штамм вируса гриппа в/60/гонконг/01/22 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа В/60/Гонконг/01/22, ГИСК №142 (Государственный институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей 3-14 лет.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма В/60/Гонконг/01/22. Известный вакцинный штамм вируса гриппа типа В - В/60/Иоханнесбург/99/50 - прототип (Патент РФ №2215786 от 10.11.03, БИ №31, 2003) - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызывать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной современными штаммами вируса гриппа типа В.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса гриппа В/Гонконг/330/01.

Вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Гонконг/01/22 получен в развивающихся куриных эмбрионах методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Гонконг/330/01 с холодоадаптированным штаммом В/СССР/60/69 - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу В/СССР/60/69 при пониженной до 25°С температуре инкубации. Донор аттенуации - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа В/СССР/60/69, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей 3-14 лет (Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.).

Определение состава генома вакцинного штамма проводили методом сравнительного анализа электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов РНК родительских вирусов и реассортантного клона в 2,8%-ном полиакриламидном геле (Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. - М.: Мир. - 1982. - 446 с.) в присутствии 4,5 Мол мочевины. Вертикальный электрофорез проводили в течение 20 часов при +4°С при постоянном напряжении 100 V. Установлено, что вакцинный штамм В/60/Гонконг/01/22 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS) от донора аттенуации, и два гена, кодирующих поверхностные белки - НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу) - от эпидемического вируса В/Гонконг/330/01. Принадлежность гена, кодирующего поверхностный белок НА, эпидемически актуальному вирусу В/Гонконг/330/01, была также подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с 1% взвесью эритроцитов кур.

Вакцинный штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 38°С составляет 7,7 Ig ЭИД₅₀/мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 25°С - 3,6 Ig ЭИД₅₀/мл).

Результаты анализа состава генома вакцинного штамма В/60/Гонконг/01/22 представлены в таблице 1.

Таким образом, представленный вакцинный штамм В/60/Гонконг/01/22 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса В/Гонконг/330/01, структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Штамм депонирован в коллекции Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича под №142.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Таблица 1.

Состав генома реассортантного вакцинного штамма вируса гриппа В/60/Гонконг/01/22 (по данным электрофореза одноцепочечных РНК в полиакриламидном геле)

Ген

Родительские вирусы

Реассортантный вакцинный штамм В/60/Гонконг/01/22

Эпидемический вирус В/Гонконг/330/01

Донор аттенуации В/СССР/60/69

РВ2

ГК1

В60 2

В60

РВ1

ГК

В60

В60

РА

ГК

В60

В60

НА

ГК

В60

ГК

NP

ГК

В60

В60

NA

ГК

В60

ГК

М

ГК

В60

В60

NS

ГК

В60

В60

1Ген принадлежит эпидемическому вирусу гриппа В В/Гонконг/330/01.

2Ген принадлежит донору аттенуации В/СССР/60/69.

Таблица 2.

Реактогенность для взрослых людей вакцинного штамма В/60/Гонконг/01/22 при интраназальном введении

Препарат

Число обследуемых

Показатель

Температурные реакции (в °С)

Показатель реактогенности

Слабые (37,5°С)

Средние (37,6-38,5°С)

сильные (38,5°С)

Вакцина

51

абс.ч.%

5 9,8

0 0

0 0

0

Плацебо

31

абс.ч.%

4 12,9

0 0

0 0

Таблица 3.

Реактогенность для детей 3-14 лет вакцинного штамма В/60/Гонконг/01/22 при интраназальном введении

Препарат

Число обследуемых

Показатель

Температурные реакции (в °С)

Показатель реактогенности

Слабые ( 37,5°С)

Средние (37,6-38,5°С)

сильные (38,5°С)

Вакцина

58

абс.ч.%

4 6,9

0 0

0 0

0

Плацебо

29

абс.ч.%

2 6,5

0 0

0 0

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма - В/60/Гонконг/01/22

2. Серия - серия 1

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус - В/Гонконг/330/01

б) донор аттенуации - В/СССР/60/69

4. Количество пассажей - 6 в процессе реассортации

5. Характеристика штамма:

а) оптимальные условия репродукции - 32°С, 72 часа;

б) гемагглютинирующая активность -1:512;

в) инфекционная активность - 8.4 Ig ЭИД₅₀ /мл;

г) чувствительность к ингибиторам - ингибитороустойчивый по данным РТГА с лошадиной сывороткой;

д) разность в показателях инфекционной активности при 32°С и 38°С - 7.7 Ig ЭИД ₅₀/мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 32°С и 25°С - 3.6 Ig ЭИД₅₀ /мл.

ж) структура генома реассортанта:

- гены от эпидемического вируса - НА, NA

- гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации - 28 января 2004 года;

б) объем материала в ампуле - 1 мл;

в) количество доз в серии - 4;

г) инфекционная активность - 7.7 Ig ЭИД ₅₀/мл;

д) гемагглютинирующая активность - 1:256.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:2.

8. Антигенная специфичность

а) гемагглютинина в РТГА - идентичен вирусу В/Гонконг/330/01, хорьковой антисывороткой к которому полностью нейтрализуется;

б) нейраминидазы - идентична вирусу В/Гонконг/330/01 по данным электрофореза в полиакриламидном геле.

9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль лиофилизированного материала:

дата проведения - 12 января 2004 года. Результат - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

Руководитель лаборатории (отдела)

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 72 часов - 8,4 Ig ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:512. Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Образец паспорта на вакцинный штамм В/60/Гонконг/01/22 прилагается.

ШТАММ В/60/ГОНКОНГ/01/22 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛОГО КОНТИНГЕНТА

Пример 1. При вакцинации 51 взрослого человека интраназально реассортантным вакцинным штаммом В/60/Гонконг/01/22 с инфекционной активностью 7,7 Ig ЭИД₅₀/мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С и средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) наблюдались в 9,8% случаев. Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%. Результаты обследования приведены в таблице 2.

В получившей плацебо группе из 31 лица средних и сильных температурных реакций не отмечалось, слабые реакции наблюдались в 12,9% случаев.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Гонконг/01/22 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

ШТАММ В/60/ГОНКОНГ/01/22 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-14 ЛЕТ

Пример 2. Группу из 58 детей в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом В/60/Гонконг/01/22 с инфекционной активностью 7,7 Ig ЭИД ₅₀/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 29 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в таблице 3.

В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдались. Средние реакции в диапазоне 37,6-38,5°С также не наблюдались. Показатель реактогенности составил 0%. Слабые температурные реакции с кратковременным повышением температуры до 37,5°С были отмечены в 6,9% случаев.

В группе детей, получивших плацебо, сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С и средних температурных реакций в диапазоне 37,6-38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции отмечены в 6,5% случаев.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Гонконг/01/22 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.