2, R7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил. Предпочтительно Q означает -(CH2 )fO-, -(CH2)fS- или -(CH 2)f- (формула 1а). В соединениях формулы I или формулы 1а также предпочтительно, если R5 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил (формула 1b).
Соединения по изобретению могут существовать в виде стереоизомеров и диастереомеров, каждый из которых включен в объем настоящего изобретения.
В первом предпочтительном варианте соединения формулы I, формулы 1а или формулы 1b R2 означает водород, (низш.)алкил или арил(низш.)алкил, R3 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил, предпочтительно водород, R4 означает водород или галоген, предпочтительно галоген, R5 означает водород, (низш.)алкил, трифторметил и, кроме того, может означать (низш.)алкокси, предпочтительно водород, R6 означает водород или (низш.)алкил и R7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил.
Более предпочтительным воплощением первого предпочтительного варианта настоящего изобретения является соединение формулы I, формулы 1а или формулы 1b
где R1 означает группу Y-1
где R22 и R23 независимо означают водород, (низш.)алкил, (низш.)алкокси, циклоалкил, арил, арилалкил, нитро, циано, (низш.)алкилтио, (низш.)алкилсульфинил, (низш.)алкилсульфонил, (низш.)алканоил, галоген или перфтор(низш.)алкил и по меньшей мере один из R22 и R23 не означает водород, R24 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкокси, арил, нитро, циано, (низш.)алкилсульфонил или галоген, более конкретно R22 и R23 независимо означают (низш.)алкил или галоген, а R24 означает водород или (низш.)алкокси; или R22 и R23 независимо означают водород, (низш.)алкил или галоген, а R24 означает водород, (низш.)алкил или (низш.)алкокси, прежде всего водород. В таких соединениях предпочтительно, если R2 означает водород, (низш.)алкил или арил(низш.)алкил, прежде всего арил(низш.)алкил. Более того, предпочтительны такие соединения, где R3 означает водород, R4 означает водород или галоген или, кроме того, может означать (низш.)алкил (но предпочтительно галоген), R5 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил или, кроме того, может означать (низш.)алкокси (но предпочтительно водород), R6 означает водород или (низш.)алкил и R7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил.
Более предпочтительным воплощением настоящего изобретения является соединение формулы I, формулы 1а или формулы 1b, описанных выше, где R1 означает группу Y-1
где R22 и R23 независимо означают водород, (низш.)алкил или галоген, прежде всего (низш.)алкил или галоген; R24 означает водород, (низш.)алкил или (низш.)алкокси, прежде всего водород. В таких соединениях предпочтительно, если R2 означает водород, (низш.)алкил или арил(низш.)алкил; R3 означает водород; R4 означает водород или галоген, R5 означает водород или (низш.)алкил, R6 означает водород или (низш.)алкил, a R7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил. В наиболее предпочтительных соединениях этого более предпочтительного воплощения изобретения R22 и R23 независимо означают водород, (низш.)алкил или галоген, R24 означает водород или (низш.)алкокси, a R2 означает арил(низш.)алкил. В другом варианте в таких соединениях предпочтительно, если R 2 означает водород, (низш.)алкил или арил(низш.)алкил; R3 означает водород; R4 означает водород или галоген или, кроме того, может означать (низш.)алкил (но предпочтительно галоген); R5 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил или, кроме того, может означать (низш.)алкокси (но предпочтительно галоген); R6 означает водород или (низш.)алкил, a R7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил.
Другим предпочтительным воплощением настоящего изобретения является соединение формулы I, формулы 1а, или формулы 1b, описанных выше, прежде всего первого предпочтительного варианта, где R1 означает пяти- или шестичленный гетероароматический цикл, связанный через атом углерода с амидокарбонилом, причем вышеупомянутый цикл содержит два или три гетероатома, выбранных из группы, включающей N, О и S, и один или два атома вышеупомянутого цикла независимо замещены группами (низш.)алкил, циклоалкил, галоген, циано, перфтор(низш.)алкил или арил, и по меньшей мере один из вышеупомянутых замещенных атомов является соседним с атомом углерода, связанным с амидокарбонилом. В таких соединениях более предпочтительно, если R2 означает водород, (низш.)алкил или арил(низш.)алкил; R3 означает водород; R4 означает водород или галоген (предпочтительно галоген); R5 означает водород, трифторметил или (низш.)алкил (предпочтительно водород); R6 означает водород или (низш.)алкил, и R7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил. В другом варианте в таких соединениях предпочтительно, если R2 означает водород, (низш.)алкил или арил(низш.)алкил; R3 означает водород; R4 означает водород или галоген, или, кроме того, может означать (низш.)алкил (но предпочтительно галоген); R5 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил или, кроме того, может означать (низш.)алкокси (но предпочтительно водород); R6 означает водород или (низш.)алкил и R7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил.
Еще одним предпочтительным воплощением настоящего изобретения является соединение формулы I, 1a или 1b, описанной выше, где R1 означает группу формулы Y-3, которая является 3-7-членным циклом формулы
где R25 означает (низш.)алкил, незамещенный или фторзамещенный (низш.)алкенил или группу формулы R26 -(CH2)e-, где R26 означает арил, гетероарил, азидо, циано, гидрокси, (низш.)алкокси, (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоил, (низш.)алкилтио, (низш.)алкилсульфонил, (низш.)алкилсульфинил, перфтор(низш.)алканоил, нитро или R26 означает группу формулы -NR28R29, где R28 означает водород или (низш.)алкил, R29 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоил, ароил, перфтор(низш.)алканоиламино, (низш.)алкилсульфонил, (низш.)алкиламинокарбонил, ариламинокарбонил или R28 и R29 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 4, 5 или 6-членное насыщенное гетероциклическое кольцо, необязательно содержащее один дополнительный гетероатом, выбранный из О, S, и N-R40, Q означает -(CH2)fO-, -(CH2)f S-, -(CH2)fN(R27)-, -(CH 2)f-, R27 означает Н, (низш.)алкил, арил, (низш.)алканоил, ароил или (низш.)алкоксикарбонил, R 40 означает Н, (низш.)алкил, арил, (низш.)алканоил, ароил или (низш.)алкоксикарбонил, атомы углерода в цикле являются незамещенными или замещенными (низш.)алкилом или галогеном, е означает целое число от 0 до 4, а f означает целое число от 0 до 3. В таких соединениях более предпочтительно, если R2 означает водород, (низш.)алкил или арил(низш.)алкил; R3 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил; R4 означает водород или галоген (предпочтительно галоген); R5 означает водород, трифторметил или (низш.)алкил (предпочтигельно водород); R6 означает водород или (низш.)алкил и R 7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил. В другом варианте в таких соединениях предпочтительно, если R 2 означает водород, (низш.)алкил или арил(низш.)алкил; R3 означает водород; R4 означает водород или галоген или, кроме того, может означать (низш.)алкил (но предпочтительно галоген); R5 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил, или, кроме того, может означать (низш.)алкокси (но предпочтительно водород); R6 означает водород или (низш.)алкил и R7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил.
Более предпочтительным воплощением настоящего изобретения является соединение формулы I, формулы 1а или формулы 1b, описанных выше, прежде всего первого предпочтительного варианта, где R1 означает группу формулы Y-3, описанной выше, более конкретно 3-7-членный цикл формулы
где R25 означает группу формулы R26 -(CH2)e-, где R26 означает (низш.)алкокси, Q означает -(CH2)f-, е означает целое число от 0 до 4 и f означает целое число от 0 до 3.
Прежде всего предпочтительны соединения, где R2 означает водород, (низш.)алкил, замещенный (низш.)алкил, арил или арил(низш.)алкил, прежде всего арил(низш.)алкил.
Кроме того, предпочтительны соединения, где R2 означает (низш.)алкил или арил(низш.)алкил; R3 означает водород; R4 означает водород или галоген; R5 означает водород или (низш.)алкил; R6 означает водород или (низш.)алкил и R7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил. В другом варианте в таких соединениях предпочтительно, если R2 означает водород, (низш.)алкил или арил(низш.)алкил; R3 означает водород; R4 означает водород или галоген или, кроме того, может означать (низш.)алкил (но предпочтительно галоген); R5 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил, или, кроме того, может означать (низш.)алкокси (но предпочтительно водород); R6 означает водород или (низш.)алкил и R 7 означает водород, хлор, (низш.)алкокси или (низш.)алкил.
В любом соединении по настоящему изобретению формулы I, формулы 1а или формулы 1b R1 может быть группой формулы Y-1 или группой формулы Y-3; R2 может означать водород, (низш.)алкил или арил(низш.)алкил, предпочтительно (низш.)алкил, прежде всего метил, или арил(низш.)алкил, прежде всего бензил, R3 может означать водород, (низш.)алкил или трифторметил, предпочтительно водород или (низш.)алкил; R4 может означать водород или галоген; R5 может означать водород, (низш.)алкил или трифторметил; R6 может означать водород, (низш.)алкил, (низш.)алкилкарбонилокси(низш.)алкил или группу формулы Р-3 и, кроме того, группу формулы Р-4, и R7 может означать (низш.)алкил или водород, предпочтительно водород.
В любом соединении по настоящему изобретению формулы I, формулы 1а, формулы 1b или в предпочтительных соединениях, описанных в предшествующем абзаце, группы в Y-1 и Y-3 могут быть конкретно выбраны следующим образом:
R22 и R33 означают водород, галоген, (низш.)алкил, R24 означает водород или (низш.)алкокси, R25 означает группу формулы R26-(СН2)е-, где R26 означает (низш.)алкокси, Q означает -(CH2)f -, е означает целое число от 0 до 4 и f означает целое число от 0 до 3, и/или R2 означает (низш.)алкил, R4 означает водород и R3 и R5 означают (низш.)алкил или трифторметил, a R6 означает водород, (низш.)алкил, или (низш.)алкилкарбонилокси(низш.)алкил, или группу формулы Р-3, предпочтительно, где
R32 означает водород; R33 и R34 означают (низш.)алкил; один из g и h означает 1, а другой равен 0. В таких соединениях предпочтительно R6 и R7 означают водород и/или R2 означает (низш.)алкил; R3 означает водород; R4 означает водород или галоген и R5 означает водород или (низш.)алкил, предпочтительно R 22 и R23 означают (низш.)алкил или галоген, прежде всего галоген, и R24 означает водород, или R22 и R23 означают водород или галоген и R24 означает водород или (низш.)алкокси, предпочтительно водород, или R1 означает Y-3.
Конкретными соединениями являются следующие:
N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин,
N-[(2-этил-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин,
N-[(2-(1-метилэтил)-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин,
N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин,
N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин или
N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин.
В других таких соединениях R22 и R23 означают предпочтительно галоген или или (низш.)алкил, R 24 означает водород или (низш.)алкокси, R25 означает группу формулы R26-(СН2)е -, где R26 означает (низш.)алкокси, Q означает -(CH2)f-, е означает целое число от 0 до 4 и f означает целое число от 0 до 3, конкретно N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин, и/или R2 означает арил(низш.)алкил; R3 означает водород; R4 означает галоген, а R5 , R6 и R7 означают водород. Кроме того, предпочтительно, когда R1 означает Y-1.
В более предпочтительном соединении формулы I, формулы 1а или формулы 1b R1 означает группу формулы Y-1 или группу формулы Y-3; R2 означает (низш.)алкил или арил(низш.)алкил; R3 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил; R4 означает водород или галоген; R5 означает водород, (низш.)алкил или трифторметил; R6 означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкилкарбонилокси(низш.)алкил или группу формулы Р-3 и R7 означает водород (формула А).
У предпочтительного соединения формулы А группы в Y-1 и Y-3 могут быть конкретно выбраны следующим образом: R22 и R23 означают водород, галоген или (низш.)алкил, R24 означает водород или (низш.)алкокси, R25 означает группу формулы R26-(CH2) e-, где R26 означает (низш.)алкокси, Q означает -(CH2)f-, е означает целое число от 0 до 4 и f означает целое число от 0 до 3 (формула А-1).
В предпочтительном соединении формулы А-1 R2 означает (низш.)алкил, R4 означает водород, а R3 и R5 означают (низш.)алкил или трифторметил (формула А-1а). В одном из вариантов формулы А-1а, R6 означает водород. В этом варианте R1 может означать Y-1, прежде всего где R22 и R23 означают галоген или (низш.)алкил или R1 может означать Y-3. В других вариантах формулы А-1а R6 означает (низш.)алкил, прежде всего метил, или (низш.)алкилкарбонилокси(низш.)алкил, прежде всего 1-(ацетокси)этил, или группу формулы Р-3, где R33 означает водород; R33 и R34 означают (низш.)алкил, прежде всего метил или этил; один из g и h означает 1, а другой означает 0.
Конкретными соединениями, где R6 означает (низш.)алкил, являются следующие:
этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина или
этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина.
Конкрентными соединениями, где R6 означает (низш.)алкилкарбонилокси(низш.)алкил, являются следующие:
1-(ацетокси)этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
1-(ацетокси)этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
1-(ацетокси)этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина или
1-(ацетокси)этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина.
Конкрентными соединениями, где R6 означает Р-3, являются следующие:
2-[(N,N-диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
2-[(N,N-диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина,
2-[(N,N-диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина или
2-[N,N-диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина.
В другом предпочтительном соединении формулы А-1 R 6 означает водород. Предпочтительно R2 означает (низш.)алкил, R3 означает водород, R4 означает водород или галоген, a R5 означает водород или (низш.)алкил (формула А-1b). В одном из вариантов формулы A-1b R1 означает Y-1. Предпочтительно R22 и R23 означают (низш.)алкил или галоген, a R24 означает водород или R22 и R23 означают галоген, а R24 означает водород, прежде всего это следующие оединения:
N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин,
N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин,
N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин или
N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин,
или R22 и R24 означают водород или галоген, а R23 означает (низш.)алкокси. В другом варианте формулы A-1b R1 означает Y-3, прежде всего это 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланин.
В другом предпочтительном соединении формулы A R1 означает Y-1, где R22 и R23 означают галоген или (низш.)алкил, R24 означает водород или (низш.)алкокси, или R1 означает Y-3, где R25 означает группу формулы R26-(СН2) е-, где R26 означает (низш.)алкокси, Q означает -(CH2)f-, e означает целое число от 0 до 4, и f означает целое число от 0 до 3. Предпочтительно R 2 означает арил(низш.)алкил, R3 означает водород, R4 означает галоген, а R5, R6 и R7 означают водород. Предпочтительно R1 означает Y-1, прежде всего это следующие соединения:
4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-L-фенилаланин или
4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланин.
Другой аспект настоящего изобретения относится к соединениям формулы II
где R2-R5 и R7 имеют значения, указанные для формулы I, a P1 и Р2 каждый является защитной группой. Более конкретно, Р1 означает обычную аминозащитную группу, такую, как трет-бутилоксикарбонил (Вос) или карбобензилоксигруппу, а Р2 означает обычную карбоксизащитную группу, такую, как (низш.)алкил или замещенный (низш.)алкил. Эти соединения используются в качестве промежуточных продуктов при синтезе соединений формулы I.
Соединения по изобретению ингибируют связывание VCAM-1 и фибронектина с VLA-4 на циркулирующих лимфоцитах, эозинофилах, базофилах и моноцитах ("VLA-4-экспрессирующих клетках"). Известно, что связывание VCAM-1 и фибронектина с VLA-4 на таких клетках влечет за собой определенные патологические состояния, такие, как ревматоидный артрит, рассеянный склероз, воспаление кишечника, и, в частности, вызывает связывание эозинофилов на эндотелии дыхательных путей, что является причиной воспаления легких, приводящего к астме. Таким образом, соединения по настоящему изобретению могут применяться для лечения астмы.
Благодаря способности ингибировать связывание VCAM-1 и фибронектина с VLA-4 на циркулирующих лимфоцитах, эозинофилах, базофилах и моноцитах, соединения по изобретению могут использоваться как лекарственное средство или соответственно как фармацевтическая композиция, прежде всего для лечения нарушений, о которых, как известно, опосредуются таким связыванием. Примерами таких нарушений являются ревматоидный артрит, рассеянный склероз, астма и воспаление кишечника. Соединения по изобретению предпочтительно используются для лечения заболеваний, которые включают воспаление легких, такое, как астма. Воспаление легких, которое происходит при астме, связано с активацией и инфильтрацией в легкие эозинофилов, моноцитов и лимфоцитов, которые активированы определенным событием или веществом, вызвающим астму.
Кроме того, соединения по изобретению также ингибируют связывание VCAM-1 и MadCAM с клеточным рецептором 4
7, известным также как LPAM, который экспрессируется лимфоцитами, эозинофилах и Т-клетках. В то время как точная роль связывания
4
7 с различными лигандами при воспалительных состояниях, таких, как астма, полностью не установлена, соединения по изобретению, которые ингибируют связывание как с рецептором
4
1, так и с рецептором
4
7, наиболее эффективны на модели астмы у животных. Кроме того, исследования с моноклональными антителами к
4
7 показывают, что соединения, ингибирующие связывание
4
7 с MadCAM или VCAM, могут использоваться для лечения воспаления кишечника. Кроме того, они могут использоваться при лечении других заболеваний, когда такое связывание является причиной патологического нарушения или симптома.
Соединения по изобретению могут вводиться перорально, ректально или парентерально, например внутривенно, внутримышечно, подкожно, интратекально или чрескожно, или сублингвально (под язык), в форме офтальмологических препаратов, или в форме аэрозолей при воспалении легких. Примерами лекарственных форм являются капсулы, таблетки, суспензии или растворы для перорального применения, суппозитории, растворы для инъекций, глазные капли, мази или спреи.
Предпочтительными формами применения являются внутривенное, внутримышечное, пероральное введение или ингаляция. Дозировки для введения эффективного количества соединений по изобретению зависят от природы специфически активного ингредиента, возраста и потребностей пациента, и от способа введения. Дозировки могут быть определены любым общепринятым способом, например клиническим испытанием допустимых доз. Таким образом, изобретение включает способ лечения пациентов, страдающих от заболевания, при котором связывание VCAM-1 или фибронектина с клетками, экспрессирующими VLA-4, является причиной патологических симптомов или нарушений. Причем способ включает введение пациенту соединения по изобретению в количестве, достаточном для ингибирования связывания VCAM-1 или фибронектина с клетками, экспрессирующими VLA-4, таким образом, чтобы ослабить вышеупомянутые симптомы и нарушения. В общем виде предпочтительны дозы, составляющие приблизительно 0,1-100 мг/кг массы тела в сутки, более предпочтительны дозы 1-25 мг/кг массы тела в сутки и прежде всего предпочтительны дозы 1-10 мг/кг массы тела в сутки.
Другим аспектом изобретения являются лекарственные средства или фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически эффективное количество соединения по изобретению, включая его фармацевтически приемлемые соли и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение также относится к способу получения фармацевтической композиции, который включает переработку соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемого носителя в галеновую готовую форму. Такие композиции могут быть приготовлены любым общепринятым способом. Таблетки или гранулы могут содержать ряд связующих агентов, наполнителей, носителей или разбавителей. Например, жидкие композиции могут быть приготовлены в форме стерильного смешивающегося с водой раствора. Кроме активного ингредиента капсулы могут содержать наполнитель или загуститель. Кроме того, могут также присутствовать ароматизаторы, а также вещества, обычно используемые как консервирующие, стабилизирующие, удерживающие влагу и эмульгирующие агенты, а также соли для регуляции осмотического давления, буферные вещества и прочие добавки.
Вышеупомянутые носители и разбавители могут включать любые общепринятые фармацевтически приемлемые органические или неорганические вещества, например воду, желатин, лактозу, крахмал, стеарат магния, тальк, аравийскую камедь, полиалкиленгликоли и т.п.
Стандартная лекарственная форма для перорального применения, такая, как таблетки и капсулы, предпочтительно содержит от 25 до 1000 мг соединения по изобретению.
В общем виде соединения по настоящему изобретению могут быть получены из соответствующих производных фенилаланина по реакции с 3-галоген-2-пиридоном, катализируемой палладием.
Как показано на схеме 1, производное 4-иод- или 4-бромфенилаланина, такое, как соединение 1, превращается в производное фенилаланина 2 с защитными группами, в котором R7' означает водород, хлор, (низш.)алкил или (низш.)алкокси, Р1 означает обычную аминозащитную группу, такую, как Вос или карбобензилоксигруппу, а Р2 означает (низш.)алкил или замещенный (низш.)алкил, выбранный соответственно в качестве защитной группы, или фрагмент пролекарства. Группа P2 может быть введена обычными способами, известными специалистам в области пептидного синтеза. Порядок присоединения P1 и Р2 не имеет решающего значения и будет определяться конкретным выбором реагентов. Обзор использования и введения защитных групп содержится в книге Theodora W.Greene и Peter G.M.Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Wiley Interscience, New York (1991). В другом варианте соединение формулы 1 может быть превращено в соединение формулы 4, где R1' представляет собой компонент ацильной группы по изобретению. Удобным методом является сначала введение сложноэфирной группы Р2 с последующей конденсацией по свободной аминогруппе с использованием обычных конденсирующих агентов пептидной химии, например HBTU, в присутствии третичного амина, такого, как диэтилизопропиламин. Как обычно, конкретный выбор реагентов может диктовать изменение очередности введения R1 ' и Р2 . Превращение соединений формулы 2 или 4 в производные 3 или 5, где М представляет собой замещенный атом олова или бора, можно осуществить при взаимодействии с соответствующими реагентами, например гексаметилдиоловом, гексабутилдиоловом или тетраалкоксидибором в присутствии источника палладия (0). Методология описана и снабжена библиографией в книге F.Diederich и P.J.Stang, ed. Metal Catalyzed Cross Coupling Reactions, Wiley-VCH, Weinheim, Germany (1998).
Замещенные пиридоны формулы 6, где R3 ', R4 ' и R5 ' означают водород, (низш.)алкил, перфтор(низш.)алкил, галоген, арил, гидрокси или (низш.)алкокси, являются коммерческими препаратами или могут быть получены следующими методами, описанными в литературе (например, некоторые из этих известных методов обсуждаются в работах: P.Wirth и др., Герм. патент 2817293 от 12 августа 1979, Masaru Hojo и др., Chem. Let., 499-502 (1976), Robert W.Lang и др., Helvetica Chimica Acta, 71, 596-601 (1988)). Соединения формулы 7, где R2 ' означает (низш.)алкил или арил(низш.)алкил, получают алкилированием соединений формулы 6 при взаимодействии с алкилирующими агентами, такими, как иодметан, бензилбромид, в присутствии основания, такого, как карбонат калия, или необязательно межфазного катализатора. Для менее реакционноспособоных алкилирующих агентов может оказаться необходимым использование более сильного основания, такого, как гидроксид щелочного металла, и нагревания реакционной смеси. Соединения формулы 7, указанной ниже, могут быть галогенированы по положению 3 взаимодействием с обычными галогенирующими реагентами, такими, как бром, N-иодсукцинимид или N-бромсукцинимид в приемлемом растворителе, таком, как ледяная уксусная кислота или водная уксусная кислота, с получением галогенпиридонов формулы 8, где Х означает Br или I, R2 ' означает водород, (низш.)алкил, замещенный (низш.)алкил или арил(низш.)алкил, R3' и R5' независимо означают водород, (низш.)алкил или перфтор(низш.)алкил. Взаимодействие с избытком галогенирующего агента приводит к соединениям формулы 8, где R4' означает галоген. В случае соединений формулы 8, где R2' означает арил, синтез целесообразно начинать с N-арилпиридонов, которые являются известными соединениями, или вводить арильный остаток, например, с использованием реакции конденсации Ульмана, как описано в статье Masakatusu и др., Chem. Pharm. Bull., 45, 719 (1997).
Как показано на схеме 3, соединение формулы 8 может использоваться в реакции конденсации с производным фенилаланина формулы 3 или 5, катализируемой палладием. Например, если М означает замещенное олово, взаимодействие смеси 8 и фенилаланина формулы 3 или 5 с источником палладия (0), таким, как дихлорид тетракис(трифенилфосфин)палладия или дихлорид бис(трифенилфосфин)палладия, в присутствии инертного растворителя, такого, как ДМФ, при температуре от комнатной температуры до 100°С, приводит к образованию соединения формулы 9 или 10. Из соединений формулы 9 при удалении защитной группы Р 1 можно получить соединения формулы 10. Реакцию проводят общепринятым способом в зависимости от группы Р1. Например, если Р1 означает группу Вос, ее удаляют обработкой сильной кислотой, такой, как трифторуксусная кислота, необязательно в присутствии растворителя, такого, как хлористый метилен, и соединения-акцептора. Затем полученный свободный амин может быть ацилирован кислотой формулы R1'CO 2H с использованием обычных методов пептидной конденсации. Например, при взаимодействии с HBTU в присутствии третичного амина, такого, как диэтилизопропиламин, в апротонном растворителе, таком, как ДМФ, получают соединения формулы 10.
Если требуемым конечным продуктом является свободная кислота 11, сложноэфирную группу Р2 удаляют обычными методами. Например, если Р2 означает (низш.)алкил, например метил, то ее удаляют обработкой гидроксидом щелочного металла, например гидроксидом лития, в приемлемом растворителе, например водном ТГФ, необязательно содержащем метанол для повышения растворимости. Если Р2 означает бензил или замещенную бензильную группу, то ее удаляют каталитическим гидрированием в присутствии металла платиновой группы, например палладия на угле.
В альтернативном варианте, показанием на схеме 4, из соединения формулы 8, где Х означает бром или иод, можно получить соединения формулы 12, где М' представляет собой замещенный атом олова, бора или цинка. В случае соединений олова или бора, когда М' является замещенным атомом олова или бора, реакцию проводят с использованием соответствующих реагентов, например
гексаметилдиолова, гексабутилдиолова или тетраалкоксидибора, в присутствии источника палладия (0). Для получения производного цинка формулы 12, где М' означает Zn(галоген), реакцию проводят взаимодействием соединения формулы 8, где Х означает I, с источником активированного цинка в виде металла в приемлемом инертном растворителе, например диметилацетамиде, при температуре от комнатной температуры до 100°С до полного завершения реакции с получением соединения формулы 12, где М' означает Zn(галоген). Эти соединения формулы 12 могут быть введены в реакцию производным фенилаланина, замещенным в положении 4, формулы 4', где X' означает иод, бром или трифторметилсульфонилокси, в присутствии источника палладия (0) с получением соединения формулы 10'. Если сложноэфирная группа Р2 не должна входить в состав целевого соединения, ее можно удалить с использованием методов гидролиза эфиров, приемлемых для конкретной Р2. Например, если Р2 означает (низш.)алкил, например метил, такая группа может быть удалена стандартным гидролизом в основной среде, например, с использованием гидроксида щелочного металла, например, гидроксида лития. В варианте этого метода может оказаться необходимым проводить реакцию конденсации и присоединения защитной группы на более поздних стадиях синтеза. В этом случае соединение формулы 2', где Р1' означает (низш.)алкоксикарбонил или бензилоксикарбонил, а X' имеет значения, указанные выше, может быть конденсировано с пиридоном формулы 12 с получением соединения формулы 9', которое в свою очередь может быть превращено в соединение по изобретению с использованием общих методов, описанных выше на схеме 3.
Как показано на схеме 5, другим подходом к соединениям по изобретению, который применим в отношении соединений, у которых R7' не означает водород, является получение альдегида формулы 14. Для этого соединение формулы 12 вводят в реакцию с соединением формулы 13, в котором R7' означает (низш.)алкил или (низш.)алкокси, Х'' означает иод, бром, остаток трифторметилсульфонилокси, a R8 означает защищенный спирт или альдегид. Пригодные защитные группы для спиртов включают силильные и бензильные эфиры. При необходимости альдегиды могут быть защищены в виде ацеталей. Соединение формулы 12 может быть превращено в альдегид формулы 15 по обычной последовательности реакций, которая в случае, если R8 означает спирт, включает удаление защитной группы и, если необходимо, последующее окисление. Для избирательного окисления первичных бензиловых спиртов в альдегиды могут быть использованы любые общепринятые реагенты, например активированный диоксид марганца в инертном растворителе. В случае, если R8 означает защищенный альдегид, получение альдегида формулы 15 можно проводить удалением соответствующей защитной группы, например гидролизом ацеталя разбавленной кислотой. Реакцию соединения 15 с получением дегидроаминокислоты формулы 16 проводят взаимодействием с реагентом Виттига формулы 17, в котором Р1' означает (низш.)алкоксикарбонил или бензилоксикарбонил, а Р2 имеет значения, указанные выше. Например, взаимодействие соединения 15 с триметиловым эфиром (±)-N-(бензилоксикарбонил)--фосфоноглицина в присутствии приемлемого основания, например тетраметилгуанидина, приводит непосредственно к образованию дегидроаминокислоты формулы 16, где Р2 = метил, a P1' = бензилоксикарбонил. Энантиоселективное восстановление соединения 16 с получением L-аминокислоты 18 может быть проведено с использованием ряда приемлемых для этой цели восстанавливающих агентов, например описанного недавно родиевого реагента этил-DuPHOS (см. статью Burk M.J., Feaster J.E., Nugent W.A., Harlow R.L., J. Am. Chem. Soc., 115, 10125 (1993)), в условиях, подробно описанных в литературе. Последующее превращение соединения 18 в соединения по изобретению проводят с использованием общих методов, описанных выше. В другом варианте для получения соединений формулы 4 или 4', где R 7' не означает водород, могут быть использованы общие методы, показанные на схеме 5. Затем эти соединения формулы 4 или 4' могут быть использованы для получения соединений по изобретению, показанных на схемах 1-4.
В еще одном варианте N-ацильную группу, R1' в формуле 11, получают из бензойной кислоты, замещенной в положении 2. Соответствующие замещенные в положении 2 бензойные кислоты являются коммерческими препаратами или могут быть получены общепринятым способом. Например, орто-замещенные арилиодиды или трифлаты могут быть карбонилированы в присутствии монооксида углерода и соответствующего палладиевого катализатора. Получение промежуточных иодида или трифлата зависит от конкретного необходимого замещения, и такие соединения могут быть получены прямым иодированием или диазотированием анилина с последующим взаимодействием с источником иода, например с иодидом калия. Трифлаты могут быть получены из соответствующих фенолов общепринятыми методами, например, такими, как взаимодействие с ангидридом трифторметансульфоновой кислоты в присутствии основания, такого, как триэтиламин или диизопропилэтиламин, в инертном растворителе. Как показано на схеме 6, еще один способ получения орто-замещенной бензойной кислоты включает взаимодействие производного 2-метоксифенилоксазолина, такого, как соединение 19, где Z1 и Z2 означают водород, алкил, хлор, перфтор(низш.)алкил, (низш.)алкокси, с алкильным реактивом Гриньяра с последующим гидролизом оксазолинового цикла по известному методу, описанному в статье Meyers A.I., Gabel R., Mihelick E.D., J. Org. Chem., 43, 1372-1379 (1978), с получением кислоты формулы 20. Удобными предшественниками соответствующих бензойных кислот являются также 2- или 2,6-дизамещенные бензонитрилы. В случае нитрилов с заторможенной конфигурацией, например 2-хлор-6-метилбензонитрила, обычный гидролиз в кислотных или основных условиях затруднен и хорошие результаты дает восстановление в соответствующий бензальдегид с использованием DIBAL с последующим окислением окислителями на основе хрома. Другие способы представлены в патенте Chen и др., WO 99/10312.
Что касается схемы реакций 7, циклические кислоты формулы 23 являются известными соединениями или могут быть получены с использованием стандартных методов. Для получения замещенных алкил- или циклоалкилкарбоновых кислот могут использоваться реакции алкилирования с использованием щелочного металла и дианиона кислоты или моноаниона соответствующего сложного эфира. Например, эфир циклоалкилкарбоновой кислоты формулы 21 может быть обработан сильным основанием, например диизопропиламидом лития, в инертном растворителе, например ТГФ, с последующим присоединением группы R41-Lv, где R41 означает требуемую боковую цепь, такую, как замещенный бензил, (низш.)алкил, (низш.)алкоксиалкил, азидо(низш.)алкил и т.п., a Lv означает уходящую группу, такую, как бром, иод, мезилат или подобную группу, принимающую участие в реакциях алкилирования енолята сложного эфира. Сложный эфир 22 может быть гидролизован в кислоту 23 с использованим гидроксида щелочного металла в приемлемом растворителе, например водном спирте. В зависимости от природы группы R41 и целевого соединения соединение 23 может быть конденсировано с амином, таким, как соединение 1, и непосредственно превращено в целевое соединение, или группа R41 может быть подвергнута последующей обработке на соответствующей стадии синтеза. Например, если R41 означает остаток азидо(низш.)алкил, азид может быть восстановлен с использованием, например, триалкилфосфинового реагента с последующим введением в полученный амин функциональных групп с использованием алкилирования, ацилирования, сульфонилирования и подобных методов, известных специалистам в данной области техники. Если R41 включает уходящую группу, например концевой атом брома, такая группа может быть замещена соответствующим нуклеофилом, например метилмеркаптидом натрия, с образованием в данном случае тиоэфира, который может быть требуемым продуктом, или этот тиоэфир, в свою очередь, может быть превращен, например, окислением, в сульфоксид или сульфон в известных условиях реакции. Прочие нуклеофилы, которые могут использоваться для получения промежуточных соединений и приводить к соединениям по изобретению, включают цианид натрия, метоксид натрия, азид натрия, морфолин и др. Если R41 включает группу кеталя, эта группа может быть гидролизована на соответствующей стадии синтеза с получением кетогруппы. Эта группа, в свою очередь, может быть превращена, например, восстановлением в спирт или в производное, например, такое, как оксим.
Примеры применения этих методов в синтезе соединений формулы 23 приводятся в патенте Chen и др., WO 99/10313.
В общем случае, орто-замещенные ароматические кислоты, необходимые для синтеза соединений, где R1 означает Y-1, могут быть получены, как описано в патенте Chen и др., WO 99/10312.
Для синтеза 2-хлор-6-алкилбензойных кислот формулы 28, где R43 означает (низш.)алкил или циклоалкил, более приемлемым является метод, описанный для схемы 8. Таким образом, альдегид формулы 24, представляющий собой коммерческий препарат, превращается в имин 25, где R42 означает (низш.)алкил, предпочтительно бутил, при взаимодействии с бутиламином в инертном гидрофобном органическом растворителе, например гептане. Полученное соединение формулы 25 вводят в реакцию с избытком реактива Гриньяра 26 в инертном растворителе, например ТГФ, с последующей обработкой на заключительной стадии кислотой с получением альдегида формулы 27. Окисление соединения 27 в кислоту формулы 28 может быть проведено обычными способами, например обработкой раствора соединения 27 в приемлемом растворителе, таком, как водный ацетонитрил, хлоритом натрия и 30%-ным пероксидом водорода при комнатной или пониженной температуре.
Может возникнуть необходимость готовить пролекарства в виде сложных эфиров соединений по настоящему изобретению, причем сложноэфирную группу окажется удобным вводить при завершении синтеза. Для этой цели может быть использован ряд общепринятых методов получения сложных эфиров карбоновых кислот. Типичные методы включают присоединение спирта к карбоновой кислоте в присутствии кислоты, например хлористоводородной кислоты, по методике, известной как этерификация по Фишеру. В другом варианте может использоваться конденсация карбоновой кислоты со спиртом, опосредованная диимидом, с необязательным использованием промотора, такого, как 4,4-диметиламинопиридин. Типичным диимидом является дициклогексилкарбодиимид. Другим альтернативным методом является взаимодействие карбоновой кислоты с реакционноспособным алкилгалогенидом, например алкилиодидом или ацилоксиметилхлоридом, в присутствии основания, например бикарбоната натрия, в инертном растворителе, например ДМФ. Конкрентный выбор метода зависит от данной комбинации карбоновой кислоты и требуемого остатка сложного эфира и является очевидным для специалиста в данной области. Сложноэфирные группы, которые могут входить в состав пролекарства, могут быть введены на любой удобной стадии синтеза. Например, группа Р2 в формуле 1 может представлять собой требуемый сложный эфир и будет устойчива в конечном продукте.
ПРИМЕРЫ
Нижеописанные примеры приведены с целью иллюстрации изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.
Общие методы. Температуры плавления определены на приборе Thomas-Hoover и приведены без поправки на показания термометра. Оптическое вращение (угол вращения плоскости поляризации) определяли на поляриметре Perkin-Elmer (модель 241). 1 Н-ЯМР-спектры снимали на спектрометрах Varian XL-200, Mecury-300 или Unityplus 400 MHz с использованием в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилана (ТМС). Масс-спектры с ионизацией электронным ударом (EI, 70 eV) и ионизацией быстрыми атомами (FAB) снимали на масс-спектрометрах VG Autospec или VG 70E-HF. Для колоночной хроматографии использовали силикагель марки Mallinkrodt SiliCar, фракция 230-400 меш для экспресс-хроматографии; хроматографию проводили под давлением азота 0-5 фунт/кв. дюйм. Тонкослойную хроматографию проводили на стеклянных пластинках, покрытых силикагелем фирмы Е.Merck (E.Merck # 1.05719), и просматривали в боксе в УФ-свете при 254 нм, пластинки проявляли парами иода или раствором фосфорномолибденовой кислоты (ФМК) в водном этаноле, или после обработки Cl2 опрыскивали реагентом, содержащим 4,4'-тетраметилдиаминодифенилметан, приготовленным, как описано в работе E.Von Arx. M.Faupel, M.Brugger, J. Chromatography, 120, 224-228 (1976).
Обращенно-фазовую хроматографию высокого давления (ОФ-ЖХВР) проводили на хроматографе Rainin HPLC на колонке 41,4×300 мм, заполненной сорбентом Dynamax С-18 с диаметром частиц 8 мкм, при скорости элюции 49 мл/мин в градиенте ацетонитрил/вода (каждый из растворителей содержал 0,75% ТФУК), обычно от 5 до 95% ацетонитрила, время элюции составляло 35-40 мин. Условия ЖХВР обычно приводятся в формате 5-95-35-214, что означает линейный градиент от 5% до 95% ацетонитрила в воде, продожительность элюции 35 мин, регистрация элюата на УФ-детекторе при длине волны 214 нм.
Хлористый метилен (дихлорметан), 2-пропанол, ДМФ, ТГФ, толуол, гексан, эфир и метанол фирмы Fisher имели квалификацию «reagent grade» и использовались, если не указано иное, без дополнительной очистки, ацетонитрил фирмы Fisher или Baker имел квалификацию «hplc grade» (для ЖХВР).
В примерах использовались следующие сокращения:
| ТГФ | тетрагидрофуран, |
| ДМФ | N,N-диметилформамид, |
| ДМА | N,N-диметилацетамид, |
| НОВТ | 1-гидроксибензотриазол, |
| ВОР | гексафторфосфат [(бензотриазол-1- |
| ил)окси]трис(диметиламино)фосфония, | |
| HATU | гексафторфосфат |
| O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония, | |
| HBTU | гексафторфосфат O-бензотриазол-N,N,N',N'- |
| тетраметилурония, | |
| DIPEA | диизопропилэтиламин, |
| DMAP | 4-(N,N-диметиламино)пиридин, |
| DPPA | дифенилфосфорилазид, |
| DPPP | 1,3-бис(дифенилфосфино)пропан, |
| DBU | 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен, |
| NaH | гидрид натрия, |
| солевой раствор | насыщенный водный растор хлорида натрия, |
| ТСХ | тонкослойная хроматография, |
| LDA | диизопропиламид лития, |
| ВОР-Cl | бис(2-оксо-3-оксазолидинил)фосфинхлорид, |
| NMP | N-метилпирролидинон, |
| реактив Лавессона (Lawesson's reagent) | [2,4-бис(4-метоксифенил) |
| -1,3-дитиа-2,4-дифосфетан-2,4-дисульфид], | |
| NIS | N-иодсукцинимид. |
Хроматография на силикагеле на колонках Biotage относится к использованию системы для экспресс-хроматографии, поставляемой отделом Biotage фирмы Dyax Corporation, причем в работе использовались предварительно заполненные колонки 40g (40s колонки), 90g (40m колонки) или 800g (75m колонки). Элюцию проводят смесью гексан/этилацетат под давлением азота 10-15 фунт/кв.дюйм.
Пример 1.
Метиловый эфир N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[(трибутил)станнил]-L-фенилаланина
Раствор метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-иод-L-фенилаланина (5,3 г, 13 ммолей) и гексабутилдиолова (27,5 мл, 54 ммоля) в толуоле (50 мл) деоксигенировали, поочередно (3х) замораживая смесь в вакууме на бане с жидким азотом и оттаивая в атмосфере аргона. Затем добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (280 мг, 0,22 ммоля) и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 45 мин до изменения окраски с желтой на черную. После того как данные ТСХ (этилацетат/гексан, 1:6) указали на присутствие некоторого количества исходного соединения иода, добавляли дополнительную порцию (140 мг, 0,11 ммоля) катализатора и кипячение с обратным холодильником продолжали в течение 1 ч. Затем смесь охлаждали и концентрировали. Остаток переносили в гексан (200 мл) и триэтиламин (30 мл), перемешивали в течение 30 мин и фильтровали. Фильтрат концентрировали и хроматографировали на колонке с сухим силикагелем (150 г) при элюировании гексаном, а затем этилацетатом/гексаном (1:6), при этом получали метиловый эфир N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[(трибутил)станнил]-L-фенилаланина (5,7 г, 77%) в виде прозрачного масла. МС-НР (+)(LSI) (C 27H47NO4Sn): m/z 1081 (2М-С4 Н9), 570 (М+Н).
Пример 2.
2-Амино-3-бром-5-хлорпиридин
Суспензию 2-амино-5-хлорпиридина (5,14 г, 40 ммолей) и безводного ацетата натрия (3,29 г, 40 ммолей) в уксусной кислоте (25 мл) перемешивали на механической мешалке, нагревали на бане до температуры 45°С и в течение 1 ч добавляли раствор брома (2,1 мл, 40 ммолей) в уксусной кислоте (2 мл). Полученную смесь оранжевого цвета охлаждали до температуры 15°С и фильтровали. Твердое вещество переносили в 400 мл воды, суспензию подщелачивали добавлением 1н. NaOH и экстрагировали этилацетатом (5×100 мл). Объединенные экстракты промывали 10% NaHSO3 (1×100 мл) и сушили над MgSO4. После концентрирования получали 2-амино-3-бром-5-хлорпиридин (4 г, 48%), tпл. 82-84°С.
Пример 3.
3-Бром-5-хлор-1H-2-пиридон
Раствор 2-амино-3-бром-5-хлорпиридина (4,0 г, 19,3 ммоля) в воде (30 мл) и конц. HCl (5,2 мл) охлаждали на ледяной бане до 0°С и в течение 10 мин добавляли раствор нитрита натрия (1,33 г, 19,3 ммоля) в воде (12 мл). Затем смесь перемешивали в течение дополнительных 10 мин и инкубировали при комнатной температуре в течение 48 ч. Смесь фильтровали, твердое вещество промывали водой, CCl4 и высушивали в вакууме при 50°С в течение 3 ч, при этом получали 3-бром-5-хлор-1Н-2-пиридон (2,77 г, 69%), tпл.173,5-175°С.
Пример 4.
3-Бром-5-хлор-1-метил-2-пиридон
Смесь 3-бром-5-хлор-1Н-2-пиридона (930 мг, 4,46 ммоля), карбоната калия (1,25 г, 9,1 ммоля) и иодметана (2,8 мл, 45 ммолей) в 10 мл DME кипятили с обратным холодильником в течение 18 ч. Затем смесь фильтровали в горячем виде и концентрировали. Полученный остаток перекристаллизовывали из этилацетата, при этом получали 3-бром-5-хлор-1-метил-2-пиридон (740 мг, 74%), tпл. 162-163°С. МС-ВР (С6Н5BrClNO)): найд. 220,9249; рассч. 220,9243 (М+Н).
Пример 5.
Метиловый эфир 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-L-фенилаланина
Раствор 3-бром-5-хлор-1-метил-2-пиридона (660 мг, 2,97 ммоля) и метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[(трибутил)станнил]-L-фенилаланина (1,7 г, 2,99 ммоля) в ДМФ (30 мл) деоксигенировали, поочередно (3х) замораживая смесь в вакууме на бане с жидким азотом и оттаивая в атмосфере аргона. Затем добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (140 мг, 0,20 ммоля) и смесь нагревали при 90°С в течение 3 ч до приобретения темной окраски. После того как данные ТСХ показали, что реакция прошла не полностью, добавляли дополнительную порцию катализатора (140 мг) и продолжали кипячение в течение 4 ч. Затем смесь охлаждали, разбавляли дихлорметаном и фильтровали через слой целита. Фильтрат выпаривали досуха, остаток растворяли в эфире/этилацетате (1:1, 60 мл). Затем раствор промывали водой (3×10 мл), солевым раствором (1×10 мл) и сушили (MgSO 4). После концентрирования полученный остаток хроматографировали на колонке с силикагелем (150 г) при элюировании этилацетатом/гексаном (7:3), при этом получали метиловый эфир 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-L-фенилаланина (670 мг, 54%). МС-НР (ES): m/z 863 (2M+Na), 858 (2M+NH4 ), 443 (M+Na), 438 (M+NH4), 421(М+Н).
Пример 6.
Гидрохлорид метилового эфира 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
Раствор метилового эфира 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-L-фенилаланина (210 мг, 0,50 ммоля) в 4н. HCl в диоксане (10 мл) перемешивали в течение 1 ч и концентрировали, при этом получали гидрохлорид метилового эфира 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (140 мг) в виде порошка белого цвета. МС-НР (+)(LSI): m/z 641 (2М+Н), 321 (М+Н).
Пример 7.
Метиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
Раствор гидрохлорида метилового эфира 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (89,5 мг, 0,25 ммоля), 2-хлор-6-метилбензойной кислоты (47 мг, 0,28 ммоля), DIPEA (175 мкл, 1,0 ммоля) и HBTU (133 мг, 0,35 ммоля) в ДМФ (3 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Затем смесь концентрировали, остаток растворяли в этилацетате (15 мл), промывали 0,5н. HCl (1×5 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (1×5 мл), солевым раствором (1×5 мл) и сушили (MgSO4). Остаток, полученный после выпаривания растворителя, хроматографировали на колонке с силикагелем (25 г) при элюировании этилацетатом/гексаном (3:1), при этом получали метиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (54 мг). МС-НР (+)(LSI): m/z 962 (2M+NH4), 945 (2М+Н), 490 (M+NH4), 473 (М+Н (2 Cl)).
Пример 8.
N-[(2-Хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин
Раствор метилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (51 мг, 0,108 ммоля) в ТГФ (3 мл) смешивали с раствором моногидрата гидроксида лития (18 мг, 0,43 ммоля) в воде (1,0 мл). Для получения прозрачного раствора добавляли дополнительное количество ТГФ и реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч, после чего данные ТСХ (в этилацетате) указали на отсутствие в смеси исходного материала. Затем добавляли несколько капель уксусной кислоты, ракционную смесь наносили на колонку (4×30 см) с С-18 для обращенно-фазной ЖХВР и элюировали в линейном градиенте ацетонитрила в воде (от 5% до 95%) в течение 35 мин. Фракцию, содержащую целевой продукт, высушивали лиофильно, при этом получали N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин (40 мг, 82%) в виде твердого вещества белого цвета, МС-НР (ES): m/z положительно заряженный ион, 481(M+Na), 459(М+Н (2 Cl)); отрицательно заряженный ион, 457 (М-Н (2 Cl)).
Пример 9.
Метиловый эфир 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланина
Раствор гидрохлорида метилового эфира 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (47,4 мг, 0,25 ммоля), 1-(2-метоксиэтил)циклопентанкарбоновой кислоты (47 мг, 0,28 ммоля), DIEA (175 мкл, 1,0 ммоль) и HBTU (133 мг, 0,35 ммоля) в ДМФ (3 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Затем смесь концентрировали, остаток растворяли в этилацетате (15 мл), промывали 0,5н. HCl (1×5 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (1×5 мл), солевым раствором (1×5 мл) и сушили (MgSO4). Остаток, полученный после выпаривания растворителя, хроматографировали на колонке с силикагелем (25 г) при элюировании этилацетатом, при этом получали метиловый эфир 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланина (70,5 мг, 59%). МС-НР (ES): m/z положительно заряженный ион, 943 (2M+Na), 483 (M+Na), 478 (M+NH4), 461 (М+Н); отрицательно заряженный ион, 919 (2М-Н), 521, 459 (М-Н).
Пример 10.
4-(5-Хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланин
Раствор метилового эфира 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланина (69 мг, 0,145 ммоля) в ТГФ (3 мл) смешивали с раствором моногидрата гидроксида лития (24,3 мг, 0,58 ммоля) в воде (1,0 мл). Для полного растворения к смеси добавляли достаточное количество ТГФ и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавляли несколько капель уксусной кислоты, реакционную смесь наносили на колонку (4×30 см) с С-18 для обращенно-фазной ЖХВР и элюировали в линейном градиенте ацетонитрила в воде (от 5% до 95%) в течение 35 мин. Фракцию, содержащую целевой продукт, высушивали лиофильно, при этом получали 4-(5-хлор-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланин (48 мг, 72%) в виде твердого вещества белого цвета. МС-НР (ES): m/z положительно заряженный ион, 943 (2M+Na), 483 (M+Na), 478 (M+NH4), 461 (М+Н); отрицательно заряженный ион, 919 (2М-Н), 521, 459 (М-Н).
Пример 11.
1-Бензил-3-бром-5-хлор-2-пиридон
Смесь 3-бром-5-хлор-1Н-2-пиридона (950 мг, 4,56 ммоля), свежеизмельченного карбоната калия (1,26 г, 9,1 ммоля) и хлорида тетрабутиламмония (100 мг) перемешивали в отсутствие растворителя в течение 30 мин и добавляли бензилбромид (0,56 мл, 4,7 ммоля). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 72 ч, затем разбавляли этилацетатом и фильтровали, промывая твердое вещество этилацетатом. Фильтрат выпаривали досуха, остаток растирали в нескольких порциях гексана и хроматографировали на колонке с силикагелем (90 г) при элюировании гексаном/этилацетатом (3:1), а затем 100%-ным этилацетатом, в результате получали 1-бензил-3-бром-5-хлор-2-пиридон (423 мг, 31%), tпл.108-110°С. МС-НР (+)(LSI): m/z 595 (2М+Н, 2 Cl, 2 Br), 298 (М+Н, 1 Cl, 1 Br).
Пример 12
Метиловый эфир 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-L-фенилаланина
Раствор 1-бензил-3-бром-5-хлор-2-пиридона (296 мг, 0,98 ммоля) и метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[(трибутил)станнил]-L-фенилаланина (560 мг, 0,99 ммоля) в ДМФ (15 мл) деоксигенировали, поочередно (3х) замораживая смесь в вакууме на бане с жидким азотом и оттаивая в атмосфере аргона. Затем добавляли дихлорид бис(трифенилфосфин)палладия (80 мг, 0,11 ммоля) и реакционную смесь нагревали при 90°С в течение 4 ч до приобретения темной окраски, после чего дополнительно добавляли 60 мг катализатора и нагревание продолжали в течение 2 ч. Затем смесь охлаждали, разбавляли дихлорметаном и фильтровали через слой целита. Фильтрат упаривали досуха, остаток хроматографировали на колонке с сухим силикагелем (150 г) при элюировании этилацетатом/гексаном (1:2), при этом получали метиловый эфир 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-L-фенилаланина (255 мг, 52%). МС-НР (ES): m/z 1015 (2M+Na) (4 Cl), 519 (M+Na), 514 (M+NH4).
Пример 13
Гидрохлорид метилового эфира 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
Раствор метилового эфира 1-бензил-4-(5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-L-фенилаланина (248 мг, 0,50 ммоля) в 4н. HCl в диоксане (10 мл) перемешивали в течение 1 ч и концентрировали. Остаток растирали с эфиром (15 мл) и фильтровали, при этом получали гидрохлорид метилового эфира 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (202 мг, 94%) в виде порошка белого цвета. МС-НР (ES): m/z 1015 (2M+Na, 4 Cl), 519 (M+Na), 514 (M+NH4), 497 (М+Н). МС-ВР: найд. 496,1774, рассч. 496,1765 (М+Н).
Пример 14.
Метиловый эфир 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-L-фенилаланина
Раствор гидрохлорида метилового эфира 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (100 мг, 0,23 ммоля), 2-хлор-6-метилбензойной кислоты (47 мг, 0,28 ммоля), DIEA (200 мкл, 1,2 ммоля) и HBTU (133 мг, 0,35 ммоля) в ДМФ (2 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Смесь концентрировали, остаток растворяли в этилацетате (15 мл), промывали 0,5н. HCl (1×5 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (1×5 мл), солевым раствором (1×5 мл) и сушили (MgSO4). Остаток, полученный после выпаривания, хроматографировали на колонке с силикагелем (25 г) при элюировании этилацетатом/гексаном (45:55), при этом получали метиловый эфир 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-L-фенилаланина (74 мг, 58%). Найд. 397,1313, рассч. 397,1320 (М+Н).
Пример 15.
4-(1-Бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(-хлор-6-метилфенил)карбонил]-L-фенилаланин
Раствор метилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (72 мг, 0,13 ммоля) в ТГФ (3 мл) смешивали с раствором моногидрата гидроксида лития (22 мг, 0,52 ммоля) в воде (1,0 мл). Для получения прозрачного раствора к смеси добавляли дополнительное количество ТГФ и перемешивали в течение 1,5 ч, после чего данные ТСХ (в этилацетате) указали на отсутствие в смеси исходного материала. Затем добавляли несколько капель уксусной кислоты, реакционную смесь наносили на колонку (4×30 см) с С-18 для обращенно-фазовой ЖХВР и элюировали в линейном градиенте ацетонитрила в воде (от 5% до 95%) в течение 35 мин. Фракцию, содержащую целевой продукт, высушивали лиофильно, при этом получали 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-L-фенилаланин (50 мг, 71%) в виде твердого вещества белого цвета. МС-НР (ES): m/z отрицательно заряженный ион, 533 (М-Н (2 Cl)); положительно заряженный ион, 557(M+Na), 552 (M+NH4), 535 (М+Н (2 Cl)). MC-ВР: найд. 535, 1190, рассч. 535,1191 (М+Н).
Пример 16.
Метиловый эфир 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланина
Раствор гидрохлорида метилового эфира 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (100 мг, 0,25 ммоля), 1-(2-метоксиэтил)циклопентанкарбоновой кислоты (47 мг, 0,28 ммоля), DIEA (200 мкл, 1,2 ммоля) и HBTU (133 мг, 0,35 ммоля) в ДМФ (2 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Смесь концентрировали, остаток растворяли в этилацетате (15 мл), промывали 0,5н. HCl (1×5 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (1×5 мл), солевым раствором (1×5 мл) и сушили (MgSO4). Остаток, полученный после выпаривания, хроматографировали на колонке с силикагелем (25 г) при элюировании этилацетатом/гексаном (60:40), при этом получали метиловый эфир 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланина (80 мг, 63%). МС-НР (ES): m/z 1123 (2M+Na), 1118 (2M+NH4 ), 573 (M+Na), 568 (M+NH4), 551 (М+Н (1 Cl)). МС-НР: найд. 551,2297, рассч. 551, 2313 (М+Н).
Пример 17.
4-(1-Бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланин
Раствор метилового эфира 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланина (78 мг, 0,142 ммоля) в ТГФ (3 мл) смешивали с раствором моногидрата гидроксида лития (24 мг, 0,57 ммоля) в воде (1,0 мл). Для полного растворения к смеси добавляли достаточное количество ТГФ и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавляли несколько капель уксусной кислоты, реакционную смесь наносили на колонку (4×30 см) с С-18 для обращенно-фазовой ЖХВР и элюировали в градиенте ацетонитрила в воде (от 5% до 95%) в течение 35 мин. Фракцию, содержащую целевой продукт, высушивали лиофильно, при этом получали 4-(1-бензил-5-хлор-2-оксо-3-пиридинил)-N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-L-фенилаланин (45 мг, 60%) в виде твердого вещества белого цвета. МС-НР (ES): m/z положительно заряженный ион, 559 (M+Na), 554 (M+NH4 ), 537 (М+Н (1 Cl)); отрицательно заряженный ион, 535 (М-Н (1 Cl)), МС-ВР: найд. 537, 2151, рассч. 537,2156 (М+Н).
Пример 18.
3-Бром-1H-2-пиридон
К раствору 1H-2-пиридона (1,9 г, 20 ммолей) в 1 М водном растворе бромида калия (20 мл) в течение 5 мин добавляли раствор брома (3,2 г, 20 ммолей) в 1 М водном растворе бромида калия (40 мл). Реакционную смесь инкубировали в течение ночи, осадок (1,4 г) отделяли и перекристаллизовывали из ацетонитрила, при этом получали 0,78 г 3-бром-1H-2-пиридона.
Пример 19.
3-Бром-1-метил-2-пиридон
Смесь 3-бром-1H-2-пиридона (740 мг, 4,25 ммоля), карбоната калия (1,18 г, 8,5 ммоля) и иодметана (2,65 мл, 42,5 ммоля) в ДМФ (10 мл) кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Смесь фильтровали, промывали этилацетатом и фильтрат упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на колонке с сухим силикагелем (27 г) при элюировании этилацетатом, при этом получали 3-бром-1-метил-2-пиридон (0,63 г, 79%). МС-НР (ES): положительно заряженный ион 188 (М+Н).
Пример 20.
3-Бром-1-метил-2-пиридон и 3,5-дибром-1-метил-2-пиридон
Раствор 1-метил-2-пиридона (2,73 г, 25 ммолей), брома (1,4 мл, 27 ммолей) в ледяной уксусной кислоте (150 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч. Смесь концентрировали, остаток переносили в воду (100 мл), подщелачивали (с контролем по лакмусовой бумаге) 10н. гидроксидом натрия и экстрагировали дихлорметаном (3×50 мл). Объединенные экстракты промывали солевым раствором (30 мл) и сушили (MgSO4). Затем фильтровали и выпаривали растворитель, остаток (4,7 г) очищали хроматографией на колонке с силикагелем (150 г) при элюировании этилацетатом/гексаном (1:6 и 1:1). Первым элюируется 3,5-дибром-1-метил-2-пиридон (2,0 г, 30%), МС-НР (ES): m/z 266 (М+Н (2 Br)). ЯМР(CDCl 3): 3,597 (s, 3Н), 7,426 (d, j=2,7, 1H), 7,791 (d, j=2,7, 1H). Вторым элюируется 3-бром-1-метил-2-пиридон (1,39 г, 30%). MC-HP (ES): m/z положительно заряженный ион, 251 (M+Na+CH3CN), 188 (М+Н).
Пример 21.
Метиловый эфир N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
Раствор 3-бром-1-метил-2-пиридона (94 мг, 0,50 ммоля) и метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[(трибутил)станнил]-L-фенилаланина (284 мг, 0,50 ммоля) в ДМФ (3 мл) деоксигенировали, поочередно (3х) замораживая смесь в вакууме на бане с жидким азотом и оттаивая в атмосфере аргона. Затем добавляли дихлорид бис(трифенилфосфин)палладия (40 мг, 0,057 ммоля) и реакционную смесь нагревали при 90°С в течение 3 ч до приобретения темной окраски. После того как результаты ТСХ показали, что реакция прошла не полностью, добавляли дополнительную порцию (20 мг) катализатора и нагревание продолжали в течение 4 ч. Затем смесь охлаждали, разбавляли дихлорметаном (20 мл) и фильтровали через слой целита. Фильтрат упаривали досуха, остаток растворяли в эфире/этилацетате (20 мл, 1:1), раствор промывали водой (1×10 мл), 5%-ным раствором фторида калия (2×5 мл), водой (1×10 мл) и сушили (MgSO4 ). Остаток, полученный после концентрирования, хроматографировали на колонке с силикагелем (25 г) при элюировании этилацетатом/гексаном (4:6), при этом получали метиловый эфир N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (64 мг, 33%). MC-HP (ES): m/z положительно заряженный ион, 795 (2M+Na), 409 (M+Na), 387 (М+Н). МС-ВР: найд. 387,1935, рассч. 387,1920 (М+Н).
Пример 22.
Гидрохлорид метилового эфира 4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
Раствор метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (60 мг, 0,155 ммоля) в 4н. HCl в диоксане (4 мл) перемешивали в течение 2 ч и концентрировали. Остаток растирали с несколькими порциями эфира, при этом получали гидрохлорид метилового эфира 4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (55 мг, выход количественный) в виде порошка белого цвета. МС-НР (ES): m/z положительно заряженный ион, 573 (2М+Н), 328 (M+H+CH3CN), 319 (М+Н+СН 3ОН), 287 (М+Н). МС-ВР: найд. 287,1396, рассч. 287.1396 (М+Н).
Пример 23.
Метиловый эфир N-[(2-бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
Раствор гидрохлорида метилового эфира 4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (52 мг, 0,16 ммоля), 2-бром-5-метоксибензойной кислоты (45 мг, 0,19 ммоля), DIEA (140 мкл, 0,80 ммоля) и HBTU (85 мг, 0,22 ммоля) в ДМФ (3 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Смесь концентрировали, остаток растворяли в этилацетате (15 мл), промывали 0,5н. HCl (1×5 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (1×5 мл), солевым раствором (1×5 мл) и сушили (MgSO4).). Остаток, полученный после выпаривания (85 мг), хроматографировали на колонке с силикагелем (25 г) при элюировании этилацетатом, при этом получали метиловый эфир N-[(2-бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (54 мг, 68%). МС-ВР: найд. 499,0872, рассч. 499,0869 (М+Н).
Пример 24.
N-[(2-Бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин
Раствор метилового эфира N-[(2-бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (52 мг, 0,104 ммоля) в ТГФ (3 мл) смешивали с раствором моногидрата гидроксида лития (20 мг, 0,47 ммоля) в воде (1,0 мл). Для получения прозрачного раствора добавляли метанол (0,5 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч. Затем добавляли уксусную кислоту (0,5 мл), реакционную смесь наносили на колонку (4×30 см) с С-18 для обращенно-фазной ЖХВР и элюировали в линейном градиенте ацетонитрила в воде (от 5% до 95%) в течение 35 мин. Фракцию, содержащую целевой продукт, высушивали лиофильно, при этом получали N-[(2-бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин (39 мг, 78%) в виде твердого вещества белого цвета. МС-НР: найд. 485,0703, рассч. 485,0712 (М+Н).
Пример 25.
Метиловый эфир 4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-L-фенилаланина
Раствор 3,5-дибром-1-метил-2-пиридона (267 мг, 1,0 ммоль) и метиловго эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[(трибутил)станнил]-L-фенилаланина (568 мг, 1,0 ммоль) в ДМФ (7 мл) деоксигенировали, поочередно (3х) замораживая смесь в вакууме на бане с жидким азотом и оттаивая в атмосфере аргона. Затем добавляли дихлорид бис(трифенилфосфин)палладия (80 мг, 0,11 ммоля) и реакционную смесь нагревали при 90°С в течение 3 ч до приобретения темной окраски. После того как данные ТСХ показали, что реакция прошла не полностью, добавляли дополнительную порцию (40 мг) катализатора и нагревание продолжали в течение 4 ч. Затем смесь охлаждали, разбавляли дихлорметаном (40 мл) и фильтровали через слой целита. Фильтрат упаривали досуха, остаток растворяли в этилацетате (30 мл). Полученный раствор промывали водой (1×10 мл), 5%-ным раствором фторида калия (2×10 мл), солевым раствором (1×5 мл) и сушили (MgSO 4). Остаток, полученный после концентрирования, хроматографировали на колонке с силикагелем (45 г) при элюировании этилацетатом/гексаном (3:7), при этом получали метиловый эфир 4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-L-фенилаланина (140 мг, 30%). МС (FAB): 465 (М+Н (1 Br)).
Пример 26.
Гидрохлорид метилового эфира 4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
Раствор метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (135 мг, 0,29 ммоля) в 4н. HCl в диоксане (5 мл) перемешивали в течение 2 ч и концентрировали. Остаток растирали с несколькими порциями эфира, при этом получали гидрохлорид метилового эфира 4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (120 мг, выход количественный) в виде порошка белого цвета. МС-НР (ES): m/z положительно заряженный ион, 729, 2М+Н (2 Br), 406 (M+H+CH 3CN), 397 (M+H+CH3CN (1 Br)), 365 (М+Н (1 Br)). MC-BP: найд. 365,0504, рассч. 365,0501 (М+Н).
Пример 27.
Метиловый эфир N-[(2-бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
Раствор гидрохлорида метилового эфира 4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (120 мг, 0,30 ммоля), 2-бром-5-метоксибензойной кислоты (82 мг, 0,36 ммоля), DIEA (260 мкл, 1,5 ммоля) и HBTU (157 мг, 0,41 ммоля) в ДМФ (4 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Смесь концентрировали, остаток растворяли в этилацетате (15 мл), промывали 0,5н. HCl (1×5 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (1×5 мл), солевым раствором (1×5 мл) и сушили (MgSO4). Остаток, полученный после выпаривания (180 мг), хроматографировали на колонке с силикагелем (25 г) при элюировании этилацетатом/гексаном (3:1), при этом получали метиловый эфир N-[(2-бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (130 мг, 76%). МС-ВР: найд. 576,9959, рассч. 576,9973 (М+Н).
Пример 28.
N-[(2-Бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин
Раствор метилового эфира N-[(2-бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (29 мг, 0,05 ммоля) в ТГФ (3 мл) смешивали с раствором моногидрата гидроксида лития (20 мг, 0,47 ммоля) в воде (1,0 мл). Для получения прозрачного раствора добавляли метанол (0,5 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч. Затем добавляли уксусную кислоту (0,5 мл), реакционную смесь наносили на колонку (4×30 см) с С-18 для обращенно-фазовой ЖХВР и элюировали в линейном градиенте ацетонитрила в воде (от 5% до 95%) в течение 35 мин. Фракцию, содержащую целевой продукт, высушивали лиофильно, при этом получали N-[(2-бром-5-метоксифенил)карбонил]-4-(5-бром-1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин (22 мг, 79%) в виде твердого вещества белого цвета. МС-ВР: найд. 562,9814, рассч. 562,9817 (М+Н).
Пример 29.
Получение метилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
К суспензии гидрохлорида метилового эфира 4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (101 мг, 0,313 ммоля), 2-хлор-6-метилбензойной кислоты (60 мг, 0,35 ммоля) и HBTU (133 мг, 0,35 ммоля) в ДМФ (2 мл) при комнатной температуре добавляли DIEA (122 мкл, 0,88 ммоля) и полученную смесь перемешивали в течение 15 ч. Затем смесь выливали в воду (25 мл) и органическое вещество экстрагировали этилацетатом (2×15 мл). Объединенные этилацетатные экстракты последовательно промывали 0,5н. HCl (25 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (25 мл), солевым раствором (25 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После фильтрования и концентрирования фильтрата получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40s), при этом получали 122 мг (выход 88%) метилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (FAB): m/e рассч. для С24H23ClN2О 4 (M+H) 439; 1425, найд. 439,1414.
Пример 30.
Получение N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
К суспензии метилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (118 мг, 0,269 ммоля) в этаноле (6 мл) при комнатной температуре добавляли 1н. водный раствор гидроксида натрия (4 мл), полученный раствор нагревали до 50°С и перемешивали в течение 2 ч. Затем этанол удаляли в вакууме и остаток разбавляли водой (25 мл). Водный раствор промывали диэтиловым эфиром (25 мл) для удаления нейтральных примесей. Водный слой подкисляли 1,0н. HCl и продукт экстрагировали этилацетатом (2×25 мл). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором (50 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали 81 мг (выход 71%) N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1-метил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина в виде твердого вещества белого цвета, tпл. 204-210°С. МС-ВР (FAB): m/e рассч. для C23H21ClN 2O4 (М+Н) 425,1268; найд. 425,1267.
Пример 31.
Получение N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
а) Получение 1,4-диметил-2(1Н)-пиридона
К суспензии 4-метил-2(1Н)-пиридона (5 г, 45,82 ммоля) и карбоната калия (12,64 г, 91,64 ммоля) в DME (100 мл) при комнатной температуре добавляли иодметан (50,5 г, 366 ммолей) и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, выливали в воду (200 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×100 мл). Объединенные экстракты промывали солевым раствором (200 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 2,5 г (выход 44%) 1,4-диметил-2(1Н)-пиридон в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (FAB): m/e рассч. для C7H9NO (М+Н) 123,0241, найд. 123,0246.
б) Получение 1,4-диметил-3-иод-2(1Н)-пиридона и 1,4-диметил-5-иод-2(1Н)-
пиридона
Реакционную смесь, содержащую 1,4-диметил-2-пиридон (2,46 г, 20 ммолей), трифторуксусную кислоту (31 мл) и трифторуксусный ангидрид (6,25 мл), кипятили с обратным холодильником в течение 5 мин. Затем добавляли NIS (5,62 г, 25 ммолей) и смесь перемешивали в течение 15 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и растворитель удаляли в вакууме. Остаток разбавляли этилацетатом (100 мл) и образующееся твердое вещество белого цвета отделяли фильтрованием. Фильтрат промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (2×100 мл), солевым раствором (100 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После удаления осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 0,92 г (выход 5%) смеси (-1:1) 1,4-диметил-3-иод-2(1Н)-пиридона и 1,4-диметил-5-иод-2(1Н)-пиридона, которую использовали непосредственно на следующей стадии. 1H ЯМР (300 МГц, D6-DMSO, част/млн): 8,06 (s, 1H), 7,6 (d, 1H, J=5,5 Гц), 6,4 (s, 1H), 6,2 (d, 1H, J=5,5 Гц), 3,4 (s, 3H), 3,3 (s, 3H), 2,3 (s, 3H), 2,15 (s, 3H).
в) Получение метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина и метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-5-пиридинил)-L-фенилаланина
К суспензии цинковой пыли (0,66 г, 10 ммолей) в ТГФ (1,0 мл) при комнатной температуре добавляли 1,2-дибромэтан (86 мкл, 1 ммоль). Полученную суспензию нагревали до 60-65°С феном до прекращения выделения газообразного этилена. Затем суспензию охлаждали до комнатной температуры, добавляли триметилхлорсилан (0,126 мл, 1 ммоль) и смесь перемешивали в течение 15 мин. Смесь 1,4-диметил-3-иод-2(1Н)-пиридона и 1,4-диметил-5-иод-2(1Н)-пиридона (0,92 г, 3,69 ммоля) в ДМА (3 мл) нагревали до полного растворения компонентов и добавляли одной порцией к реакционной смеси. Затем смесь нагревали до 70°С и перемешивали в течение 15 ч, после чего данные ТСХ аликвотной части реакционной смеси, в которой реакцию останавливали добавлением насыщенного раствора хлорида аммония, указывали на отсутствие исходного материала. Реакционную смесь разбавляли ТГФ (4 мл), охлаждали до комнатной температуры и выдерживали в течение ˜3 ч до осаждения избытка цинковой пыли и получения прозрачного супернатанта.
Полученный, как указано выше, раствор, содержащий соединение цинка (3,69 ммоля), добавляли при комнатной температуре к раствору Pd(dba) 2 (54 мг, 0,1 ммоля), трифурилфосфина (102 мг, 0,4 ммоля) и метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-иод-L-фенилаланина (1,01 г, 2,5 ммоля) в ТГФ (4 мл) и смесь светло-желтого цвета перемешивали при 50°С в течение 15 ч. Затем смесь выливали в насыщенный раствор хлорида аммония и экстрагировали этилацетатом (3×50 мл). Объединенные экстракты промывали солевым раствором (150 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 0,141 г (выход 14%) метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина в виде твердого аморфного вещества белого цвета, МС-ВР (ES): m/e рассч. для C22H28N2O 5 (M+Na) 423,1890, найд. 423,1894, и 0,350 г (выход 35%) метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-5-пиридинил)-L-фенилаланина в виде твердого аморфного вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для C22H28N2O 5 (M+Na) 423,1890, найд. 423,1897.
г) Получение гидрохлорида метилового эфира 4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
К раствору метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (132 мг, 0,33 ммоля) в диоксане (1 мл) при комнатной температуре добавляли раствор 4н. HCl в диоксане (1,5 мл), перемешивали в течение 4 ч и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в метаноле (5 мл) и толуоле (5 мл), а затем концентрировали в вакууме, при этом получали 111 мг (выход 99%) гидрохлорида метилового эфира 4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина в виде твердого аморфного вещества белого цвета. МС-ВР (El): m/e рассч. для С17Н20N2О3 (М +) 300,1474, найд. 300,1486.
д) Получение метилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
К суспензии гидрохлорида метилового эфира 4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (34 мг, 0,1 ммоля) и 2,6-дихлорбензоилхлорида (25 мг, 0,12 ммоля) в дихлорметане (2 мл) при комнатной температуре добавляли DIEA (174 мкл, 1,0 ммоль). Через 5 мин исходные компоненты растворялись и прозрачный раствор перемешивали в течение 72 ч. Затем смесь концентрировали, остаток растворяли в этилацетате (25 мл), промывали 0,5н. HCl (25 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (25 мл), солевым раствором (15 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40s), при этом получали 23 мг (выход 49%) метилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина в виде твердого аморфного вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для C24H22Cl2N 2O4 (M+Na) 495,0850, найд, 495,0859.
е) Получение N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
К суспензии метилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил] 4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (20 мг, 0,04 ммоля) в этаноле (1 мл) при комнатной температуре добавляли 1н. водный раствор гидроксида натрия (0,5 мл), полученную смесь нагревали до 40-45°С и перемешивали в течение 3 ч. Затем этанол удаляли в вакууме и остаток разбавляли водой (10 мл). Водный раствор промывали диэтиловым эфиром (25 мл) для удаления нейтральных примесей. Водный слой подкисляли 1,0н. HCl и продукт экстрагировали этилацетатом (2×25 мл). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором (50 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали 17 мг (выход 89%) N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина в виде твердого аморфного вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для С23Н20Cl2O 4 (M+Na) 481,0691, найд. 481,0699.
Пример 32.
Получение N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
а) Получение метилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
К суспензии гидрохлорида метилового эфира 4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (68 мг, 0,2 ммоля), 2-хлор-6-метилбензойной кислоты (45 мг, 0,25 ммоля) и HBTU (95 мг, 0,25 ммоля) в ДМФ (1,5 мл) при комнатной температуре добавляли DIEA (174 мкл, 1,0 ммоль) и полученный раствор перемешивали в течение 72 ч. Затем смесь выливали в воду (25 мл) и экстрагировали этилацетатом (2×15 мл). Объединенные этилацетатные экстракты последовательно промывали 0,5н. HCl (25 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (25 мл), солевым раствором (25 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования растворителя получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40s), при этом получали 24 мг (выход 27%) метиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина в виде твердого аморфного вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для C25H25ClN2O 4 (M+Na) 475,1395, найд. 475,1400.
б) Получение N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
К суспензии метилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина (22 мг, 0,048 ммоля) в этаноле (1 мл) при комнатной температуре добавляли 1н. водный раствор гидроксида натрия (0,5 мл), полученный раствор нагревали до 40-45°С и перемешивали в течение 2 ч. Затем этанол удаляли в вакууме и остаток разбавляли водой (25 мл). Водный раствор промывали диэтиловым эфиром (25 мл) для удаления нейтральных примесей. Водный слой подкисляли 1,0н. HCl и продукт экстрагировали этилацетатом (2×25 мл). Объединенные экстракты промывали солевым раствором (50 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали 18 мг (выход 86%) N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина в виде твердого аморфного вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для C24H23ClN2O 4 (M+H) 439,1419. найд. 439,1425.
Пример 33.
Получение N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
а) Получение 1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-пиридона
К суспензии 6-метил-4-(трифторметил)-1Н-2-пиридона (2 г, 11,25 ммоля) и карбоната калия (4,68 г, 33,9 ммоля) в DME (25 мл) при комнатной температуре добавляли иодметан (9,62 г, 67,8 ммоля) и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, выливали в воду (100 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×100 мл). Объединенные экстракты промывали солевым раствором (200 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования растворителя получали неочищенный продукт, который очищали хроматографиией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 2,1 г (выход 97%) 1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-пиридона в виде твердого вещества белого цвета, tпл.80-82°C. MC-BP (El): m/e рассч. для C8H8F3 NO (M+) 191,0558, найд.191,0559.
б) Получение 1,6-диметил-3-иод-4-(трифторметил)-2-пиридона
Смесь, содержащую 1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-пиридон (2,1 г, 10,98 ммоля), трифторуксусную кислоту (18 мл) и трифторуксусный ангидрид (3,5 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 5 мин. Затем добавляли NIS (3,15 г, 14 ммолей) и смесь перемешивали в течение 15 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и растворитель удаляли в вакууме. Остаток разбавляли этилацетатом (100 мл), промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (2×100 мл), солевым раствором (100 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 2,15 г (выход 62%) 1,6-диметил-3-иод-4-(трифторметил)-2-пиридона в виде твердого аморфного вещества белого цвета. MC-BP (EI): m/e рассч. для C8H7F3INO (М +) 316,9524, найд. 316,9527.
в) Получение метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К суспензии цинковой пыли (1,96 г, 30 ммолей) в ТГФ (2,0 мл) при комнатной температуре добавляли 1,2-дибромэтан (172 мкл, 2 ммоля). Полученную суспензию нагревали до 60-65°С феном до прекращения выделения газообразного этилена. Затем суспензию охлаждали до комнатной температуры, добавляли триметилхлорсилан (127 мкл, 1 ммоль) и смесь перемешивали в течение 15 мин. Суспензию 1,6-диметил-3-иод-4-(трифторметил)-2-пиридона (2,15 г, 6,78 ммоля) в ДМА (6 мл) нагревали феном до получения раствора и добавляли одной порцией к реакционной смеси. Затем смесь нагревали до 70°С и перемешивали в течение 15 ч, после чего данные ТСХ аликвотной части реакционной смеси, в которой реакцию останавливали добавлением насыщенного раствора хлорида аммония, указывали на отсутствие исходного материала. Реакционную смесь разбавляли ТГФ (6 мл), охлаждали до комнатной температуры и выдерживали до осаждения избытка цинковой пыли.
Полученный, как указано выше, раствор, содержащий соединение цинка (6,78 ммоля), добавляли при комнатной температуре к раствору Pd(dba)2 (108 мг, 0,2 ммоля), трифурилфосфина (204 мг, 0,8 ммоля) и метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-иод-L-фенилаланина (1,62 г, 4 ммоля) в ТГФ (8 мл) и смесь светло-желтого цвета перемешивали при 50°С в течение 15 ч. Затем реакционную смесь выливали в насыщенный раствор хлорида аммония и экстрагировали этилацетатом (3×70 мл). Объединенные экстракты промывали солевым раствором (150 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 0,711 г (выход 38%) метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде твердого аморфного вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для C23H27F3N 2O5 (M+Na) 491,1764, найд. 491,1770.
г) Получение гидрохлорида метилового эфира 4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К раствору метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (132 мг, 0,33 ммоля) в диоксане (3 мл) при комнатной температуре добавляли 4н. раствор HCl в диоксане (4,5 мл). Раствор перемешивали в течение 4 ч до образования твердого вещества белого цвета. Смесь разбавляли диэтиловым эфиром (50 мл), твердое вещество отделяли фильтрованием и промывали диэтиловым эфиром. После высушивания в высоком вакууме получали 315 мг (выход 92%) гидрохлорида метилового эфира 4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для C18H19F3N 2O3 (M+Na) 391,1241, найд. 391,1241.
д) Получение метилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К суспензии гидрохлорида метилового эфира 4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (150 мг, 0,37 ммоля) и 2,6-дихлорбензоилхлорида (85 мг, 0,4 ммоля) в дихлорметане (6 мл) при комнатной температуре добавляли DIEA (257 мкл, 1,48 ммоля). Через 5 мин получали прозрачный раствор, который перемешивали в течение 48 ч. Затем смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате (50 мл). Раствор в этилацетате промывали 0,5н. HCl (50 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (50 мл), солевым раствором (50 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 190 мг (выход 95%) метилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)кар5онил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для C25H21Cl2F 3N2O4 (M+Na) 563,0724, найд, 563,0726.
е) Получение N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К суспензии метилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (177 мг, 0,326 ммоля) в этаноле (6 мл) при комнатной температуре добавляли 1н. водный раствор гидроксида натрия (4 мл) и смесь перемешивали в течение 5 ч. Затем этанол удаляли в вакууме и остаток разбавляли водой (20 мл). Водный раствор промывали диэтиловым эфиром (50 мл) для удаления нейтральных примесей. Водный слой подкисляли 1,0н. HCl и полученный продукт экстрагировали этилацетатом (2×50 мл). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором (50 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали 159 мг (выход 92%) N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде твердого вещества белого цвета, tпл.238-240°C. MC-BP (ES): m/e рассч. для C24H19Cl 2F3N2O4 (M+Na) 549,0567, найд. 549,0570.
Пример 34
Получение N-[(2-этил-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
а) Получение 2-этил-6-метилбензойной кислоты
В сосуд высокого давления объемом 250 мл помещали 2-этил-6-метилиодбензол (30,07 ммоля, 7,4 г), Pd(OAc)2 (1,43 ммоля, 334 мг) и dppp (1,43 ммоля, 620 мг). Сосуд закрывали мембраной и трижды продували аргоном. Затем шприцем последовательно добавляли ацетонитрил (96 мл), триэтиламин (189 ммолей, 19,0 г, 26,25 мл) и воду (19,1 мл), заменяли резиновую мембрану на крышку с тефлоновым покрытием, подсоединенную к источнику моноксида углерода. Сосуд продували моноксидом углерода при давлении 40 фунт/кв.дюйм и избыток давления сбрасывали. Этот процесс повторяли трижды, в заключение смесь перемешивали в течение 5 мин при давлении 40 фунт/кв.дюйм в атмосфере моноксида углерода. Затем сосуд отсоединяли от баллона с моноксидом углерода и погружали в предварительно нагретую масляную баню (83-85°С). Реакционная смесь в течение 1 ч приобретала черный цвет, после чего ее перемешивали при указанной температуре в течение 14 ч. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и сбрасывали давление. Полученную смесь разбавляли эфиром (200 мл) и 1,0н. NaOH (20 мл). Образовавшуюся кислоту экстрагировали водой (2×100 мл). Объединенные водные экстракты нейтрализовали 1,0н. HCl и кислоту экстрагировали дихлорметаном (3×100 мл). Объединенные экстракты в дихлорметане промывали солевым раствором и сушили над MgSO4. После отделения осушителя фильтрованием и удаления растворителя в вакууме получали 3,58 г (72,5%) вязкого масла коричневого цвета, которое медленно затвердевало в течение ночи. МС-ВР: найд. 164,0833, рассч. 164,0837 (М+).
б) Получение 2-этил-6-метилбензоилхлорида
Раствор 2-этил-6-метилбензойной кислоты (49 мг, 0,30 ммоля) в дихлорметане (3 мл), содержащий ДМФ (1 каплю), обрабатывали оксалилхлоридом (0,14 мл, 1,6 ммоля) и смесь перемешивали в течение 15 ч. Смесь концентрировали, следы оксалилхлорида удаляли перегонкой азеотропной смеси с толуолом и остаток непосредственно использовали на следующей стадии.
в) Получение метилового эфира N-[(2-этил-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
Смесь полученного, как указано выше, хлорангидрида (2-этил-6-метилбензойной кислоты) и 4-(1,3-диметил-2,4-диоксо-6-(трифторметил)-5-пиримидинил)-L-фенилаланина (100 мг, 0,25 ммоля) в дихлорметане (5 мл) обрабатывали DIPEA (0,17 мл, 1,0 ммоль) и полученный раствор светло-коричневого цвета перемешивали в течение 3 сут. Смесь концентрировали, разбавляли этилацетатом, промывали 1н. HCl, солевым раствором и сушили над сульфатом магния. После фильтрования и упаривания получали остаток, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40s), при этом получали метиловый эфир N-[(2-этил-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,3-диметил-2,4-диоксо-6-(трифторметил)-5-пиримидинил]-L-фенилаланина в виде пены белого цвета (79 г, 62%). МС-ВР (ES): m/e рассч. для C28H29F3NO4 (M+Na) 537,1974, найд. 537,1972.
г) Получение N-[(2-этил-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
Раствор метилового эфира N-[(2-этил-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,3-диметил-2,4-диоксо-6-(трифторметил)-5-пиримидинил)-L-фенилаланина (74 мг, 0,14 ммоля) и 1н. гидроксида натрия (2 мл, 2 ммоля) в этаноле (3 мл) нагревали при 40-45°С в течение 3 ч. Затем этанол удаляли в вакууме и остаток разбавляли водой. Водный раствор промывали диэтиловым эфиром для удаления нейтральных примесей. Водный слой подкисляли 1,0н. HCl и полученный продукт экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали 68 мг (выход 95%) N-[(2-этил-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина, tпл.219-221°C. MC-BP (ES): m/e рассч. для C 27H27F3N2O4 (M+Na) 523,1815, найд. 523,1816.
Пример 35.
Получение N-[(2-(1-метилэтил)-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
а) Получение 2-(1-метилэтил)-6-метилиодбензола
К суспензии 2-(1-метилэтил)-6-метиланилина (15,57 ммоля, 14,9 г) в конц. HCl (50 мл) и 30 г льда по каплям добавляли раствор NaNO2 (110 ммолей, 8 г) в Н2О (35 мл) при температуре от -5 до 5°С в течение 30 мин. После добавления реактива полученный раствор красного цвета перемешивали еще в течение 30 мин. Затем по каплям добавляли раствор KI (200 ммолей, 33,2 г) в Н2О (50 мл) при температуре 0-5°С в течение 20 мин. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры, при этом происходила экзотермическая реакция с выделением газа. Полученный раствор красного цвета перемешивали в течение 18 ч. Затем смесь экстрагировали этилацетатом (3×100 мл). Объединенные экстракты промывали раствором тиосульфата натрия (200 мл), солевым раствором и сушили над MgSO4. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования растворителя в вакууме получали окрашенное соединение, которое очищали хроматографией на колонке с силикагелем, при этом получали чистый 2-(1-метилэтил)-6-метилиодбензол (17,8 г, 68%) в виде масла желтого цвета. МС-ВР: найд. 260,0063, рассч. 260,0062 (М+).
б) Получение 2-(1-метилэтил)-6-метибензойной кислоты
В сосуд высокого давления объемом 250 мл помещали 2-(1-метилэтил)-6-метилиодбензол (25,2 ммоля, 6,55 г), Pd(OAc)2 (1,2 ммоля, 280 мг) и dppp (1,2 ммоля, 520 мг). Сосуд закрывали мембраной и трижды продували аргоном. Затем шприцем последовательно добавляли ацетонитрил (96 мл), триэтиламин (188,7 ммоля, 19,0 г, 26,25 мл) и воду (19,1 мл), заменяли резиновую мембрану на крышку с тефлоновым покрытием, подсоединенную к источнику моноксида углерода. Сосуд продували моноксидом углерода при давлении 40 фунт/кв.дюйм и избыток давления сбрасывали. Этот процесс повторяли трижды и в заключение смесь перемешивали в течение 5 мин при давлении 40 фунт/кв.дюйм в атмосфере моноксида углерода. Затем сосуд отсоединяли от баллона с моноксидом углерода и погружали в предварительно нагретую масляную баню (83-85°С). Реакционная смесь в течение 1 ч приобретала черный цвет, а затем ее перемешивали при указанной температуре в течение 4 ч. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и сбрасывали давление. Полученную смесь разбавляли эфиром (200 мл) и 1,0н. NaOH (10 мл). Образовавшуюся кислоту экстрагировали водой (2×100 мл). Объединенные водные экстракты нейтрализовали 1,0н. HCl и кислоту экстрагировали этилацетатом (2×100 мл). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором и сушили над MgSO4. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали 2,8 г (62%) вязкого масла желтого цвета. МС-ВР: найд. 178,0996, рассч. 178,0994 (М+).
в) Получение 2-(1-метилэтил)-6-метилбензоилхлорида
Раствор 2-(1-метилэтил)-6-метилбензойной кислоты (64 мг, 0,35 ммоля) в дихлорметане (3 мл), содержащий ДМФ (2 капли), обрабатывали оксалилхлоридом (0,16 мл, 1,8 ммоля) и смесь перемешивали в течение 15 ч. Смесь концентрировали, следы оксалилхлорида удаляли перегонкой азеотропной смеси с толуолом и остаток использовали непосредственно на следующей стадии.
г) Получение N-[[2-(1-метилэтил)-6-метилфенил]карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
N-[[2-(1-Метилэтил)-6-метилфенил]карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин получали из метилового эфира 4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и 2-(1-метилэтил)-6-метилбензоилхлорида с использованием общих методов, описанных в примере 33. МС-ВР (ES): m/e рассч. для C 28H29F3N2O4 (M+Na) 537,1972, найд. 537,1977.
Пример 36.
Получение N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
а) Получение метилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К суспензии гидрохлорида метилового эфира 4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (100 мг, 0,25 ммоля), 2-хлор-6-метилбензойной кислоты (60 мг, 0,35 ммоля) и HBTU (132 мг, 0,35 ммоля) в ДМФ (2 мл) при комнатной температуре добавляли DIEA (174 мкл, 1,0 ммоля) и полученную смесь перемешивали в течение 72 ч. Затем смесь выливали в воду (25 мл) и экстрагировали этилацетатом (2×15 мл). Объединенные этилацетатные экстракты последовательно промывали 0,5н. HCl (25 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (25 мл), солевым раствором (25 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40s), при этом получали 98 мг (выход 75%) метилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/е рассч. для C26H24ClF3N 2O4 (M+Na) 543,1268, найд. 543,1275.
б) Получение N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К суспензии метилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (91 мг, 0,174 ммоля) в этаноле (5 мл) при комнатной температуре добавляли 1н. водный раствор гидроксида натрия (4 мл). Полученный раствор нагревали до 40-45°С и перемешивали в течение 4 ч. Затем удаляли этанол в вакууме и остаток разбавляли водой (25 мл). Водный раствор промывали диэтиловым эфиром (25 мл) для удаления нейтральных примесей. Водный слой подкисляли 1,0 н. HCl и полученный продукт экстрагировали этилацетатом (2×25 мл). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором (50 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования фильтрата получали 71 мг (выход 80%) N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде твердого вещества белого цвета, tпл. 220-223°C. MC-BP (ES): m/e рассч. для С25Н22CIF 3N2O4 (M+Na) 529,1111, найд. 529,1119.
Пример 37.
Получение N-[[1-(2-метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
N-[[1-(2-Метоксиэтил)циклопентил]карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланин (tпл. 181-183°C) получали из метилового эфира 4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и 1-(2-метоксиэтил)циклопентанкарбоновой кислоты (полученной, как описано в WO 99/10313) с использованием общих методов, описанных в примере 36. MC-BP (ES): m/e рассч. для С26Н 31F3N2O5 (M+Na) 531,2077, найд. 531,2084.
Пример 38.
Получение этилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К суспензии N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (145 мг, 0,275 ммоля) и бикарбоната натрия (185 мг, 2,2 ммоля) в ДМФ (2 мл) при комнатной температуре добавляли иодэтан (343 мг, 2,2 ммоля) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 72 ч. Затем смесь выливали в воду (30 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×20 мл). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором (60 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования фильтрата получали 129 мг (выход 85%) этилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде кристаллического вещества белого цвета, tпл. 86-91°C. MC-BP (ES): m/e рассч. для С26Н 23Cl2N2O4 (M+Na) 577,0876, найд. 577,0887.
Пример 39.
Получение 2-[(N,N-диэтил)амино]этилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К смеси N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (145 мг, 0,275 ммоля), гидрохлорида 2-диэтиламиноэтилхлорида (487 мг, 2,75 ммоля) и карбоната калия (380 мг, 2,7 ммоля) при комнатной температуре добавляли этилацетат (3 мл) и воду (3 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 72 ч. Затем смесь выливали в смесь воды (30 мл) и этилацетата (30 мл). Слои разделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (2×20 мл). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором (60 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40s), при этом получали 122 мг (выход 71%) 2-[(N,N-диэтил)амино]этилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/е рассч. для C30H32Cl2F 3N3O4 (M+H) 626,1796, найд. 626,1802.
Пример 40.
Получение 1-(ацетокси)этилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К суспензии N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (145 мг, 0,275 ммоля) и бикарбоната натрия (185 мг, 2,2 ммоля) в ДМФ (2 мл) при комнатной температуре добавляли 1-хлорэтилацетат (270 мг, 2,2 ммоля) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч. Затем смесь выливали в воду (30 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×20 мл). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором (60 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40s), при этом получали 110 мг (выход 65%) 1-(ацетокси)этилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/е рассч. для C28H25Cl2F 3N2O6 (M+Na) 635,0931, найд. 635,0932.
Пример 41.
Получение этилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
Этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина может быть получен из N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и иодэтана с использованием общих методов, описанных в примере 38.
Пример 42.
Получение 2-[(N,N-диэтил)амино]этилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
2-[(N,N-Диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина может быть получен из N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и гидрохлорида 2-[(N,N-диэтил)амино]этилхлорида с использованием общих методов, описанных в примере 39.
Пример 43.
Получение 1-(ацетокси)этилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
1-(Ацетокси)этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина может быть получен из N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и 1-хлорэтилацетата с использованием общих методов, описанных в примере 40.
Пример 44.
Получение N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-метил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
а) Получение 4-метокси-1,1,1-трифторпент-3-ен-2-она
К раствору 2-метоксипропена (3,68 г, 51,03 ммоля) и пиридина (1,35 г, 16,69 ммоля) в дихлорметане (15 мл) при 0°С добавляли раствор трифторуксусного ангидрида (10 мл, 46,56 ммоля) в дихлорметане (8 мл) в течение 10-12 мин. После добавления реактива раствор приобретал темный красно-коричневый цвет, после чего охлаждающую баню удаляли и прекращали перемешивание. Смесь выдерживали в течение 16 ч и разбавляли ледяной водой (45 мл) и дихлорметаном (120 мл). Два слоя разделяли и органический слой последовательно промывали 2н. HCl (35 мл), насыщенным раствором карбоната натрия (75 мл), солевым раствором (25 мл) и сушили над безводным сульфатом натрия. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали перегонкой в высоком вакууме, при этом получали 5,546 г (выход 65%) 4-метокси-1,1,1-трифторпент-3-ен-2-она в виде масла светло-желтого цвета.
б) Получение этилового эфира 4-метил-2(1Н)-оксо-6-(трифторметил)пиридин-3-карбоновой кислоты
К суспензии 4-метокси-1,1,1-трифторпент-3-ен-2-она (5,53 г, 32,89 ммоля) и моноамида этилового эфира малоновой кислоты (4,31 г, 32,89 ммоля) в этаноле (30 мл) при комнатной температуре добавляли этоксид натрия (11,72 г, 36,18 ммоля, 21% чистоты) и реакционную смесь нагревали до ˜85°С. После перемешивания в течение 18 ч реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и добавляли 15%-ную HCl (10 мл). Затем смесь разбавляли водой (10 мл) и экстрагировали хлороформом (2×50 мл). Объединенные экстракты промывали солевым раствором (100 мл) и сушили над безводным сульфатом натрия. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 5,22 г (выход 62%) этилового эфира 4-метил-2(1Н)-оксо-6-(трифторметил)пиридин-3-карбоновой кислоты в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/z 313,4 (M+Na+CH3CN).
в) Получение этилового эфира 1,4-диметил-2(1Н)-оксо-6-(трифторметил)пиридин-3-карбоновой кислоты
К суспензии этилового эфира 4-метил-2(1Н)-оксо-6-(трифторметил)пиридин-3-карбоновой кислоты (5,2 г, 20,87 ммоля) и карбоната калия (8,65 г, 62,59 ммоля) в ДМФ (50 мл) при комнатной температуре добавляли иодметан (12 мл, 192,8 ммоля) и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 18 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, неорганические твердые вещества отделяли фильтрованием и промывали ДМФ. Растворитель концентрировали в вакууме и остаток очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 4,02 г (выход 71%) этилового эфира 1,4-диметил-2(1Н)-оксо-6-(трифторметил)пиридин-3-карбоновой кислоты в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для С11Н12F3 NO3 (M+Na) 286,0661, найд. 286,0664.
г) Получение 1,4-диметил-6-(трифторметил)-1Н-пиридин-2-она
К смеси этилового эфира 1,4-диметил-2(1Н)-оксо-6-(трифторметил)пиридин-3-карбоновой кислоты (2,5 г, 9,5 ммоля) и хлорида лития (1,0 г, 23,6 ммоля) при комнатной температуре добавляли ДМФ (15 мл) и воду (0,38 мл). Реакционную смесь нагревали на бане до 160°С и перемешивали в течение 19 ч. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли холодным этилацетатом и диэтиловым эфиром (75 мл, 1:1). Полученную смесь промывали холодной водой (3×20 мл), солевым раствором (20 мл) и сушили над безводным сульфатом натрия. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования растворителя получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40s), при этом получали 1,45 г (выход 80%) 1,4-диметил-6-(трифторметил)-1Н-пиридин-2-она в виде твердого вещества светло-желтого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для C8H8F3NO (M+H) 192,0631, найд. 192,0632.
д) Получение 1,4-диметил-3-иод-6-(трифторметил)-1Н-пиридин-2-она
К раствору 1,4-диметил-6-(трифторметил)-1Н-пиридин-2-она (1,44 г, 7,23 ммоля), трифторуксусной кислоты (9 мл) и трифторуксусного ангидрида (1,53 мл, 10,85 ммоля) при комнатной температуре добавляли NIS (2,569 г, 10:85 ммоля), полученную смесь нагревали до 70-85°С и перемешивали в течение 2 ч. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и для нейтрализации раствора медленно добавляли насыщенный раствор карбоната натрия. Водную смесь экстрагировали этилацетатом (2×50 мл). Объединенные экстракты последовательно промывали насыщенным раствором тиосульфата натрия (100 мл), солевым раствором (100 мл) и сушили над безводным сульфатом натрия. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования растворителя получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 1,02 г (выход 45%) 1,4-диметил-3-иод-6-(трифторметил)-1Н-пиридин-2-она в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-НР (ES): m/z 318,1 (M+H), 381,2 (M+Na+CH3CN).
е) Получение метилового эфира N-[1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К суспензии цинковой пыли (1,96 г, 30 ммолей) в ТГФ (1,0 мл) при комнатной температуре добавляли 1,2-дибромэтан (172 мкл, 2 ммоля). Полученную суспензию нагревали до 60-65°С феном до прекращения выделения газообразного этилена. Суспензию охлаждали до комнатной температуры, добавляли триметилхлорсилан (150 мкл, 1,2 ммоля) и полученную смесь перемешивали в течение 15 мин. Суспензию 1,4-диметил-3-иод-6-(трифторметил)-2-пиридона (2,4 г, 7,57 ммоля) в ДМА (6 мл) нагревали феном до полного растворения компонентов и одной порцией добавляли к реакционной смеси. После добавления реагента смесь нагревали до 70-75°С и реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч, после чего данные ТСХ аликвотной части смеси, где реакцию останавливали добавлением насыщенного раствора хлорида аммония, указывали на отсутствие исходного материала. Реакционную смесь разбавляли ТГФ (5 мл), охлаждали до комнатной температуры и выдерживали до осаждения избытка цинковой пыли.
Полученный, как указано выше, раствор соединения цинка (7,57 ммоля) при комнатной температуре добавляли к раствору Pd(dba) 2 (274 мг, 0,478 ммоля), трифурилфосфина (391 мг, 1,287 ммоля) и метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-иод-L-фенилаланина (3 г, 7,411 ммоля) в ТГФ (7 мл), полученную смесь светло-желтого цвета перемешивали при 50-55°С в течение 40 ч. Реакционную смесь выливали в насыщенный раствор хлорида аммония и экстрагировали этилацетатом (3×70 мл). Объединенные экстракты промывали солевым раствором (100 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который очищали хроматографией на силикагеле с использованием колонки Biotage (40m), при этом получали 1,289 г (выход 36%) метилового эфира N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для С23Н27F3N 2O5 (M+Na) 491,1764, найд. 491,1764.
ж) Получение гидрохлорида метилового эфира 4-[1,6-диметил-4-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
Метиловый эфир N-[(1,1-диметилэтокси)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (253 мг, 0,54 ммоля) при комнатной температуре обрабатывали 4н. раствором HCl в диоксане (4,0 мл) и перемешивали в течение 2 ч до образования твердого вещества белого цвета. Смесь концентрировали и остаток растворяли в метаноле. После удаления метанола остаток сушили в высоком вакууме, при этом получали 221 мг (выход 100%) гидрохлорида метилового эфира 4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-НР (ES): m/z 369,3 (М+Н), 410,3 (M+CH3CN).
з) Получение метилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
К суспензии гидрохлорида метилового эфира 4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (216 мг, 0,53 ммоля) и 2,6-дихлорбензоилхлорида (120 мг, 0,57 ммоля) в ТГФ (6 мл) при комнатной температуре добавляли DIEA (210 мкл, 1,19 ммоля). Через 5 мин получали прозрачный раствор, который перемешивали в течение 18 ч. Затем смесь разбавляли этилацетатом (50 мл). Раствор в этилацетате последовательно промывали 0,5н. HCl (50 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (50 мл), солевым раствором (50 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали неочищенный продукт, который растворяли в этилацетате (˜3 мл), добавляли гексан (˜3-4 мл), а затем хранили в холодильнике. Твердое вещество отделяли и промывали гексаном. После высушивания в высоком вакууме получали 270 мг (выход 93,5%) метилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде твердого вещества белого цвета, tпл.170-173°C. MC-BP (ES): m/e рассч. для C25H21Cl 2F3N2O4 (M+Na) 563,0724. найд. 563,0730.
и) Получение N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
К суспензии метилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина (243 мг, 0,45 ммоля) в этаноле (5 мл) при комнатной температуре добавляли 1н. водный раствор гидроксида натрия (1,8 мл). Смесь нагревали до 45-50°С и перемешивали в течение 2 ч. Затем этанол удаляли в вакууме и остаток разбавляли водой (20 мл). Водный раствор промывали этилацетатом (50 мл) для удаления нейтральных примесей. Водный слой подкисляли 1,0н. HCl и продукт экстрагировали этилацетатом (2×50 мл). Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором (50 мл) и сушили над безводным сульфатом магния. После отделения осушителя фильтрованием и концентрирования получали 186 мг (выход 79%) N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина в виде аморфного твердого вещества белого цвета. МС-ВР (ES): m/e рассч. для C24H19Cl2F 3N2O4 (M+Na) 549,0567, найд. 549,0573.
Пример 45.
Получение N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланина
N-[(2-Хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил)-L-фенилаланин получали из метилового эфира 4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и 2-хлор-6-метилбензоилхлорида с использованием общих методов, описанных в примере 44. МС-НР (ES): m/z 507,1 (М+Н), 529,1 (M+Na).
Пример 46.
Получение этилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
Этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина может быть получен из N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и иодэтана с использованием общих методов, описанных в примере 38.
Пример 47.
Получение 2-[(N,N-диэтил)амино]этилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
2-[N,N-Диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина может быть получен из N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и гидрохлорида 2-[(N,N-диэтил)амино]этилхлорида с использованием общих методов, описанных в примере 39.
Пример 48.
Получение 1-(ацетокси)этилового эфира N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
1-(Ацетокси)этиловый эфир N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина может быть получен из N-[(2-хлор-6-метилфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и 1-хлорэтилацетата с использованием общих методов, описанных в примере 40.
Пример 49.
Получение этилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-(1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
Этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина может быть получен из N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и иодэтана с использованием общих методов, описанных в примере 38.
Пример 50.
Получение 2-[(N,N-диэтил)амино]этилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
2-[(N,N-Диэтил)амино]этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина может быть получен из N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и гидрохлорида 2-[(N,N-диэтил)амино]этилхлорида с использованием общих методов, описанных в примере 39.
Пример 51
Получение 1-(ацетокси)этилового эфира N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина
1-(Ацетокси)этиловый эфир N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина может быть получен из N-[(2,6-дихлорфенил)карбонил]-4-[1,4-диметил-6-(трифторметил)-2-оксо-3-пиридинил]-L-фенилаланина и 1-хлорэтилацетата с использованием общих методов, описанных в примере 40.
Биологические испытания
Пример А
Анализ по ингибированию связывания VLA-4/VCAM-1
Активность антагониста VLA-4, которую определяли как способность конкурировать за связывание с иммобилизованным VCAM-1, рассчитывали с использованием твердофазного ИФА с двойными антителами («сэндвич-ИФА»). VLA-4 (интегрин 4
1), связанный с VCAM-1, идентифицировали в виде комплекса «антитела к интегрину
-1: конъюгат пероксидазы хрена с мышиными антителами к IgG: хромогенный субстрат (K-Blue)». Сначала на 96-луночные планшеты (фирма Nunc Maxisorp) в качестве «антигена-захвата» наносили рекомбинатный VCAM-1 (0,4 мкг в 100 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, ФСБ), затем каждый планшет запечатывали и выдерживали при 4°С в течение приблизительно 18 ч. Планшеты, покрытые VCAM, блокировали 250 мкл 1% БСА/0,02% NaN3 для снижения неспецифического связывания. В день проведения анализа все планшеты дважды промывали буферным раствором для определения VCAM (по 200 мкл в лунку, 50 мМ трис-HCl буферного раствора с рН 7,4, 100 мМ NaCl, 1 мМ MnCl2, 0,05% твин 20). Исследуемые соединения растворяли в 100%-ном ДМСО и затем разбавляли 1:20 буферным раствором для определения VCAM, содержащим БСА в концентрации 1 мг/мл (то есть конечная концентрация ДМСО составляла 5%). Затем готовили серию разбавлении 1:4, чтобы диапазон концентраций для каждого тестируемого соединения составлял 0,005 нМ - 1,563 мкМ. В каждую лунку планшета, покрытого VCAM, добавляли по 100 мкл раствора тестируемых соединений при каждом разведении и по 10 мкл VLA-4 из клеток Ramos. Приготовленные планшеты перемешивали на платформе качалки в течение 1 мин, затем инкубировали при 37°С в течение 2 ч и четырежды промывали буфером для определения VCAM (по 200 мкл в каждую лунку). Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл мышиных антител к антителам интегрина (
1 человека (0,6 мкг/мл в буферном растворе для определения VCAM + 1 мг/мл БСА) и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После завершения указанного инкубационного периода все планшеты четырежды промывали буферным раствором для определения VCAM (по 200 мкл в лунку). Затем в каждую лунку добавляли соответствующее второе антитело, конъюгат пероксидазы хрена с козьими антителами к мышиному IgG (по 100 мкл в лунку, разбавление 1:800 буферным раствором для определения VCAM +1 мг/мл БСА), инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего трижды промывали буферным раствором для определения VCAM (по 200 мкл в каждую лунку). Развитие окрашивания инициировали добавлением по 100 мкл в каждую лунку красителя K-Blue (инкубация в течение 15 мин при комнатной температуре), окрашивание останавливали добавлением по 100 мкл в лунку буферного раствора Red Stop. Затем во всех планшетах измеряли поглощение на UV/Vis-спектрофотометре при 650 нм. Полученные результаты рассчитывали в виде % ингибирования максимального связывания (то есть VLA-4 + VCAM-1 в отсутствие тестируемого соединения). Результаты представлены в таблице I, где А=IC50<1нМ, В=IC50<10нМ.
| Таблица I | |
| Пример (№), в котором описано тестируемое соединение | Активность, определенная анализом связывания VLA-4/VCAM методом ИФА |
| 8 | А |
| 10 | В |
| 15 | В |
| 17 | В |
| 24 | А |
| 28 | А |
Пример В
Анализ по связыванию клеток Ramos(VLA-4) с иммобилизованным VCAM-1
Материалы
Растворимый рекомбинантный VCAM-1 человека (смесь 5- и 7-Ig доменов) выделяли из культуральной жидкости клеток СНО методом иммуноаффинной хроматографии и хранили в растворе, содержащем 0,1 М трис-глицин (рН 7,5), 0,1 М NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 0,02% NaN3 и 10 мкг/мл лейпептина. Кальцеин-АМ был получен на фирме Molecular Probes Inc.
Методика
Активность антагониста VLA-4 (интегрина 4
1) определяли в виде способности конкурировать с VLA-4 на клеточной поверхности за связывание с иммобилизованным VCAM-1, которую измеряли по адгезии клеток Ramos на VCAM-1. В клетки Ramos, экспрессирующие на поверхности VLA-4, вводят метку с использованием флуоресцентного красителя (кальцеина-АМ) и проводят связывание с VCAM-1 в присутствии или отсутствие тестируемого соединения. Снижение интенсивности флуоресценции (процент ингибирования), связанное с адгезивными клетками, соответствовало конкурентному ингибированию тестируемым соединением клеточной адгезии, опосредованной VLA-4.
Сначала на 96-луночные планшеты (фирма Nunc Maxisorp) в качестве «антигена-захвата» наносили рекомбинатный VCAM-1 человека (100 нг в 100 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, ФСБ), затем каждый планшет запечатывали и выдерживали при 4°С в течение приблизительно 18 ч. Планшеты, покрытые VCAM, дважды промывали 0,05% твин-20 в ФСБ и блокировали при комнатной температуре в течение 1 ч добавлением 200 мкл блокирующего буферного раствора (1% БСА/0,02% тимерозаль) для снижения неспецифического связывания. После инкубирования с блокирующим буферным раствором планшеты опрокидывали, промокали и остатки буферного раствора отсасывали. Затем каждый планшет промывали ФСБ (по 300 мкл), опрокидывали и остатки буферного раствора отсасывали.
Тестируемые соединения растворяли в 100% ДМСО и затем делали первое разведение 1:25 в буферном растворе для анализа адгезии клеток на VCAM (4 мМ CaCl2, 4 мМ MgCl2, в 50 мМ трис-HCl, рН 7,5) (конечная концентрация ДМСО составляла 4%). Для каждого соединения готовили серию из восьми разбавлении 1:4 (общий диапазон концентраций составлял 1 нМ - 12500 нМ). В каждую лунку плншета, покрытого VCAM, добавляли по 100 мкл раствора тестируемых соединений при каждом разбавлении, затем добавляли по 100 мкл суспензии клеток Ramos (в каждую лунку по 200000 клеток в 1% БСА/ФСБ). Планшеты, содержащие тестируемые соединения и клетки Ramos, инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин и затем в каждую лунку добавляли по 165 мкл ФСБ. Для удаления неадгезивных клеток планшеты переворачивали, промокали и в каждую лунку добавляли по 300 мкл ФСБ. Планшеты снова переворачивали, промокали и остатки буферного раствора осторожно отсасывали. В каждую лунку добавляли по 100 мкл буферного раствора для лизиса (0,1% SDS в 50 мМ трис-HCl, рН 8,5) и перемешивали на платформе ротационной качалки в течение 2 мин. В планшетах измеряли интенсивность флуоресценции с использованием системы для измерения флуоресценции Cytofluor 2300 (фирма Millipore) (возбуждение при 485 нм, испускание при 530 нм). Результаты представлены в таблице II, где А=IC50<100 нМ, В=IC50 <10000 нМ, С=IC50<5000 нМ.
| Таблица II | |
| Пример (№), в котором описано тестируемое соединение | Активность, определенная анализом адгезии клеток Ramos с VLA-4 на VCAM |
| 8 | В |
| 10 | В |
| 15 | С |
| 24 | В |
| 28 | С |
| 30 | В |
| 31 | В |
| 32 | В |
| 33 | А |
| 34 | В |
| 35 | В |
| 36 | А |
| 37 | В |
Пример С
Методика анализа альфа4-бета7
За две недели до дня анализа иммунопланшеты высокого связывания F96 Maxisorp фирмы Nunc, #442404 или #439454, покрывали реактивом MadCAM (0,25 мкг/мл) по 25 нг объемом 100 мкл в лунку. Планшеты покрывали герметичной крышкой, заворачивали в пленку саран и инкубировали в холодильнике в течение по меньшей мере 24 ч. В качестве буферного раствора для нанесения покрытия использовали 10 мМ карбонат/бикарбонатный буферный раствор, содержащий 0,8 г/л карбоната натрия и 1,55 г/л бикарбоната натрия, рН доводили 1н. HCl до 9,6.
Буферные растворы для анализа включают:
Буферный раствор для промывки: 0,05% твин 20 в ФСБ
Буферный раствор для блокирования: 1% обезжиренное сухое молоко в ФСБ
Буферный раствор для введения метки: ФСБ
Буферный раствор для клеток: среда RPMI 1640 (без добавок)
Буферный раствор для связывания:
1,5 мМ CaCl2
0,5 мМ MnCl2
50 мМ трис-HCl, NaOH добавляли по каплям до рН 7,5
доводили до необходимого объема водой
доводили до рН 7,5
Буферный раствор для разбавления: 4% ДМСО в буфере для связывания.
Планшеты дважды промывали буферным раствором для промывки и блокировали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч буферным раствором для блокирования. В некоторых случаях запечатанные планшеты блокировали в течение ночи в холодильнике. Затем планшеты промывали ФСБ и промокали вручную досуха. Остатки жидкости из лунок отсасывали.
Из исходной культуральной среды отбирали для анализа достаточное количество клеток RPMI 8866 (2×106 клеток /мл × 10 мл/планшет × число планшетов) и помещали в центрифужную пробирку. В пробирку добавляли ФСБ до определенного объема и центрифугировали при 200×g в течение 8 мин. Буферный раствор удаляли, клетки ресуспендировали в ФСБ (10×106 /мл) и добавляли исходный раствор кальцеина в ДМСО (5 мг/мл) в количестве 5 мкл/мл клеточной суспензии. Суспензию инкубировали в темноте при 37°С в течение 30 мин. Затем клетки промывали ФСБ и для культивирования при анализе ресуспендировали в буферном растворе для клеток при концентрации 2×106 клеток/мл.
Готовили исходный 25-кратный раствор (25х) тестируемых соединений (первое разбавление 1:25) в 100% ДМСО. Первое разбавление как стандарта, так и тестируемых соединений составляло 1:25 в прямом буферном растворе для связывания, однако остальные серийные разбавления готовили в буферном растворе для разбавления (буферный раствор для связывания/4% ДМСО). Концентрации исходных и разбавленных растворов тестируемых соединений определяли на основании ожидаемой активности.
Для анализа в первый ряд лунок добавляли по 129 мкл буферного раствора для связывания, а в остальные лунки по 100 мкл буферного раствора для разбавления. Аликвоту каждого соединения объемом 5,4 мкл добавляли пипеткой в помеченные лунки, по три повтора для каждого соединения. Затем соединения последовательно разбавляли вдоль планшета (34 мкл + 100 мкл = 4-кратное разбавление). Для контроля в неспецифические фоновые лунки (без клеток и без соединений) добавляли по 100 мкл буферного раствора для разбавления +100 мкл буферного раствора для клеток, а в лунки для определения максимального связывания (без соединения = 100% связывание) добавляли по 100 мкл буферного раствора для разбавления + 100 мкл клеток. В каждую лунку, содержащую соединение, добавляли суспензию меченых клеток (2×106 клеток/мл) по 100 мкл в лунку (= 2×105 клеток в лунку). Планшеты запечатывали и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 45 мин. После инкубирования несвязанные клетки удаляли, добавляя по 150 мкл ФСБ в лунку. Затем планшеты опрокидывали, промокали бумажным полотенцем и промывали, осторожно добавляя по 200 мкл ФСБ в лунки и снова промокали. Оставшийся буферный раствор осторожно отсасывали из лунок. Наконец, в каждую лунку добавляли по 100 мкл ФСБ.
В планшетах измеряли интенсивность флуоресценции с использованием системы для измерения флуоресценции Cytofluor 2300 (фирма Millipore) (возбуждение при 485 нм, испускание при 530 нм). Величину IC50 для каждого соединения определяли с использованием линейно-регрессионного анализа. Результаты представлены в таблице III.
| Таблица III | |
| Пример (№), в котором описано тестируемое соединение | Активность, определенная анализом связывания клеток RPMI с MadCAM (А=IC50<100 нМ, В=IC 50<10000 нМ, С=IC50<5000 нМ) |
| 30 | В |
| 31 | В |
| 32 | В |
| 33 | А |
| 34 | В |
| 35 | С |
| 36 | В |
| 37 | В |
Класс C07D213/64 в положении 2 или 6
Класс A61P29/00 Анальгетики нецентрального действия, жаропонижающие или противовоспалительные средства, например противоревматические средства; нестероидные противовоспалительные средства (НПВС)
