способ получения диагностикума для выявления общего эндотоксина грамотрицательных бактерий

Классы МПК:A61K39/40 бактериальные
G01N33/547 с антигеном или антителом, связанным с носителем через мостиковый связующий агент
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):НАУЧНЫЙ ЦЕНТР СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ХИРУРГИИ ИМ. А.Н. БАКУЛЕВА РАМН (RU),
НПФ "РОХАТ" (RU),
БОКЕРИЯ ЛЕОНИД АНТОНОВИЧ (RU),
НИЯЗМАТОВ АГЗАМДЖАН АХТАМОВИЧ (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2003-07-17
публикация патента:

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. Предложен способ получения диагностикума для определения общего эндотоксина грамотрицательных бактерий. Способ включает получение латекса типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, а оболочка - латекс сополимера стирола и метакрилата цинка при массовом соотношении звеньев 1:0,8-1:0,4, сенсибилизацию латекса моноклональными антителами фракции IgG2a и IgG2b в 0,01 М глициновом буфере при рН 8,2-8,6 без предварительной выдержки и инкубацию сначала при 36-38°С в течение 120-180 мин, а затем при 2-8°С в течение 1-20 ч. Предложенный способ позволяет сократить время получения диагностикума, при этом полученный диагностикум обладает специфичностью 99±0,89 при чувствительности до 10 пг/мл, а время получения результата исследования составляет не более 10 мин. 6 табл.

Формула изобретения

Способ получения диагностикума для определения эндотоксина грамотрицательных бактерий с использованием антительного диагностикума на латексном носителе, отличающийся тем, что в качестве носителя используют латекс типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, а оболочка - латекс сополимера стирола и метакрилата цинка при массовом соотношении звеньев 1:0,8-1:0,4, который сенсибилизируют моноклональными антителами в 0,01 М глициновом буфере при рН 8,2-8,6 до полного связывания, без предварительной выдержки латекса, а затем инкубируют сначала при 36-38°С в течение 120-180 мин, а затем при 2-8°С в течение 1-20 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и пищевой промышленности.

Известен способ получения диагностикума для определения антигенов вируса гепатита В, согласно которому латекс сополимера стирола и метакрилат цинка сенсибилизируют антителами в 0,1М глициновом буфере, рН которого 7,0, а затем осуществляют инкубацию при 37°С в течение 2-8 ч (Чайка Н.А., Горбачев Е.Н. Применение реакции агглютинации сенсибилизированного латекса для диагностики вирусных инфекций. Вопросы вирусологии, 1985, №5, с.516-523).

Данный способ позволяет достаточно быстро получить диагностикум, выявляющий вирус гепатита В при концентрации 1 мкг/мл. К недостаткам диагностикума относятся: невысокая чувствительность, специфичность - 68,02±0,88 и длительное время получения результата - 20 мин.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения диагностикума для определения эндотоксинов грамотрицательных бактерий с использованием антительного диагностикума (US 5316911 A1, 31.05.1994).

Технической задачей изобретения является сокращение времени получения диагностикума для определения эндотоксина при высоких значениях чувствительности, специфичности и сокращения времени получения результата при его применении.

Техническая задача изобретения решается при получении диагностикума для определения эндотоксина, причем вначале получают латекс типа ядро-оболочка. Например, реактор продувают 30 мин азотом, загружают: 10% стирола, 0,1% персульфата калия, 89,9% воды, термостатируют, перемешивая при 70°С 7 ч до полной конверсии мономера. В полученный латекс вводят 0,2% стирола, 0,1% метакрилата цинка и 0,05% персульфата калия. Латекс перемешивают до растворения всех компонентов и затем термостатируют при 70°С 2 ч.

Частицы полученного латекса состоят из двух частей: внутреннее ядро - полистирол, наружная оболочка (0,2-20% от массы всей частицы) - статический сополимер стирола и метакрилата цинка в массовом соотношении 1:0,8-1:0,4. Массовое соотношение между звеньями метакрилата цинка и стирола, входящего как в ядро, так и в оболочку, составляет 1-12:100.

Далее проводят сенсибилизацию латекса моноклональными антителами фракции IgG2а и IgG2b фирм «Biogenesis» UK и «Chemicon», USA, и др. в 0,01 М глициновом буфере, рН которого 8,2-8,6, до полного связывания, при отсутствии предварительной выдержки латекса в буфере, с последующей инкубацией сначала при 36-38°С в течение 120-180 мин, а затем при 2-8°С в течение 1-20 ч.

Сокращение времени получения диагностикума достигнуто за счет выбора параметров сенсибилизации и инкубации без предварительной выдержки латекса в буфере.

На получение диагностикума с высокой чувствительностью и специфичностью влияют: рН буферного раствора, в котором осуществляют сенсибилизацию, начальная температура инкубации, начальное время инкубации, температура завершения инкубации, время завершения инкубации. В таблице 1 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от величины рН глицинового буфера при начальной температуре инкубации 37°С в течение 150 мин, а затем 5°С в течение 10 ч.

Таблица 1
Количество исследований рН глицинового буфераЧувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1 1058,010000
2105 8,25000
3 1058,4 2500
4105 8,64000
5105 8,810000

В таблице 2 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от начальной температуры инкубации при рН буфера, равном 8,4, начальном времени инкубации, равном 150 мин, а затем 5°С в течение 10 ч.

Таблица 2
Количество исследований Начальная температура инкубацииЧувствительность диагностикумов (микробные тела / мл )
110535,5°С 75000
2 10536°С50000
3105 37°С5000
4105 38°С1000
510538,5°С 50000

В таблице 3 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от начального времени инкубации при рН буфера, равном 8,4, начальной температуре инкубации, равной 37°С, и температуре завершения инкубации, равной 5°С, в течение 10 ч.

Таблица 3
Количество исследований Начальное время инкубации (мин)Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
110590 5000
2105 1201000
3105 1501000
4 105180 1000
5105 21025000

В таблице 4 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от температуры завершения инкубации при рН буфера, равном 8,4, начальной температуре инкубации, равной 37°С, начальном времени инкубации, равном 150 мин, и времени завершения инкубации, равном 10 ч.

Таблица 4
Количество исследований Температура завершения инкубацииЧувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
11051°C 75000
2 1052°С50000
3105 5°С10000
41058°С 1000
5 10510°С50000

В таблице 5 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от времени завершения инкубации при рН буфера, равном 8,4, начальной температуре инкубации, равной 37°С, начальном времени инкубации, равном 150 мин, и температуре завершения инкубации, равной 5°С.

Таблица 5
Количество исследований Время завершения инкубации (ч)Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
11051 25000
2105 510000
3105 105000
4 10515 10000
5105 2020000

Специфичность и чувствительность полученных диагностикумов для определения эндотоксина грамотрицательных бактерий проверяли в реакции агглютинации латекса с сыворотками крови доноров, больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, больных гнойно-воспалительными заболеваниями. Учет результата реакции проводился по степени активированных частиц:

1. Максимальная степень - крупные хлопья на прозрачном фоне - 4 степень активированных частиц (4СА) (положительный результат).

2. Средняя степень - хлопья или крупные зерна на слегка мутном фоне - 3 степень активированных частиц (3СА) (положительный результат).

3. Минимальная степень - много зерен на мутном фоне - 2 степень активированных частиц (2СА) (положительный результат),

4. Контроль - абсолютно мутный фон или единичные зерна - 1 степень активированных частиц (1СА) (отрицательный результат).

В таблице 6 приведены результаты исследований.

Таблица 6
Исследуемая сывороткаКоличество исследований Результат
Доноры (не содержащие эндотоксина)115 100% - отр.
Больные сердечно-сосудистыми заболеваниями (подтвержденные бактериологическими посевами)14099% - полож., 1% - отр.
Больные гнойно-воспалительными заболеваниями2798% - полож., 2%-отр.

Специфичность полученного диагностикума для выявления эндотоксина составляет 99±0,89 при чувствительности 10 пг/мл, при этом время получения результата исследования не более 10 мин. Время получения диагностикума для определения эндотоксина сокращено с нескольких месяцев до нескольких часов.

Класс A61K39/40 бактериальные

способ получения гипериммунной сыворотки против цирковирусной инфекции, репродуктивно-респираторного синдрома и гемофилеза свиней -  патент 2494760 (10.10.2013)
наноантитела amh1, amh2, связывающие антиген mycoplasma hominis, способ их получения, способ лечения инфекции, вызванной mycoplasma hominis -  патент 2484095 (10.06.2013)
клостридиальный токсин netb -  патент 2474587 (10.02.2013)
полипептиды из neisseria meningitidis -  патент 2450019 (10.05.2012)
сыворотка против болезней крупного рогатого скота, вызываемых вирусами инфекционного ринотрахеита, парагриппа, рота, корона и диареи - болезни слизистых, полиспецифическая гипериммунная, способ профилактики и лечения болезней крупного рогатого скота, вызываемых вирусами инфекционного ринотрахеита, парагриппа, рота, корона и диареи - болезни слизистых -  патент 2438709 (10.01.2012)
способ получения контрольной сыворотки для диагностики антикардиолипиновых антител в количественной реакции микропреципитации на сифилис -  патент 2399383 (20.09.2010)
сывороточный иммунобиологический препарат для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы -  патент 2381037 (10.02.2010)
рекомбинантная днк, обеспечивающая получение рекомбинантного белка pb1, обладающего протективными свойствами в отношении streptococcus pyogenes и streptococcus agalactiae -  патент 2378374 (10.01.2010)
способ получения поливалентной сыворотки против псевдомоноза сельскохозяйственных животных -  патент 2376034 (20.12.2009)
способ лечения хронических заболеваний -  патент 2371201 (27.10.2009)

Класс G01N33/547 с антигеном или антителом, связанным с носителем через мостиковый связующий агент

способ оценки состояния местного иммунитета слизистой оболочки полости носа в ринологической практике -  патент 2297633 (20.04.2007)
способ диагностики потребления наркотических веществ -  патент 2291436 (10.01.2007)
способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода klebsiella -  патент 2266136 (20.12.2005)
способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода serratia -  патент 2266135 (20.12.2005)
способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода enterobacter -  патент 2266134 (20.12.2005)
способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода pseudomonas -  патент 2266133 (20.12.2005)
способ диагностики факта потребления наркотических веществ -  патент 2250467 (20.04.2005)
способ и набор для экспресс диагностики доклинических и клинически выраженных форм иммунологической недостаточности по гевондян -  патент 2196333 (10.01.2003)
Наверх