способ получения антигенных агрегатов и их применение в препаратах

Формула изобретения

1. Способ получения высокоиммуногенных агрегированных антигенных структур, который предусматривает следующие стадии:

A) селекция интересующих антигенов;

B) добавление одного или нескольких антигенов смеси в среду, способствующую процессу агрегации, содержащую такие средства, как химические агенты, окислители или другие вызывающие агрегацию компоненты;

C) инкубация смеси в течение от 24 ч до семи суток при 28°С;

D) отбор агрегатов частиц, характеризующихся размером от 30 до 500 нм, в соответствии со способом, который позволяет осуществлять задержку молекул данных размеров, таким, как гель-фильтрация, ультрафильтрация и диализ.

2. Способ по п.1, характеризующийся присутствием среди антигенов, являющихся частью структур, полученных на стадии (В), липопротеина, липопептида или липидного антигена любого вирусного, бактериального, одноклеточного или многоклеточного патогенного организма.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем фактом, что антиген, являющийся частью структур, полученных на стадии (В), представляет собой поверхностный антиген вируса гепатита В с образованием агрегата, объединенного только данным антигеном.

4. Способ по п.1, характеризующийся присутствием среди антигенов, являющихся частью структур, полученных на стадии (В), двух или более гомологичных или гетерологичных антигенов, способных к агрегации с поверхностным антигеном вируса гепатита В за счет гидрофобных или ковалентных взаимодействий с образованием агрегатов различных антигенов.

5. Способ по п.1, характеризующийся присутствием среди антигенов, являющихся частью структур, полученных на стадии (В), нуклеокапсида вируса гепатита В и поверхностных антигенов вируса гепатита В.

6. Способ по п.1, характеризующийся присутствием среди антигенов, являющихся частью структур, полученных на стадии (В), нуклеокапсида вируса гепатита С и поверхностных антигенов вируса гепатита В.

7. Способ по п.1, характеризующийся присутствием среди антигенов, являющихся частью структур, полученных на стадии (В), нуклеокапсида вируса иммунодефицита человека типов 1 или 2 и поверхностных антигенов вируса гепатита В.

8. Способ по п.1, характеризующийся присутствием среди антигенов, являющихся частью структур, полученных на стадии (В), белков наружной мембраны Neisseria meningitidis и поверхностных антигенов вируса гепатита В.

9. Способ по п.1, характеризующийся присутствием -циклодекстринов среди компонентов, являющихся частью среды, где становятся ассоциированными антигены на стадии (В).

10. Способ по п.1, характеризующийся наличием концентраций солей аммония, составляющих от 10 до 50 мМ, среди компонентов, являющихся частью среды, где становятся ассоциированными антигены на стадии (В), усиленных солями металлов меди, или железа, или другими, с той же целью агрегации.

11. Способ по п.1, характеризующийся присутствием антигенов с очевидной способностью к агрегации, таких, как HBcAg и других вирусных нуклеокапсидных антигенов со способностью активировать спонтанную агрегацию, среди компонентов, являющихся частью среды, где становятся ассоциированными антигены на стадии (В).

12. Способ по п.1, характеризующийся присутствием гидрофобных антигенов, таких, как производные вирусных поверхностных антигенов, производные бактериальных наружных мембран или липидов, со способностью активировать спонтанную агрегацию HBsAg среди компонентов, являющихся частью среды, где становятся ассоциированными антигены на стадии (В).

13. Способ по п.1, характеризующийся присутствием частично или полностью гидрофобных адъювантов со способностью активировать спонтанную агрегацию HBsAg среди компонентов, являющихся частью среды, где становятся ассоциированными антигены на стадии (В).

14. Способ по п.1, характеризующийся присутствием химических соединений любой природы, способных улучшать агрегацию HBsAg или его же с другими химическими структурами за счет гидрофобности, ковалентной или электростатической связи, среди компонентов, являющихся частью среды, где становятся ассоциированными антигены на стадии (В).

15. Способ по п.1, характеризующийся таким временем инкубации на стадии (С), которое может составлять от 10 мин до одной недели в зависимости от выбранного способа агрегации.

16. Способ по п.1, характеризующийся селекцией агрегатов частиц размером от 30 до 500 нм на стадии (D) путем гель-фильтрации, диализа, ультрафильтрации или другого способа, обеспечивающего удержание молекул указанных размеров от 30 до 500 нм.

17. Способ по п.1, характеризующийся продукцией препаратов из смеси выбранных антигенных структур по стадии (С) с адъювантом по выбору, который может представлять собой алюминиевые квасцы или соли кальция, масляный или другой коммерчески используемый адъювант, и также могут быть добавлены другие антигены, стабилизирующие или консервирующие вещества.

18. Агрегированная антигенная структура, состоящая из частиц размером от 30 до 500 нм, полученная в соответствии с п.1, которая способствует усилению иммуногенности получаемого препарата и дифференциальному распознаванию иммунной системой.

19. Агрегированная антигенная структура по п.18, характеризующаяся тем, что антиген, содержащийся в агрегатах, представляет собой поверхностный антиген вируса гепатита В.

20. Агрегированная антигенная структура по п.18, характеризующаяся тем, что она может содержать два или более агрегированных антигенов.

21. Агрегированная антигенная структура по п.18, характеризующаяся тем, что антигены могут представлять собой смесь HBsAg и других гидрофобных корпускулярных антигенов.

22. Агрегированная антигенная структура по п.21, характеризующаяся тем, что антигены могут представлять собой смеси HBs- и НВс-антигенов.

23. Агрегированная антигенная структура по п.21, характеризующаяся тем, что антигены могут представлять собой смеси HBsAg и антигенов нуклеокапсида HCV.

24. Агрегированная антигенная структура по п.21, характеризующаяся тем, что антигены могут представлять собой смеси HBsAg и нуклеокапсидных антигенов HPV, HCV и ВИЧ-1 и -2.

25. Агрегированная антигенная структура по п.21, характеризующаяся тем, что антигены могут представлять собой смеси HBsAg и поверхностных антигенов других вирусов.

26. Агрегированная антигенная структура по п.21, характеризующаяся тем, что антигены могут представлять собой смеси HBsAg и гидрофобных адъювантов.

27. Агрегированная антигенная структура по п.21, характеризующаяся тем, что антигены могут представлять собой смеси HBsAg и вирусных или бактериальных антигенов и их производных.

28. Агрегированная антигенная структура по п.21, характеризующаяся тем, что антигены могут представлять собой смеси HBsAg и гидрофобных адъювантов.

29. Агрегированная антигенная структура по п.18, характеризующаяся агрегированными структурами, содержащими одну вирусную или вирусоподобную частицу, привязанную к другому корпускулярному белку или адъюванту.

30. Применение антигенной структуры по пп.18-29 в профилактических и терапевтических вакцинах.

31. Вакцинный препарат для системного введения или нанесения на слизистые оболочки, содержащий антигенную структуру по любому из пп.18-29, а также адъюванты, стабилизирующие или консервирующие вещества.

32. Применение вакцинных препаратов по п.31 для профилактики инфекционных заболеваний.

33. Применение вакцинных препаратов по п.31 для лечения хронических инфекционных заболеваний.

Описание изобретения к патенту

Описание

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к применению новых вакцинных препаратов.

Технической целью предложенного изобретения является разработка способа получения агрегированных антигенных структур и их препаратов, способных усиливать иммуногенность настоящих антигенов, введенных системным путем или через слизистые оболочки.

Способ, описанный по настоящему изобретению, генерирует антигенные агрегированные структуры собранных в частицы антигенов, добавление других антигенов, компонентов с агрегирующими, делипидирующими или окисляющими характеристиками, последующую селекцию агрегированных частиц размером от 30 до 500 нм, и препараты данных агрегатов с добавлением общепринятых адъювантов, способствующих иммуногенности полученной в результате иммуногенной композиции.

Поскольку HBsAg является эффективным иммуногеном, он был первым вакцинным кандидатом для широкого применения у человека и представлял собой первую лицензированную рекомбинантную вакцину против гепатита В для универсального применения. Белки HBsAg самособираются в частицы размером 22 нм (Heerman КН, Gerlich WH, 1991, Surface protein of Hepatitis В virus. A. McLachlan, ed. CRC Press, Boca Raton, Ann Harbor, Boston London, p.109). Молекулярная, клеточная и генетическая основа иммунного ответа на HBsAg интенсивно исследована на мышиной модели (Milich, DR. 1987. Genetic and molecular basis for T- and B-cell recognition of hepatitis В viral antigens. Immunol Rev. 99: 71). В прошлом было исследовано, как вариации физико-химических свойств поверхностного антигена влияют на его иммуногенность для Т-клеток, рестрицированных по МНС I класса. Было доказано, что эффективный ответ CTL, рестрицированный по МНС I класса, генерировался инъекцией только одной низкой дозы собранного в частицы размером 22 нм нативного антигена или денатурированных детергентом мономеров без адъювантов (Schirmbeck, R. et al. 1994. Eur J Immunol. 24: 1088). Также была исследована иммуногенность препарата агрегатов поверхностного антигена HBV, полученных путем тепловой денатурации с образованием частиц с диаметром, приблизительно равным 1 мкм.

Тип процессинга антигена in vivo имеет фундаментальное влияние на эффективность первичного Т-клеточного ответа, а также на спектр субклассов участвующих Т-клеток. В презентации пептидов МНС, вероятно, задействованы CD4+ Т-клетки, рестрицированные по МНС II класса, и CD8+ Т-клетки, рестрицированные по МНС I класса (Germain, RN et al. 1993 Annu Rev Immunol. 11: 403). Был описан новый эндосомальный путь процессинга экзогенных частиц HBsAg для представления эпитопов, рестрицированных по МНС I класса. Процессинг денатурированных нагреванием экзогенных частиц HBsAg диаметром 1 мкм происходит в макрофагах, но не в клетках других типов, и сопровождается выбросом антигенных пептидов из процессирующих макрофагов. Данный процесс генерирования экзогенных антигенных пептидов, рестрицированных по МНС I класса, был экспериментально смоделирован как фагоцитарный путь. Нативные частицы HBsAg размером 22 нм в основном процессируются в эндоцитарных, а агрегаты размером 1 мкм - в фагоцитарных путях. Помимо различного процессинга in vitro двух данных экзогенных препаратов HBsAg, их иммуногенность in vivo для CTL I класса заметно различалась при их введении без адъюванта. Нативная частица HBsAg была сильно иммуногенной, в то время как денатурированные агрегаты поверхностного антигена были слабо иммуногенны (Schirmbeck, R. et al. 1995. J Immunol. 155: 4676-4684).

Другие исследования, выполненные с использованием поляризации флуоресценции, указывают на то, что частица HBsAg организована в липидный бислой, который взаимодействует с белковыми агрегатами (Sonveaux N. 1995. Res Virol 146(1): 43-51).

Обработка HBsAg хлороформом-метанолом (2:1, об./об.) с 50% 1,1',3,3'-тетраметилмочевиной не влияла на морфологическую целостность частицы (они сохраняли свой средний диаметр), хотя большая часть их липидов высвобождалась. Антигенность и композиция полипептидов HBsAg не изменялись после делипидации (Neurath AR et al. 1978. Intervirology 10(5): 265-75).

С учетом того, что агрегаты частиц не продуцируются в стрессовых условиях процесса получения, таких как присутствие хаотропных средств, умеренные температуры и высококонцентрированные растворы, источник агрегатов частиц рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В исследовали с использованием комбинации способов иммуноаффинной хроматографии и гель-фильтрации. Исследование факторов, приводящих к уширению основания пика, соответствующего HBsAg, при гель-фильтрации, продемонстрировало существование агрегатов частиц, в дополнение к вариабельности размеров частиц HBsAg (Tieugabulova D. 1998 J Chromatogr В Biomed Sci Appl. 707(1-2):267-73, Tieugabulova D. 1997 Chromatographia 45: 317-320). В результате получали агрегированный антиген во фракции, соответствующей крупным агрегатам частиц, а не во фракции, где обнаруживали нативный HBsAg; еще один результат данной статьи подтверждает, что агрегаты образованы частицами размером 22 нм, мигрирующими в виде мономеров и димеров при SDS-PAGE, так же, как и правильно свернутый поверхностный антиген (Tleugabulova D. 1998 J Chromatogr В Biomed Sci Appl. 25; 716(1-2): 209-19).

Описание изобретения

Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения агрегированных антигенных структур с более высокой иммуногенностью, чем у исходных по отношению к ним антигенов. Указанный способ включает следующие стадии:

A) Селекция интересующих антигенов;

B) Добавление одного или нескольких антигенов в смеси в среду, улучшающую процесс агрегации, причем указанная среда может состоять из химических агентов, окислителей или других компонентов со способностью вызывать агрегацию.

C) Инкубация смеси.

D) Отбор агрегата частиц, характеризующегося размером от 30 до 500 нм, по способу, позволяющему осуществлять задержку молекул данных размеров, такому как гель-фильтрация, ультрафильтрация и диализ.

Е) Получение препаратов путем смешивания выбранных на стадии (С) антигенных структур путем добавления адъюванта по выбору и также возможного добавления других антигенов, стабилизаторов и консервантов.

По способу настоящего изобретения могут быть получены некоторые агрегаты, которые содержат только поверхностный антиген HBV, также включая комбинации поверхностного антигена и других липопротеиновых, липопептидных или липидных гомологичных или гетерологичных антигенов из любого вирусного, бактериального, одноклеточного или многоклеточного патогенного организма.

По способу изобретения антигены, которые являются частью структур, полученных на стадии (В), могут добавляться к поверхностному антигену вируса гепатита В путем гидрофобных, электростатических или ковалентных взаимодействий с образованием агрегатов разных размеров.

Способ получения антигенных структур позволяет агрегировать нуклеокапсидные антигены гепатита В, С или ВИЧ с поверхностным антигеном вируса гепатита В; также могут быть агрегированы антигены из вирусов и бактерий, такие как инактивированный вирус или белки наружной мембраны таких патогенных бактерий, как Neisseria meningitidis.

Для получения агрегированных антигенных структур могут использоваться -циклодекстрины в качестве химических средств, способствующих делипидированию, мембранной ассоциации и агрегации настоящих частиц; другими химическими агентами являются соли аммония в концентрациях от 10 до 50 мМ, усиленные металлическими солями меди и железа, и другие средства, способствующие агрегации.

Другими компонентами по данному способу, характеризующимися спонтанной агрегационной активностью, подлежащими использованию для данной цели вместе или по отдельности, являются гомологичные или гетерологичные антигены, которые подтверждают агрегационную активность HBsAg; примерами их являются антигены вирусных нуклеокапсидов и также производные бактериальных наружных мембран или вирусные оболочки из липопротеина или гидрофобной природы. Также было обнаружено, что адъюванты той же природы способствовали агрегации HBsAg и агрегации HBsAg с ними самими.

В общем, способ по настоящему изобретению позволяет осуществляться агрегации HBsAg или агрегации HBsAg с другими антигенами или адъювантами путем развития гидрофобных взаимодействий, электростатических или ковалентных связей с периодами инкубации, изменяющимися от 10 минут до одной недели, в зависимости от выбранных составляющих.

Разделение агрегатов осуществляется по способам разделения молекул по размерам, среди которых гель-фильтрация, диализ, ультрафильтрация и другие способы, позволяющие задержку молекул с размерами от 30 до 500 нм.

Настоящими заявителями также показано, что хотя возможно генерировать агрегаты размером около 1 микрометра неденатурирующими способами (максимальная температура 28°С), сходные с теми, что были получены Ширмбеком (Schirmbeck, R. et al. 1995. J Immunol. 155: 4676-4684), они остаются менее иммуногенными при оценке гуморального ответа и DTH. Только агрегаты частиц размером от 30 до 500 нм, дополненные алюминиевыми квасцами, продемонстрировали продукцию существенно более высоких концентраций IgG, чем под контролем нативного антигена, кроме того, они показали существенное усиление ответов DTH и IgG2a. Все это подтверждает важность дальнейшей селекции антигена путем гель-фильтрации. Причина данного проявления может быть связана с различной презентацией и/или с различным процессингом интересующего антигена или антигенов.

Более того, способ по настоящему изобретению предполагает адсорбцию полученных в результате структур на такие адъюванты, как алюминиевые квасцы или соли кальция, масляные или другие коммерчески применяемые адъюванты. Также к конечному препарату могут быть добавлены другие антигены и стабилизирующие и консервирующие вещества.

Другим объектом настоящего изобретения является агрегированная антигенная структура, полученная по описанному ранее способу, которая способствует повышению иммуногенности полученного в результате препарата и изменению распознавания вовлеченных эпитопов иммунной системой. Указанные агрегированные антигенные структуры характеризуются наличием поверхностного антигена вируса гепатита В, отдельно или в комбинации с другими антигенами, образующими агрегат. Данные другие антигены представляют собой липопротеины или гидрофобные вещества, в число которых входит HBsAg, обладающие, кроме того, внутренним свойством поддерживать агрегированное состояние за счет гидрофобных связей между ними. Другие гидрофобные антигены вирусного капсида и липопротеиновые антигены проявляли данную способность, в их число входит нуклеокапсидный антиген вируса гепатита С, человеческий папилломавирус и ВИЧ 1 и 2, и, кроме того, наружная мембрана N. meningitidis в виде протеолипосомных везикул и некоторые вирусные оболочечные антигены.

Среди антигенных структур к объектам настоящего изобретения относятся ассоциации HBsAg с гидрофобными адъювантами, которые могут являться частью агрегата, полученного по тому же способу, что описан ранее. В основном относящийся к антигенным структурам объект настоящего изобретения может быть получен путем агрегации по крайней мере одной, двух или более гидрофобных частиц по описанному способу и по крайней мере одного вещества с корпускулярными свойствами и должен визуализироваться путем электронной микроскопии, как описано в примерах. Агрегация данных структур способствует иммуномодуляции, измененному распознаванию и усилению иммуногенности в общем смысле. Имея в виду данные характеристики относящегося к антигенным структурам объекта настоящего изобретения, можно применять их для рационального конструирования профилактических и терапевтических человеческих и ветеринарных вакцин, вводимых системным путем или через слизистые оболочки, и использовать их для диагностических систем.

Среди преимуществ новых препаратов, являющихся результатом применения способа получения антигенов данного типа, обнаружены следующие: повышение иммуногенности, способность совместно улавливать во время агрегации новые адъюванты, иммуномодуляторы и антигены.

Препараты, являющиеся результатом способа по настоящему изобретению, в зависимости от пути введения и вида, подлежащего иммунизации, могут применяться в объемах от 0,01 вплоть до 10 мл, и дозы антигена могут варьировать от 0,001 до 1 мг в конечном вакцинном препарате.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение вакцинных препаратов агрегатов поверхностного антигена вируса гепатита В, образованных путем использования циклодекстринов.

Частицы получали из нативного антигена размером 22 нм путем контролируемой обработки антигена химическими соединениями с активностью в плане удаления из частицы липидов; в данном случае применяли циклодекстрины в концентрациях, превышающих 1 мг/мл. В зависимости от их концентрации время инкубации варьировало от 24 часов до 7 суток. Температура инкубации, применяемая при данном анализе, составляла 28°С, хотя наблюдали, что при более высоких или более низких температурах также возможно получение агрегатов. Температура является фактором, способствующим процессу частичного делипидирования путем окисления и удаления липидов. Позже различные агрегаты анализировали путем гель-фильтрации и электронной микроскопии, обнаруживая размеры, которые изменялись от десятков нанометров до частиц, которые оседали вследствие их большого размера. После центрифугирования с целью элиминации осажденных остатков выбирали антиген в зависимости от его размеров для иммунологических анализов, которые продемонстрировали сниженный уровень липидов относительно уровня белков. Путем ВЭЖХ было показано, что данные агрегаты характеризовались высокой стабильностью во время хранения. Контролируемая обработка антигена -циклодекстринами в концентрации 5-100 мг/мл в течение 1-240 часов при температуре, варьирующей от 20 до 37°С, позволяет получить интервал размеров, который дает возможность для последующего выбора времени элюции для иммунохимического анализа.

После этого агрегированный антиген адсорбировали на алюминиевые квасцы в конечной концентрации от 0,002 до 0,1 мг/мл и использовали в анализах иммуногенности.

В одном из вариантов инкубации с циклодекстринами с разными периодами и температурами инкубации используется добавление иммуномодуляторных соединений, таких как липополисахариды и сапонины, которые являются частью конечного агрегата, адсорбированного на алюминиевые квасцы для получения конечного вакцинного препарата.

Пример 2. Получение вакцинных препаратов агрегатов поверхностного антигена вируса гепатита В с использованием окислителей.

При добавлении к обычному антигену окисляющих химических веществ было возможным осуществление делипидирования в контролируемое время с использованием тех же температурных и концентрационных условий, что и с циклодекстринами. Соли, такие как персульфат аммония в концентрации от 9 до 44 мМ, способствовали образованию делипидированного антигена, исходя из частиц антигена размером 22 нм, при увеличении размера за счет слияния частиц. Оптимальные размеры были отобраны путем гель-фильтрации. Адъювантную адсорбцию осуществляли на алюминиевые квасцы.

Пример 3. Получение вакцинных препаратов надкорпускулярных химических структур, образованных путем изменения условий инкубации дрожжей

Частицы были получены из природного источника из штамма дрожжей Picchia pastoris, антиген выбирали во время процесса очистки по его физико-химическим характеристикам. Способ продукции антигена включал длительное время культивирования, превышающее 100 часов, и условия окислительного стресса. Данный способ сделал возможным то, что часть антигена осталась в своем нативном состоянии с размером частиц, но значимая группировка становится агрегированной и делипидированной за счет усиления внутриклеточного окисления, что было продемонстрировано анализом липидов и белков, сделанным для образцов, соответствующих различным пикам гель-фильтрации. Наконец, фракцию разделяли путем ВЭЖХ-гель-фильтрации на колонках TSK G5000. Материал, который по существу отбрасывался, составлял до 10% от общего антигена. Адъювантная адсорбция на алюминиевые квасцы достигалась в условиях, сходных с теми, какие применяли для обычного антигена.

Анализ обоих антигенов продемонстрировал, что HBsAg агрегирует в ходе процесса, который характеризуется значительной потерей липидов всех типов, что показано для фосфолипидов обоих антигенов в следующей таблице.

Композиция фосфолипидов (PL) HBsAg, разделенных посредством силикагеля
нг PL/мкг белка	HBsAg (50-500 нм)	HBsAg 22 нм
Общее количество фосфолипидов	285,6±81,9	1225,3±256,8 (**)
Фосфатидилхолин	109,4±47,6	779,3±168,3 (**)
Лизофосфатидилхолин	20,0±12,7	73,5±26,1 (**)
Фосфатидилэтаноламин	52,8±13,3	183,7±54,3 (**)
Фосфатидилсерин	28,8±11,1	78,4±26,0 (**)
Фосфатидилинозитол	25,3±10,1	74,7±18,8 (**)
Фосфолипиды, связанные с HBsAg	48,8±10,7	41,1±7,7 (NS)

В данном примере подтверждается, что новый надкорпускулярный антиген может быть получен после процесса натурального окисления и делипидирования. Стабильность данных агрегатов должна основываться на процессах агрегации, которые могут происходить во время элиминации липидов из частиц, которые могут экспонировать гидрофобные регионы, и путем полимеризации белков между частицами при экспонировании сульфгидрильных групп.

Пример 4. Оценка иммуногенности агрегированного HBsAg

С целью оценки иммуногенности агрегированного HBsAg, полученного в результате примера 3, адсорбированного на алюминиевые квасцы или растворенного в PBS для введения на слизистые оболочки, осуществляли протокол иммунизации с введениями антигена на 0, 14 и 28 сутки и взятиями крови из ретроорбитального синуса на 42 сутки и самок мышей Balb/c в возрасте от 10 до 15 недель иммунизировали интраназальным и внутримышечным путем. Дозы на мышь представлены в таблице в конце данного примера, и результаты показаны на фигуре 1А, а агрегаты HBsAg показаны на фигуре 1В.

Статистический анализ проводили по тесту Стьюдента, и значимым различием считали р<0,05.

Путем данного эксперимента было продемонстрировано, что возможно генерировать более высокий по отношению к обычному антигену ответ IgG против HBsAg при иммунизации через слизистые оболочки или системным путем. На той же фигуре представлено сравнение данного эффекта для ответа DTH (планки), который также в результате был значительно выше для агрегированного варианта.

Группы иммунизации показаны в следующей таблице.

A	5 мкг делипидированного HBsAg (50-500 нм)/PBS 1×	IN
B	10 мкг делипидированного HBsAg (50-500 нм)/PBS 1×	IN
C	5 мкг обычного HBsAg (22 нм)/PBS 1×	IN
D	5 мкг делипидированного HBsAg (50-500 нм)/алюминиевые квасцы 0,5 мг/мл	IN
E	5 мкг обычного HBsAg (22 нм)/алюминиевые квасцы 0,5 мг/мл	IM

Пример 5. Кинетика иммунного ответа против HBsAg

С целью исследования кинетики ответа IgG против HBsAg иммунизировали 10 групп самок мышей Balb/c возрастом 10-15 недель. Применяемый регламент представлял собой: прививку на 0, 2 и 18 неделю и преиммунное взятие крови на 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 20 неделю. Тестируемые группы описаны в следующей таблице.

1	5 мкг обычного HBsAg (22 нм)/алюминиевые квасцы	IM
2	5 мкг обычного HBsAg (22 нм)/PBS 1×	IM
3	5 мкг делипидированного HBsAg (пример 3)/алюминиевые квасцы 0,5 мг/мл	IM

4	5 мкг делипидированного HBsAg (пример 3)/PBS 1×	IM
5	5 мкг делипидированного HBsAg (пример 1)/алюминиевые IM квасцы 0,5 мг/мл	IM
6	5 мкг делипидированного HBsAg (пример D/PBS 1×	IM
7	5 мкг делипидированного HBsAg (пример 1)/алюминиевые квасцы 0,5 мг/мл	IM
8	5 мкг делипидированного HBsAg (пример D/PBS 1×	IM
9	5 мкг делипидированного HBsAg (пример 1)/алюминиевые квасцы 0,5 мг/мл	IM
10	5 мкг делипидированного HBsAg (пример D/PBS 1×	IM

Антигены групп 5 и 6, 7 и 8, и 9 и 10 получали путем инкубации в течение различных периодов времени и с различными концентрациями циклодекстринов с образованием различных степеней агрегации.

Для эксперимента с DTH измерения проводили на сутки: 1 (1, 3), 2 (1', 3'), 3 (1'', 3'') и 5 (1''', 3''').

Статистический анализ проводили по тесту Стьюдента, и значимым различием считали р<0,05.

В данном эксперименте было подтверждено, что делипидированные HBsAg с разными степенями агрегации характеризовались отличными друг от друга иммунологическими характеристиками. Большая иммуногенность и ответ DTH не соответствовали большему размеру антигена, но соответствовали промежуточным размерам антигена, хотя согласно рабочей кинетике выработки антител в конце эксперимента более высокая иммуногенность соответствовала более высокой степени агрегации. Однако наблюдалось существенное увеличение ответа DTH в группах, иммунизированных с адъювантом алюминиевыми квасцами, по сравнению с теми, которых иммунизировали антигеном в PBS; группа агрегированного антигена с промежуточными размерами характеризовалась более высоким увеличением ответа, который значимо прибывал на 56 сутки. На фигуре 2а представлены индивидуальные титры для всех иммунизированных групп на 56 сутки. На данной фигуре также представлены результаты эксперимента DTH, проведенного в течение 5 суток на 22 неделе, с применением 2,0 мкг HBsAg в правую лапу и PBS в левую лапу в объеме введения, равном 22 мкл. Все тестовые группы также характеризовались существенно более слабым ответом в плане различия диаметра между правой и левой конечностями по сравнению с группой 3, которой вводили дополненный алюминиевыми квасцами HBsAg с промежуточным уровнем агрегации, полученной, как описано в примере 3. Стоит принять во внимание, что в последующих примерах продемонстрировано, что в случае сверхкорпускулярных структур более развернуто распознавание эпитопов HBsAg, что означает лучшее функционирование данного типа структуры. Несмотря на то что в группах с 5 по 10 в течение большей части времени реактивность против нативного HBsAg сходна с той, что была получена при иммунизации нативным антигеном, также был получен мощный ответ против других эпитопов, присутствующих в агрегированном антигена; см. пример 8, фигуру 4.

Пример 6. Оценка отношения IgG1/IgG2a

С целью исследования того, существует ли вариация отношения IgG1/IgG2a вследствие его связи с ответом ТН1/ТН2, сыворотки групп D и Е по регламенту иммунизации из примера 4 тестировали на предмет уровней антител IgG1 и IgG2a. Данный анализ проводили для сывороток, полученных на 42 сутки. Уровни антитела IgG2a значимо повышались в группе, иммунизированной сверхкорпускулярным антигеном (50-500 нм) до достижения отношения IgG1/IgG2a, близкого к 1, по сравнению с обычным HBsAg, также дополненного алюминиевыми квасцами (фигура 4).

Отношение IgG1/2a в группе, иммунизированной обычным HBsAg с алюминиевыми квасцами, было в 6,2 раза выше по сравнению с тем, что было обнаружено в группе делипидированного HBsAg промежуточного размера. Из данного эксперимента можно сделать вывод, что различное представление поверхностного антигена генерирует не только количественное, но также и качественное изменение, относящееся к типу IgG, которое усиливается, и наблюдается корреляция данных вариаций профиля субклассов IgG с усилением клеточного ответа, что подтверждает находки, сделанные при оценке DTH.

Пример 7. Исследование реактивности против нативного HBsAg сывороток мышей, иммунизированных различными антигенными вариантами

После иммунизации мышей делипидированными антигенами, полученными по примерам 1, 2 и 3, реактивность их сывороток сравнивали с таковой для сывороток мышей, иммунизированных нормальным антигеном. В результате данного эксперимента наблюдали, что иммунный ответ, генерируемый в сыворотках мышей, иммунизированных различными вариантами, характеризовался различной реактивностью против обычного HBsAg (22 нм); выраженную реактивность показывали сыворотки мышей, иммунизированных обычным антигеном, в то время как для разных степеней делипидации реактивность против HBsAg была также различной. Даже при наличии высоких титров против их собственных иммуногенов сыворотки мышей, иммунизированных высокоокисленными вариантами, не распознавали HBsAg, что доказывает различный характер распознавания генерированными против различных иммуногенов антителами и демонстрирует различную антигенную природу впервые образованных структур. Поэтому результаты примера 5 следует анализировать, имея в виду то, что хотя на последние три агрегированных антигенных варианта получены сходные ответы против нативного HBsAg, также присутствует ответ против других белковых эпитопов HBsAg, не распознаваемых при иммунизации нативным HBsAg.

Пример 8. Распознавание линейных эпитопов сыворотками мышей, иммунизированных различными антигенными вариантами.

С целью сравнения распознавания антител, генерированных против сверхкорпускулярного HBsAg, полученного по варианту окисления, описанного в примере 2, проводили картирование на целлюлозной мембране, содержащей линейные последовательности HBsAg (S-регион); 37 пептидов длиной по 12 аминокислот синтезировали с перекрыванием одного другим на 6 остатков до выполнения полной белковой последовательности.

Картирование эпитопов на целлюлозной мембране выполняли по Рональду Франку (Frank, R. 1992 Tetrahedron 48: 9217-9232). Образцы сыворотки анализировали в разведении 1/100.

Результаты исследования сывороток мышей, получавших обычный антиген и различные агрегированные варианты того же антигена, подтверждали, что между данными антигенами отсутствовали сходные линейные профили распознавания между данными антигенами, и это приводит к выводу, что поверхность HBsAg и его агрегированного варианта презентирует различные В-эпитопы (фигура 4).

Пример 9. Образование агрегатов между HBsAg и нуклеокапсидными антигенами. Иммунологическая оценка.

Равные объемы двух препаратов, содержащих 0,1 мг/мл HBsAg и HBsAg, инкубировали при 4°С в течение ночи и после этого агрегаты получали путем ВЭЖХ-гель-фильтрации TSK G6000. Образец данных агрегатов обрабатывали для способов визуализации путем электронной микроскопии, другой образец использовали для его иммунологической оценки с регламентом иммунизации на мышах Balb/c путем интраназального введения, для обоих антигенов отдельно, и при проверке агрегатов посредством электронной микроскопии (фиг.5А).

Результаты подтверждали, что смесь обоих агрегированных антигенов, введенных интраназальным путем, способствовала усилению ответа против HBsAg (фиг.5В). Группы по данной фигуре представлены в следующей таблице.

1	10 мкг HBsAg/PBS 1×	IN
2	10 мкг HBsAg/ацеманнан 3 мг/мл	IN
3	10 мкг HBsAg/10 мкг HBcAg/PBS 1×	IN
4	10 мкг HBsAg/алюминиевые квасцы 0,5 мг/мл	SC

Сходные результаты получали при использовании для получения смеси других антигенов вирусных капсидов, таких как антигенов гепатита С и ВИЧ.

Пример 10

Агрегированные составы HBs-HBcAg способны вызывать сильные клеточные ответы

Возможность индукции клеточных ответов в системных компартментах с помощью назального введения оценивали путем изучения лимфопролиферативного и IFN- ответов на HBsAg и HBcAg на нефракционированных спленоцитах после назальной иммунизации HBsAg или HBcAg по отдельности или объединенным составом HBs и НВс (см. фиг.6) по сравнению с в/м иммунизацией HBsAg на квасцах. Анализ ELISPOT IFN- проводили, используя иммунодоминантный пептид CTL HBs_(28-39) . Измерение лимфопролиферативной активности выявило индукцию сильных пролиферативных ответов в системных компартментах как против HBsAg, так и против HBcAg после назальной комбинированной иммунизации (фиг.9). Гуморальные ответы, полученные с помощью комбинированного состава HBs и НВс, были значительно сильнее ответов, индуцированных HBsAg или HBcAg по отдельности, введенных в/н или в/м (фиг.7).

Секреция IFN- против HBsAg выявлялась через 1 месяц после вторичной иммунизации на 90 сутки по данным анализа ELISPOT, предусматривающим протокол повторного стимулирования. Значительное усиление секреции IFN- достигалось в группе, иммунизированной назальным комбинированным составом по сравнению с HBsAg, введенным в PBS назально (Р<0.05) и парентеральным контролем HBsAg на квасцах (Р<0.05) (фиг.10).

Выраженное усиление гуморального и клеточного ответов как на HBsAg, так и на HBcAg наблюдается после совместного назального введения состава, содержащего смесь HBsAg и HBcAg. Хотя такой синергизм также наблюдается при совместном в/м введении HBsAg и HBcAg, общий гуморальный ответ был на 1-2 log сильнее после назального введения по сравнению с парентеральным введением. Кроме того, использования назального введения усиливало продукцию IgG2a, что позволяет предположить способность назально введенных HBsAg и HBcAg способствовать Th1-ответу. Это свойство подтверждалось при использовании либо мышей Balb/c, либо мышей С57/В16, несмотря на то, что у первых имеется общий сдвиг в сторону Th2 (фиг.8).

Наблюдаемый адъювантный эффект HBcAg по отношению к HBsAg может объясняться по-разному. Новые свойства составов, содержащих и HBsAg, и HBcAg, могут возникать в результате способности таких смесей образовывать самоорганизующиеся агрегированные структуры. И HBsAg, и HBcAg естественно агрегируют в частицы с HBsAg, образуя частицы размером 22 нм, и с HBcAg, образуя частицы размером 28 нм. Оба антигена взаимодействуют с образованием агрегированных структур, имеющих размер от 22 нм до 200 нм (фиг.6). Корпускулярная природа антигенов является важным свойством иммуногенности назально вводимых антигенов.

Клеточные ответы, индуцированные составом в ходе исследования, подтверждают его применимость в качестве терапевтической вакцины выбора.

Краткое описание чертежей

Фигура 1.

(A) Регламент из трех доз (0, 2 и 4 недели). Взятие крови осуществляли на 6 неделю. Первые три группы получали 50 мкл интраназальным путем. Две оставшиеся группы получали по 100 мкл внутримышечным путем с алюминиевыми квасцами.

(B) Агрегированный HBsAg (размер 200 нм).

Фигура 2.

Регламент из трех доз (0, 2 и 18 недели). Всем группам вводили внутримышечным путем по 100 мкл объема. Значения содержания антител соответствуют 8 неделе (фиг.2а). В течение 22 недели проводили тест DTH. На фиг.2b представлена кинетика возрастания титров в течение осуществления регламента.

Фигура 3.

Тот же регламент из 3 доз (0, 2 и 18 недели), что на фигуре 1. Анализ сывороток групп D и Е после взятия на 6 неделе. Обоим группам вводили антиген в 100 мкл внутримышечным путем в алюминиевых квасцах, причем группе D вводили делипидированный HBsAg (50-500 нм) и группе Е нормальный HBsAg в одинаковых дозах. На графике представлено среднее геометрическое значение и интервал отношения IgG1/IgG2a для каждой мыши в обеих группах.

Фигура 4.

Картирование перекрывающихся пептидов S-региона HBsAg на целлюлозной мембране, содержащей линейные последовательности. Анализировали разведения 1/100 объединенных сывороток: 1, HBsAg (нормальный); 2, HBsAg (агрегированный); (3-5: моноклональные антитела (MAb), полученные путем иммунизации агрегированными антигенами; 3, клон 6; 4, клон 7; 5, клон 8); 6, не относящаяся к делу сыворотка; 7, MAb (Hep 1). Четыре интенсивности цвета представляют собой ответ против пептидов. Пустые: отрицательный ответ, светло-серый: слабо положительный ответ, темно-серый: положительный ответ, черный: выраженный положительный ответ.

Фигура 5.

(A) Электронная микроскопия агрегатов HBsAg и HBcAg, более электронно-плотные частицы в центре соответствуют HBcAg, другие представляют собой HBsAg.

(B) Регламент из 2 доз (0, 14 суток). Анализ сыворотки на 26 сутки.