способ получения жидкого пробиотического препарата

Формула изобретения

Способ получения жидкого пробиотического препарата включает в себя раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus, Rhuminococcus albus, Bacillus subtilis до заданного достижения титра каждого микроорганизма и смешивание полученных культуральных жидкостей, отличающийся тем, что из микроорганизма Lactobacillus используют Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, из Rhuminococcus albus - Rhuminococcus albus Kr, из Bacillus subtilis - Bacillus subtilis B-8130, при этом Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr выращивают на жидкой питательной среде, состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясо-пептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция при следующих соотношениях, мас.%:

Рубцовая жидкость	4,80-5,20
Шрот подсолнечниковый	0,70-0,80
Мясо-пептонный бульон	0,45-0,55
Хлористый натрий	0,08-0,12
Сульфат магния	0,08-0,12
Двузамещенный фосфорнокислый калий	0,08-0,12
Сульфат аммония	0,18-0,22
Карбонат кальция	0,18-0,22
Вода	Остальное

в течение 4-6 суток при температуре 37-40°С до достижения титра каждым из микроорганизмов 1·10⁸-3·10 ⁸, а микроорганизм Bacillus subtilis В-8130 выращивают в жидкой питательной среде, состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция при следующих соотношениях, мас.%:

Дрожжи	0,18-0,22
Шрот подсолнечниковый	0,70-0,80
Меласса	0,10-0,20
Глютен	0,08-0,12
Сульфат магния	0,08-0,12
Двузамещенный фосфорнокислый калий	0,18-0,22
Хлористый кальций	0,10-0,20
Вода	Остальное

доводя до рН - 7,2-7,4, в течение 4-6 суток при температуре 37-45°С до достижения титра Bacillus subtilis В-8130 1·10 ⁸-2·10⁸, затем культуральные жидкости микроорганизмов объединяют при следующих соотношениях, мас.%:

Культуральная жидкость
микроорганизмов Lactobacillus acidophilus
Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr	45-55
Культуральная жидкость микроорганизмов
Bacillus subtilis В-8130	45-55

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии приготовления бактериальных препаратов для профилактики болезней животных.

Известна кормовая добавка, содержащая смесь живых молочнокислых бактерий и дицитроборатоксихинолин в соотношении 5-20 к 1 по сухому весу (патент РФ №2136173, бюл. 25, опубл. от 10.09.99).

Однако недостатком указанной добавки наличие побочных эффектов за счет ввода в ее состав химического соединения, которое в ряде случаев способно вызвать дисбактериоз. Кроме того, пробиотическая активность у разных штаммов различается и трудно стандартизировать данный препарат.

Известен способ получения сухого пробиотического препарата, включающий выращивание в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина штаммов энтеробактерий, например Bifidobacterium globosum БФ-4 или Streptococcus fa'cium ВГНКИ - 27 в течение 12-15 ч, затем нативную культуральную жидкость охлаждают до температуры 15-20°С и концентрируют в 10-15 раз, полученную концентрированную биомассу отмывают 2,5-3,5%-ным раствором сахарозы или лактозы и обезвоживают при температуре минус 25-35°С. При этом концентрирование нативной культуральной жидкости проводят методом ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрацией на плоских мембранах, или сепарированием в полупериодическом режиме работы (патент РФ №2065305, кл. А. 61 К 35/74, бюл. №23, опубл. 1996 г.).

Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, необходимость использования гидролизата казеина значительно удорожает препарат. Во-вторых, использование в качестве метода концентрирования ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрации на плоских мембранах делает данный метод дорогостоящим и требующим больших капиталовложений и высокой подготовки персонала. Также обезвоживание значительно усложняет технологический процесс и, увеличивая стоимость, приводит одновременно к потере активности живых микроорганизмов, входящих в состав препарата. Кроме того, использование в качестве смешанной пробиотической культуры только двух видов бактерий делает эту смешанную популяцию неустойчивой, что снижает эффективность ее применения.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения пробиотика для ветеринарии, предусматривающий выращивание лактобактерий и культивирование на соево-печеночной среде в термостате при температуре 36-38°С, причем дополнительно выращивают чистые культуры Bacillus subtilis, Rhuminococcus albus, из лактобактерий Lactobacillus plantarum, культивирование проводят раздельно в течение 72 часов, после чего полученные культуральные жидкости смешивают в равных количествах (патент РФ №2084233, кл. 6 А 61 К 35/66, бюл. №20, 20.07.97 - прототип).

Однако в известном способе используется в качестве одного из компонентов пробиотического препарата Lactobacillus plantarum, который благодаря своим свойствам широко используется в силосовании зеленой массы растений, но мало используется для нормализации работы желудочно-кишечного тракта. Кроме того, в данном способе не указывается источник, откуда выделены используемые в препарате микроорганизмы, что не может обеспечивать высокую эффективность предлагаемого препарата. Следует отметить, что пробиотик, полученный по указанному способу, получится дорогостоящим для применения в животноводстве и птицеводстве, так как каждый вид микроорганизмов культивируется отдельно, что усложняет технологический процесс и требует дополнительного оборудования. Следует отметить, что такой препарат не может обладать комплексным действием: пробиотическим, антимикробным, иммуномодулирующим и располагать целлюлозолитической активностью.

Известные способы не позволяют получать эффективный препарат для профилактики и лечения животных и птицы, сочетающего противомикробную защиту организма со стимулирующим воздействием на него, при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки при использовании дешевого сырья для получения препарата и упрошенной схемы производства.

Техническим решением задачи является сочетание противомикробного и стимулирующего эффекта препарата с одновременным увеличением конверсии корма с высоким содержанием клетчатки для повышения продуктивности животных и птицы, и расширение ассортимента лечебно-профилактических препаратов природного происхождения при использовании дешевого сырья для получения препарата и упрощенной схемы производства за счет совместного культивирование Lactobacillus acidophilus Scav. и Rhuminococcus albus.

Поставленная задача достигается тем, что способ получения жидкого пробиотического препарата включает в себя раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus, Rhuminococcus albus. Bacillus subtilis до заданного достижения титра каждого микроорганизма и смешивание полученных культуральных жидкостей, причем из микроорганизма Lactobacillus используют Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, из Rhuminococcus albus - Rhuminococcus albus Kr, из Bacillus subtilis - Bacillus subtilis B-8130, при этом Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr. выращивают на жидкой питательной среде состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясо-пептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция при следующих соотношениях, масс %:

Рубцовая жидкость	4,80-5,20
Шрот подсолнечниковый	0,70-0,80
Мясо-пептонный бульон	0,45-0,55
Хлористый натрий	0,08-0,12
Сульфат магния	0,08-0,12
Двузамещенный фосфорнокислый калий	0,08-0,12
Сульфат аммония	0,18-0,22
Карбонат кальция	0,18-0,22
Вода	Остальное,

в течение 4-6 суток при температуре 37-40°С до достижения титра каждым из микроорганизмов 1·10⁸-3·10 ⁸, а микроорганизм Bacillus subtilis B-8130 выращивают в жидкой питательной среде состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция при следующих соотношениях, мас.%:

Дрожжи	0,18-0,22
Шрот подсолнечниковый	0,70-0,80
Меласса	0,10-0,20
Глютен	0,08-0,12
Сульфат магния	0,08-0,12
Двузамещенный фосфорнокислый калий	0,18-0,22
Хлористый кальций	0,10-0,20
Вода	Остальное,

доводя до рН - 7,2-7,4, в течение 4-6 суток при температуре 37-45°С до достижения титра Bacillus subtilis B-8130 1·10 ⁸-2·10⁸, затем культуральные жидкости микроорганизмов объединяются при следующих соотношениях, мас.%:

Культуральная жидкость микроорганизмов
Lactobacillus acidophilus Scav. В-4625 и Rhuminococcus
albus Kr	45-55
Культуральная жидкость микроорганизмов Bacillus
subtilis B-8130	45-55.

Заявленный способ получения жидкого пробиотического препарата отличается от прототипа соотношением микроорганизмов в нем, схемой совместного культивирования, составом питательной среды и видовым эпитетом Lactobacillus.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию "новизна".

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение поставленной задачи и не выявлены при изучении патентной и научно-технической литературы данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию "изобретательский уровень".

Для получения жидкого пробиотического препарата смешивают между собой культуральные жидкости микроорганизмов Lactobacillus acidophilus Scav. В-4625, Rhuminococcus albus Kr и Bacillus subtilis B-8130. Причем микроорганизмы Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, Rhuminococcus albus Kr выращивают совместно на жидкой питательной среде, состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясопептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция. Для оценки оптимального варианта питательной среды для выращивания данной клеточной суспензии провели опыты по их культивированию с различным составом и оценивали титр выросших микроорганизмов. Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1
Показатели	Вариант питательной среды
	1	2	3	4	5
Компоненты питательной среды, мас.%:
Рубцовая жидкость	4,60	4,80	5,00	5,20	5,40
Шрот подсолнечниковый	0,65	0,70	0,75	0,80	0,85
Мясо-пептонный бульон	0,40	0,45	0,50	0,55	0,60
Хлористый натрий	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14
Сульфат магния	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14
Двузамещенный фосфорнокислый калий	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14
Сульфат аммония	0,16	0,18	0,20	0,22	0,24
Карбонат кальция	0,16	0,18	0,20	0,22	0,24
Вода	осталь ное	осталь ное	осталь ное	осталь ное	осталь ное

Количество микроорганизмов
Титр Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, кл/мл	5·107	0,5·108	2·108	2·10 8	4·10 8
Титр Rhuminococcus albus Kr., кл/мл	7·107	0,3·108	2·108	2·108	7·10 8

Как видно из данных, представленных в таблице 1, оптимальным является вариант №3, так как в вариантах с меньшим содержанием солей титр микроорганизмов низкий, а увеличение концентрации соединений приводит к удорожанию питательной среды, без значительного увеличения содержания культивируемых микроорганизмов.

Температурой культивирования является интервал 37-40°С, а временем 37-40°С. Если температуру снизить ниже 37°С, тост культуры будет медленный, и она не достигнет необходимого титра за 5 суток. Если температура культивирования окажется выше 40°С, то рост культуры также будет снижаться, а ее дальнейшее повышением может привести к гибели микроорганизмов. Поэтому для достижения необходимого титра культурами оптимальным временем культивирования является 5 суток при температуре 38°С.

Микроорганизмы Bacillus subtilis B-8130, выделенные из слепых отростков кишечника глухаря, выращивают на жидкой питательной среде, состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция. Для оценки оптимального варианта питательной среды для выращивания данной клеточной суспензии провели опыты по их культивированию с различным составом и оценивали титр выросших микроорганизмов. Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2
Показатели	Вариант питательной среды
	1	2	3	4	5
Компоненты питательной среды, мас.%:
Дрожжи	0,16	0,18	0,20	0,22	0,24
Шрот подсолнечниковый	0,65	0,70	0,75	0,80	0,85
Меласса	0,05	0,10	0,15	0,20	0,25
Глютен	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14
Сульфат магния	0,06	0,08	0,10	0,12	0,04
Двузамещенный фосфорнокислый калий	0,6	0,18	0,20	0,22	0,24
Хлористый кальций	0,05	0,10	0,15	0,20	0,25
Вода	остальн ое	остальн ое	остальн ое	остальн ое	остальн ое
Количество микроорганизмов
Титр Bacillus subtilis B-8130, кл/мл	9·107	1,5·108	2·108	2·10 8	3·10 8

Как видно из данных, представленных в таблице 2, оптимальным является вариант №3, так как в вариантах с меньшим содержанием солей количество микроорганизмов будет низкий, а увеличение концентрации соединений приводит к удорожанию питательной среды, без значительного увеличения содержания культивируемых микроорганизмов.

Температурой культивирования является интервал 37-45°С, а временем 4-6 суток. Если температуру снизить ниже 37°С, тост культуры будет медленный, и она не достигнет необходимого титра за 5 суток. Если температура культивирования окажется выше 45°С, то рост культуры также будет снижаться, а ее дальнейшее повышением может привести к гибели микроорганизмов. Поэтому для достижения необходимого титра культурами оптимальным временем культивирования является 5 суток при температуре 41°С.

Полученные, таким образом, суспензии микроорганизмов объединяют. Если внести в препарат Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr меньше 45%, то пробиотической активности препарата не будет, т.к. количество бактерий будет недостаточно, и целлюлозолитическая активность препарата не будет регистрироваться, т.к. количество бактерий будет недостаточно для эффективного процесса разрушения клетчатки. Если внести более 55% суспензии бактерий видов Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr, то антимикробный эффект не увеличивается, скорость разрушения клетчатки не увеличиться, так как субстрата для их развития будет недостаточно и поэтому нет необходимости вводить больше бактерий. Для того, чтобы эффективность препарата была оптимальной количество молочнокислых бактерий вида Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и целлюлозолитических бактерий Rhuminococcus albus Kr. должно составлять 50% от общего количества микроорганизмов в предлагаемом препарате. Если внести в препарат Bacillus subtilis B-8130 меньше 45%, то антимикробная и иммуностимулирующая активности препарата будут низкие, так как количество бактерий будет недостаточно. Если внести более 55%, то увеличение требуемого эффекта наблюдаться не будет. Для того, чтобы эффективность препарата была оптимальной, количество бацилл вида Bacillus subtilis B-8130 должно составлять 50%.

Пример конкретного осуществления способа получения влажного пробиотического препарата осуществлялся в ФГУ "Краснодарский биоцентр" г.Краснодар.

Выращивание бактериальных культур Lactobacillus acidophilus Scav. В-4625 и Rhuminococcus albus Kr осуществляют на жидкой питательной среде. В качестве питательной среды использовали состав, указанный ниже, на который после автоклавирования при 1 атм в течение 1 час, и охлаждения засевали чистую культуру микроорганизмов, методом смыва со кошеного агара:

рубцовая жидкость	50 мл
шрот подсолнечниковый	7,5 г
мясопептонный бульон	5,0 г
хлористый натрий	1,0 г
сульфат натрия	1,0 г
фосфат калия однозамещенный	1,0 г
сульфат аммония	2,0 г
мел	2,0 г

Культивирование осуществляли в колбах для культивирования микроорганизмов объемом 3 литра без встряхивания в течение 5 суток при температуре 37-40°С до получения титра бактериальных клеток 2·10⁸ клеток/мл среды.

Одновременно культивируют Bacillus subtilis B-8130 на жидкой питательной среде. В качестве питательной среды использовали состав, указанный ниже, на который после автоклавирования при 1 атм в течение 1 час и охлаждения засевали чистую культуру микроорганизмов, методом смыва со кошеного агара:

дрожжи	20 г
меласса	15 г
шрот подсолнечниковый	7,5 г
сульфат магния	1,0 г
фосфат калия однозамещенный	2,0 г
хлористый кальций	1,5 г
глютен	10 г
pH	7,2-7,4

Культивирование осуществляли в колбах для культивирования микроорганизмов объемом 3 литра без встряхивания в течение 5 суток при температуре 37-45°С до получения титра бактериальных клеток 1·10⁸ клеток/мл среды. Полученные таким образом культуральные жидкости объединяются стерильно в соотношении 1:1 по объему.

Промышленная эффективность пробиотического препарата полученного по предлагаемому способу иллюстрируется примерами.

Пример 1. Испытание препарата, полученного по предлагаемому способу, было проведено на птицефабрике "Кубань", Усть-Лабинского района Краснодарского края в виде добавки при выращивании цыплят-бройлеров кросса "СК-Русь". Схема опыта представлена в таблице 3.

Таблица 3
Схема опыта на цыплятах-бройлерах
Группа	Количество голов	Характеристика кормления (уровень клетчатки в рационе)
Контрольная	120	Основная кормовая смесь составлена по нормам ВНИТИП - содержание клетчатки 3,9-4,2% по периодам выращивания
I опытная	120	OK+0,2% препарата: уровень клетчатки 3,9-4,2-4,8
II опытная	120	OK+0,2% препарата: уровень клетчатки 3,9-4,5-5,0
III опытная	120	OK+0,2% препарата: уровень клетчатки 3,9-5,0-5,5
IV опытная	120	OK+0,2% препарата: уровень клетчатки 3,9-5,0-6,0

Основные результаты оценки эффективности предлагаемого препарата в рационах цыплят-бройлеров с разным уровнем клетчатки представлены в таблице 4.

Как свидетельствуют данные таблицы 4, повышение уровня клетчатки в рационах бройлеров до 6% на финише, при применении предлагаемого препарата, позволило получить вполне удовлетворительные результаты сравнимые с контролем, где уровень клетчатки не повышался выше 4,8% на финишном рационе. Таким образом, предлагаемый препарат позволяет значительно изменить структуру рационов для цыплят-бройлеров, увеличивая ввод шротов из подсолнечника, что позволяет снизить стоимость кормов.

Таблица 4
Основные результаты оценки эффективности предлагаемого препарата в рационах цыплят-бройлеров с разным уровнем клетчатки
Группа	Уровень клетчатки в рационе по периодам, %	Живая масса птицы в 49 суток, кг	Затраты кормов на 1 голову, кг	Затраты кормов на 1 кг привеса живой массы	Стоимость кормов на 1 голову, рублей	Стоимость кормов на 1 кг живой массы, рублей
Контро льная	3,9-4,2-4,8	1,740	4,178	2,45	7,27	4,26
I опыт ная	3,9-4,2-4,8	1,850	4,180	2,30	7,26	4,00
II опыт ная	3,9-4,5-5,0	1,790	4,177	2,38	7,25	4,13
III опыт ная	3,9-5,0-5,5	1,770	4,172	2,40	7,22	4,16
IY опыт ная	3,9-5,0-6,0	1,750	4,170	2,43	7,18	4,19

Пример 2. Научно-хозяйственный опыт на курах-несушках кросса УК-Кубань 123 был проведен на птицефабрике "Ново-Мышастовская", Красноармейского района. Краснодарского края. Рацион контрольной и опытной групп состоят из кормов растительного происхождения, основу которых составили пшеница, ячмень, кукуруза, шрот подсолнечный, рисовая мучка, минеральные и витаминные добавки. В опытной группе добавляли препарат, полученный по предлагаемому способу, в расчете 2 кг на 1 тонну кормосмеси. Результаты опыта приведены в таблице 5.

Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют, что предлагаемый пробиотический препарат увеличивает сохранность птицы, ее яйценоскость, снижая затраты кормов на 10 яиц и не ухудшая качества яиц.

Пример 3. Опыт на телятах проводился в АО им. М.Горького, Ленинградского района. Краснодарского края. Предлагаемый препарат применялся на поголовье телят. В контрольной и опытной группах было по 15 голов в возрасте 1-180 дней. Пробиотическая добавка вводилась в корм опытной группы в возрасте до 5 дней по 4 г в сутки на голову, а в дальнейшем в количестве 0,4% к сухому веществу рациона ежедневно в соответствии с "Временным наставлением по применению препарата пробиотического препарата".

Анализируя данные опыта, можно отметить, что предлагаемый препарат ускорял формирование микрофлоры рубца, снижал заболеваемость опытных животных и повышал поедаемость грубых кормов. В опытной группе продуктивность животных (среднесуточные привесы) повысилась на 18-25%, сохранность - на 10%, расходов кормов снизился на 15% по сравнению с контрольной. Побочных действий и осложнений при применении предлагаемого препарата в рекомендованных дозах не установлено.

Пример 4. Опыт на откормочных свиньях проводился в АО "2-я пятилетка" Ленинградского района Краснодарского края. Предлагаемый препарат применялся на фоне рационов с высоким содержанием клетчатки. Результаты откорма свиней на рационах такого типа позволили получить приросты живой массы 550 г, что на 10 г хуже контроля. Однако стоимость 1 тонны таких комбикормов примерно на 350 рублей ниже контрольных. Таким образом, применение предлагаемого препарата при откорме свиней экономически оправдано.

Таблица 5
Данные опыта по кормлению кур-несушек предлагаемым препаратом
Показатель	Группа
	контрольная	опытная
Живая масса на начало опыта, г	1802	1818
Живая масса на конец опыта, г	1770	1760
Сохранность поголовья, %	98	100
Яйценоскость, шт.,%	72,2	80,7
Затраты корма на 1 гол./г	124,7	122,9
Затраты корма в кг на 10 шт. яиц	1,73	1,52
Получено яиц (всего штук)	1511	1694
Толщина скорлупы	35,03	35,10
Вес яиц (средний), г	59,9	59,5

Как показали результаты хозяйственных и научно-производственных испытаний по примерам 1, 2, 3, 4, полученный по заявляемому способу пробиотический препарат эффективно сочетает противомикробные и стимулирующие свойства при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки за счет наличия целлюлозолитической активности, что выражается в более высокой продуктивности и повышенной сохранности в опытных группах животных и птицы в сравнении с контрольными группами во всех опытах.