способ создания модели сегментарного остеонекроза мыщелков, составляющих коленный сустав у животных

Формула изобретения

Способ создания модели сегментарного остеонекроза мыщелков, составляющих коленный сустав у животных, включающий ежедневное параартикулярное введение адреналина, отличающийся тем, что крысе с возрастным остеопорозом и ренальной остеодистрофией в течение 6 недель вводят ежедневно в параартикулярные ткани 0,2 мл 0,1%-ного раствора адреналина и два раза в неделю внутрисуставно под надколенник 0,12 мг метилпреднизолона.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для воспроизведения модели создания сегментарного остеонекроза (асептического некроза) мыщелков, составляющих коленный сустав при испытании различных способов лечения и средств профилактики остеонекроза.

В подавляющем большинстве известных экспериментальных исследований моделировался остеонекроз головки бедренной кости.

В.Н.Дудинов (1975) добивался полной аваскуляризации эпифиза бедренной кости у собак, пересекая сосуды, идущие под синовиальной оболочкой вдоль шейки бедренной кости, резецируя связку головки и разрушая губчатую кость внутри шейки через отверстие в ее среднем отделе (Дудинов В.Н. Влияние нагрузки на изменение формы головки бедренной кости при аваскулярном некрозе // Ортопед., травматол. - 1975. - №2. - С.59-63).

Недостатком методики является то, что исследуемый сустав подвергается травматическому оперативному вмешательству. Поэтому последующие лечебные и профилактические мероприятия будут проводиться на суставе, имеющем тяжелые повреждения, и должны быть направлены не только на коррекцию изменений в очаге некроза, но и на восстановление сустава в целом. Исход мероприятий по лечению и профилактике остеонекроза в данном случае будут зависеть от процессов реваскуляризации и регенерации костной ткани в зоне травматического повреждения. Применение данной методики приводило к полной аваскуляризации и крупноочаговому остеонекрозу эпифизарной зоны, а не к сегментарному некроз субхондральной кости, наблюдаемому в клинике. Поэтому на модели невозможно испытание методов оперативного замещения костно-хрящевого фрагмента в очаге некроза.

Известен способ создания модели остеонекроза эпифизов, нарушая артериальное кровоснабжение кости путем создания искусственного тромбоза внутрикостных сосудов. Тромбоз создавался введением в главную артерию, питающую кость, 50% суспензии тонкодисперсного металлического серебра в 2% растворе стерильной желатины до полной ее закупорки (Стецула В.И., Штин В.П. Экспериментальные асептические некрозы плечевых костей у собак // Ортопед., травматол. - 1963. - №7. - С.74; Стецула В.И., Талько И.И., Кривенко В.М. Экспериментальное обоснование применения химотрипсина при лечении асептического некроза костей // Ортопед., травматол., 1973. - №1. - С.72-74).

Недостатком вышеприведенной методики является то, что в результате тромбоза магистральной артерии, питающей кость, помимо крупноочагового остеонекроза эпифизов наблюдается некроз костного мозга и костной ткани диафиза. Результаты последующих испытаний лечебных и профилактических методик будут извращены наличием гранулематозной воспалительной реакцией на инородный материал, возникающей в костной ткани при введение металлического серебра в артерию, питающую кость.

Наиболее близким к заявленному и взятым в качестве прототипа является способ моделирования асептического некроза проксимального эпифиза бедренной кости, предложенный С.С. Беренштейном. Автор добивался создания зоны хронической ишемии с последующим развитием остеонекроза головки бедренной кости у кроликов ежедневным введением в параартикулярные ткани 0,1-0,3 мл 0,1% адреналина через 6 часов в течение 20-30 дней (Беренштейн С.С. Способ моделирования асептического некроза головки бедренной кости // Ортопед., травматол. -1993. - №2. - С.35-36; Описание изобретения к патенту Российской федерации RU 2009547 С1, 15.03.1994). Недостатком метода является развитие крупноочагового остеонекроза эпифиза, что не соответствует требованиям исследователей, испытывающих способы костно-пластического замещения дефекта суставной поверхности, формируемого в поздних стадиях заболевания.

Применение данной методики для создания модели сегментарного остеонекроза в мыщелках, составляющих коленный сустав у крыс, не привело к ожидаемому результату. На 30-56 день у них наблюдалось лишь обеднение костного мозга и определяемое гистоморфометрически статистически недостоверное уменьшение объема костной ткани эпифизов, что свидетельствует о развитии хронической ишемии. Однако ни в одном из наблюдаемых случаев не было выявлено некроза костных структур эпифизов.

Учитывая анализ клинического материала, из которого следует, что заболевание данной локализации чаще возникает в пожилом возрасте на фоне хронической сосудистой недостаточности и смешанных остеопатий, обусловленных наличием сопутствующей патологии внутренних органов и эндокринных нарушений, а также предшествующего внутрисуставного введения кортикостероидов, сделано предположение о полиэтиологичности асептического некроза мыщелков, составляющих коленный сустав.

Поэтому для моделирования остеонекроза были отобраны старые белые крысы (в возрасте 2 лет) весом 180-200 г, которым за 6 месяцев до эксперимента была спровоцирована хроническая почечная недостаточность путем левосторонней нефрэктомии и электрокоагуляции 25% коркового вещества правой почки (Гавришева НА., Федулов А.В., Анисимова Л.О., Кованько Г.В. Характеристика течения ренальной остеодистрофии в ходе развития экспериментальной хронической почечной недостаточности с оригинальной методикой моделирования // Нефрология. - 2002. Т.6, N4. - С.79-83). При этом у животных отмечались начальные признаки нарушения кальциевого обмена, проявляемые повышением креатинина плазмы крови до 0,08±0,01ммоль/л (N 0,046±0,004), снижением активности щелочной фосфатазы до 0,029±0,003 мкмоль/л (N 0,047±0,004) и содержания ионизированного кальция сыворотки крови до 0,57±0,51 мкмоль/л (N 1,62±0,36). В костной ткани выявлялись начальные признаки ренальной остеодистрофии в виде неравномерности окрашивания, истончения и расщепления трабекул.

Результатом воспроизведения модели сегментарного остеонекроза мыщелков, составляющих коленный сустав, используемой при испытании различных способов и средств профилактики и лечения асептического некроза мыщелков, составляющих коленный сустав, достигается за счет того, что подопытным животным со смешанной остеопатией (возрастным остеопорозом и ренальной остеодистрофией) в течение 6 недель вводили ежедневно в параартикулярные ткани 0,2 мл 0,1% раствора адреналина и 2 раза в неделю внутрисуставно под надколенник - по 0,12 мг метилпреднизолона.

Преимуществом данного способа моделирования остеонекроза является полиэтиологичность экспериментально созданного патологического процесса, а также получение очагового некроза костной ткани мыщелков, составляющих коленный сустав, наиболее часто встречающегося в клинической практике.

Контрольной группе животных внутрисуставно и в параартикулярные ткани вводили физиологический раствор в том же объеме и с той же частотой. Контрлатеральный коленный сустав также служил контролем. Суставы обрабатывались антисептиком до и после инъекций.

Экспериментально исследовалось количество введения адреналина. Увеличение дозы адреналина до 0,3 мл вызывало у животных общую реакцию в виде тахиаритмии, тахипное, расширения зрачков, что считалось нежелательным. Применением 0,1% адреналина в объеме 0,2 мл нами достигалась цель создания очага хронической ишемии, о чем свидетельствовало понижение локальной температуры в области исследуемого сустава при отсутствии изменений общего состояния животных. Место введения адреналина не имело существенного значения и не влияло на конечный результат.

Дозировка метилпреднизолона соответствовала предлагаемой для внутрисуставного введения препарата в расчете на килограмм веса (0,3-0,6 мг/кг). В пересчете на массу крысы средняя доза метилпреднизолона, вводимого внутрисуставно, составила 0,12 мг.

Все манипуляции проводили в соответствии с «Правилами гуманного обращения с лабораторными животными».

В течение всего срока проведения эксперимента наблюдали за поведением животных, степенью их активности и весом. По окраске кожи, пальпаторно и по реакции животного определяли болезненность мягких тканей и наличие признаков воспаления в конечности, на которой проводились манипуляции. Сравнивалось изменение локальной температуры в исследуемом суставе по сравнению с контрлатеральным. Для определения температуры использовался бесконтактный термометр фирмы «Астрон».

При обработке данных, полученных в результате эксперимента, использовались клинический, рентгенологический и морфологический методы исследования.

Рентгенологическое обследование проводилось до начала эксперимента и после выведения животных из эксперимента через 2, 4, 6, 8 недель с увеличением в 8 раз.

Из эксперимента животных выводили на 3-и, 7-е сутки, 2-ю, 4-ю, 6-ю и 8-ю неделю наблюдения. Эвтаназию производили в соответствии с «Правилами гуманного обращения с животными» путем внутрибрюшинного введения анестетиков в летальной дозе (450 мг/кг 2% раствора гексенала).

Пример 1 (опыт). Крыса №118.

Возраст крысы 2 года, вес 200 г. За 6 месяцев до начала эксперимента крысе произведено удаление правой и повреждение левой почки. На предварительном рентгенологическом исследовании выявлен остеопороз. В биохимическом анализе крови наблюдалось повышение коеатинина до 0,085 ммоль/л, щелочной фосфатазы до 0,003 мкмоль/л, кальция до 0,62 мкмоль/л. Ежедневное параартикулярное введение 0,2мл 0,1% адреналина и внутрисуставное введение 0,12 мг (0,15 мл 0,08% р-ра) метилпреднизолона 2 раза в неделю начато 12.05.03. С первых суток и на протяжении всего срока наблюдения у крысы выявлялась локальная гипотермия сустава, на котором проводились манипуляции, по сравнению с контрлатеральным. Эвтаназия произведена через 4 недели.

Пример 2 (контроль). Крыса №249.

Возраст крысы 2 года, вес 190 г. На предварительной рентгенограмме остеопороз менее выражен. В биохимическом анализе крови показатели содержания креатинина (0,05ммоль/л), щелочной фосфатазы (0,048 мкмоль/л) и кальция (1,67 мкмоль/л) соответствуют норме. Ведение физраствора ежедневно параартикулярно в объеме 0,2 мл и внутрисуставно в объеме 0,15 мл через день начато 12.05.03. Изменения локальной температуры сустава, на котором проводились манипуляции, по сравнению с контрлатеральным не наблюдалось. Эвтаназию производили через 4 недели.

Для гистологического исследования забирался блок тканей, составляющих коленные суставы.

Гистологические препараты фиксировались в 10% растворе нейтрального формалина, декальцинировались в растворе нейтрального трилона Б. После традиционной проводки и заливки в парафин срезы толщиной 7 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, альциановым синими пикрофуксином по ван Гизон.

При гистологическом исследовании тканей, составляющих коленный сустав, как в контрольной, так и в опытной группах животных признаков механического повреждения капсулы, связанного с внутрисуставным введением растворов в объеме 0,15 мл, не было обнаружено.

На третьи сутки после начала эксперимента в опыте наблюдалось очаговое обеднение костного мозга внутренних эпифизов бедренной и большеберцовой костей миелоидными элементами. Соответственно биомеханике движений крыс внутренние мыщелки бедренной и большеберцовой костей у них являются наиболее нагружаемой зоной.

Через 7 дней во внутреннем эпифизе бедренной и большеберцовой костей наблюдался сегментарный некроз миелоидного костного мозга, замещающийся в демаркационной зоне молодой грануляционной тканью (фиг.1).

Спустя 2 недели после начала эксперимента в сегментах внутренних мыщелков бедренной и большеберцовой костей выявлялось исчезновение остеоцитов в костных балках. В зоне, пограничной с неповрежденной костью, наблюдались остеокластическая резорбция некротизированных балок и признаки слабовыраженной репаративной регенерации в виде появления остеоидных наслоений на поверхности трабекул и островков остеогенеза в межбалочном пространстве (фиг.2).

Через 3 недели после начала эксперимента суставной хрящ над очагами остеонекроза, локализованными в нагружаемых мыщелках бедренной и большеберцовой костей, был пролабирован с крупными бесклеточными участками. Некротизированные костные балки с большим количеством микротрещин располагались среди аморфных белковых масс. В демаркационной зоне новообразованные слабообизвествленные костные балки сливались друг с другом. В очагах сегментарного остеонекроза, сформированных в менее нагружаемых наружных мыщелках, выявлялась активная репаративная регенерация костной ткани (фиг.3). До 4 недель отчетливых рентгенологических признаков изменения структуры костной и хрящевой ткани мыщелков, составляющих коленный сустав, не выявлялось.

На 4 неделе наблюдения на рентгенограммах отмечалось нарастание остеопороза, выявилась деформация суставных поверхностей мыщелков бедренной и большеберцовой костей с наличием сегментарных очагов гомогенного затемнения в эпифизарной зоне.

Гистологически при локализации патологического процесса во внутренних мыщелках бедренной и большеберцовой костей наблюдалась фрагментация суставного хряща и костной ткани в очаге некроза, отграниченного от прилежащей кости зоной остеосклероза (фиг.4). На суставной поверхности вне очага повреждения хрящ был неравномерно истончен с нарушенной зональностью строения и трещинами. При наличии очагов сегментарного остеонекроза в менее нагружаемых наружных мыщелках бедренной и большеберцовой костей, на поверхности погибших трабекул определялись массивные наслоения новообразованных сливающихся друг с другом костных структур (фиг.5).

Через 6-8 недель на рентгенограммах и гистологически выявлялась картина выраженного гонартроза. При локализации очага сегментарного некроза костной ткани во внутренних мыщелках бедренной и большеберцовой костей на его месте формировался кратероподобный дефект суставной поверхности, дно которого было представлено склерозированной костной тканью (фиг.6).

При локализации участков сегментарного остеонекроза в ненагружаемых наружных мыщелках бедренной и большеберцовой костей наблюдалось восстановление костной ткани в очаге повреждения с признаками компактизации костных структур. При этом наблюдалась деформация суставной поверхности поврежденного мыщелка с замещением гиалинового хряща над очагом остеонекроза фиброзно-хрящевой тканью.

В контрольной группе животных, которым в сустав и периартикулярные ткани вводился физраствор, выведение животных из опыта проводилось в те же сроки. Рентгенологических и гистологических признаков остеонекроза и остеоартроза не выявлялось.

В эксперименте доказана полиэтиологичность заболевания, а также достигнуто формирование сегментарного остеонекроза мыщелков, составляющих коленный сустав, вызванного на фоне возрастного остеопороза и ренальной остеодистрофии ежедневным введением в параартикулярные ткани 2 мл 0,1% адреналина и внутрисуставным введением 0,12 мг метилпреднизолона 2 раза в неделю. Признаки, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что изменения, соответствующие ранней стадии остеонекроза, выявляются спустя 2 недели после начала эксперимента, а через 6-8 недель наблюдается гистологическая картина, соответствующая его поздней стадии. Таким образом, параартикулярное введение адреналина и внутрисуставное введение метилпреднизолона крысам с возрастным остеопорозом и ренальной остеопатией может служить для создания сегментарного остеонекроза коленного сустава.

На момент подачи заявки нам не известна такая или идентичная методика моделирования остеонекроза, что позволяет считать предлагаемый способ отвечающим критерию «новизна».