слитый полипептид, способный связываться с полипептидом vegf, и кодирующая его молекула нуклеиновой кислоты, их получение и применение

Формула изобретения

1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, способный связываться с полипептидом VEGF, включающая функционально связанные

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую компонент первого рецептора фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF), состоящий, по существу, из иммуноглобулинподобного (Ig) домена 2 первого рецептора VEGF,

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую компонент второго рецептора VEGF, состоящий, по существу, из иммуноглобулинподобного домена 3 второго рецептора VEGF,

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую мультимеризующий компонент,

при этом первым рецептором VEGF является Flt1, вторым рецептором VEGF является Flk1 или Flt4 и компоненты рецептора VEGF согласно а) и b) являются единственными компонентами рецептора VEGF слитого полипептида.

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая Ig-домен 2 внеклеточного домена первого рецептора VEGF, расположена выше нуклеотидной последовательности, кодирующей Ig-домен 3 внеклеточного домена второго рецептора VEGF.

3. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая Ig-домен 2 внеклеточного домена первого рецептора VEGF, расположена ниже нуклеотидной последовательности, кодирующей Ig-домен 3 внеклеточного домена второго рецептора VEGF.

4. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что мультимеризующий компонент включает иммуноглобулиновый домен.

5. Молекула нуклеиновой кислоты по п.4, отличающаяся тем, что иммуноглобулиновый домен выбран, из группы, состоящей из домена Fc IgG и тяжелой цепи IgG.

6. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

(a) нуклеотидной последовательности, представленной на фигуре 21А-21С;

(b) нуклеотидной последовательности, представленной на фигуре 22А-22С;

(c) нуклеотидной последовательности, представленной на фигуре 24А-24С;и

(d) нуклеотидной последовательности, которая отличается от нуклеотидной последовательности (а), (b) или (с) вследствие вырожденности генетического кода.

7. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что компоненты слитого полипептида расположены как 1, 2, 3; 1, 3, 2; 2, 1, 3; 2, 3, 1; 3, 1, 2; или 3, 2, 1, при этом 1 является компонентом первого рецептора VEGF, 2 является компонентом второго рецептора VEGF и 3 является мультимеризующим компонентом.

8. Слитый полипептид, способный связываться с полипептидом VEGF, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7.

9. Клонирующий вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7.

10. Экспрессирующий вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7, которая функционально связана с регулирующей экспрессию последовательностью.

11. Способ получения системы вектор - хозяин для продуцирования слитого полипептида, включающий введение экспрессирующего вектора по п.10 в приемлемую клетку-хозяина.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что приемлемой клеткой-хозяином является бактериальная клетка, дрожжевая клетка, клетка насекомого или клетка млекопитающего.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что приемлемой клеткой-хозяином является клетка Е.coli или СНО.

14. Способ получения слитого полипептида, включающий выращивание клеток системы вектор - хозяин, полученной способом по любому из пп.11-13, в условиях, обеспечивающих продуцирование слитого полипептида, и выделение полученного таким образом слитого полипептида.

15. Димерный антагонист фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF), включающий два слитых полипептида по п.1.

16. Димерный антагонист по п.15, отличающийся тем, что модифицирован ацетилированием или обработкой полиэтиленгликолем.

17. Слитый полипептид, способный связываться с полипептидом VEGF, включающий

(a) компонент рецептора VEGF, состоящий, по существу, из иммуноглобулинподобного (Ig) домена 2 рецептора VEGF Fit1 и Ig-домена 3 рецептора VEGF Flk1 или Fit4; и

(b) мультимеризующий компонент,

при этом компонент рецептора VEGF согласно (а) является единственным компонентом рецептора VEGF слитого полипептида.

18. Слитый полипептид по п.17, отличающийся тем, что мультимеризующий компонент включает иммуноглобулиновый домен.

19. Слитый полипептид по п.18, отличающийся тем, что иммуноглобулиновый домен выбран из группы, состоящей из домена Fc IgG и тяжелой цепи IgG.

20. Слитый полипептид по п.19, отличающийся тем, что включает аминокислотную последовательность, представленную на фигуре 21А-21С, фигуре 22А-22С или фигуре 24А-24С.

21. Способ подавления активности фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF) у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества слитого полипептида по любому из пп.17-20 или димерного антагониста по п.15 или 16.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.

23. Способ по п.21 или 22, отличающийся тем, что используется для уменьшения или предотвращения роста опухоли, для уменьшения или предотвращения отека, для уменьшения или предотвращения образования асцита, для уменьшения или подавления потери плазмы или для блокирования роста кровеносных сосудов у человека.

Описание изобретения к патенту

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки США №60/138133, поданной 8 июня 1999 г. В данной заявке содержатся ссылки на разные публикации. Указанные публикации в полном объеме включены в данную заявку в качестве ссылки.

Введение

Настоящее изобретение относится к модифицированным полипептидам с улучшенной фармакокинетикой. В частности, данное изобретение относится к полипептидам рецепторов Flt1, которые модифицированы с целью улучшения их фармакокинетического профиля. Данное изобретение относится также к способам получения и применения модифицированных полипептидов, которые включают использование модифицированных полипептидов для уменьшения или подавления потери плазмы и/или проницаемости сосудов у млекопитающего, но не ограничиваются указанным применением.

Предпосылки изобретения

Способность полипептидных лигандов связываться с клетками и таким образом вызывать фенотипическую реакцию, такую как рост, сохранение жизнеспособности, секреция продуктов жизнедеятельности или дифференцировка клеток, часто опосредована трансмембранными рецепторами на клетках. Внеклеточный домен таких рецепторов (то есть часть рецептора, расположенная на поверхности клетки) является наиболее выраженной частью молекулы, так как он содержит белок, способный связываться с лигандом. Связывание лиганда с внеклеточным доменом обычно вызывает трансдукцию сигнала, благодаря которой биологический сигнал передается к внутриклеточным мишеням. Трансдукция сигнала обычно происходит через каталитический внутриклеточный домен. Определенная совокупность элементов последовательности указанного каталитического внутриклеточного домена определяет его доступ к потенциальным субстратам киназы (Mohammadi, et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 11:5068-5078; Fantl, et al., 1992, Cell 69:413-413). Примерами рецепторов, трансдуцирующих сигналы через каталитические внутриклеточные домены, являются рецепторные тирозинкиназы (RTK), в частности семейство рецепторов Trk, которое обычно ограничивается клетками нервной системы, семейство рецепторов цитокинов, включая трехчленный рецепторный комплекс CNTF (Stahl & Yancopoulos, 1994, J. Neurobio, 25:1454-1466), которое также ограничено клетками нервной системы, рецепторы, связанные с G-белком, такие как ₂-адренергический рецептор, обнаруженный, например, на клетках сердечной мышцы, и мультимерный рецептор FcRI с высоким сродством к иммуноглобулину Е (IgE), который находится в основном на тучных клетках и базофилах (Sutton & Gould, 1993, Nature 366:421-428).

Все вышеописанные рецепторы, по-видимому, подвержены димеризации, мультимеризации или некоторым родственным структурным изменениям, происходящим в результате связывания лиганда (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem. Sci. 13:443-447; Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212; Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391), при этом межмолекулярные взаимодействия между димеризуемыми внутриклеточными доменами ведут к активации каталитической функции. Например, в случае полученного из тромбоцитов фактора роста (PDGF) лиганд является димером, который связывает молекулы двух рецепторов (Hart, et al., 1988, Science, 240:1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264:8905-8912), а в случае эпидермального фактора роста (EGF) лиганд является мономером (Weber, et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:14631-14636). В случае рецептора FcRI лиганд IgE связан с FcRI как мономер и активируется только тогда, когда антиген связывается с комплексом IgF/FcRI и образует поперечные сшивки с соседними молекулами IgE (Sutton & Gould, 1993, Nature 366:421-428).

Распределение конкретного рецептора в тканях высших организмов часто позволяет выявить биологическую функцию данного рецептора. В некоторых факторах роста и дифференцировки, таких как фактор роста фибробластов (FGF), сильно экспрессированы RTK, из чего следует, что они играют определенную роль в росте и сохранении тканей. Члены семейства рецепторов Trk RTK (Glass & Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3:262-268), как правило, ограничены клетками нервной системы, и семейство факторов роста нервной ткани, включающее фактор роста нервной ткани (NGF), выделяемый из головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3 (NT-3) и нейротрофин-4/5 (NT-4/5), которые связывают рецепторы семейства Trk RTK, стимулируют дифференцировку разных групп нейронов в головном мозге и периферической системе (Lindsay, R.M., 1993, in Neurotrophic Factors, S.E. Loughlin & J.H.Fallon, eds., pp.257-284, San Diego, CA, Academic Press). Рецептор FcRI находится в очень ограниченном числе типов клеток, таких как тучные клетки и базофилы. Тучные клетки продуцируются линией полипотентных кроветворных стволовых клеток костного мозга, но созревают в ткани после миграции из кровотока (см. Janeway & Travers, 1996, in Immunobiology, 2d. Edition, M. Robertson & E. Lawrence, eds., pp.1:3-1:4, Current Biology Ltd., London, UK, Publisher) и принимают участие в аллергической реакции.

Многие исследования показывают, что внеклеточный домен рецептора обладает свойством связывания специфических лигандов. Кроме того, клеточная среда, в которой экспрессирован рецептор, может влиять на биологическую реакцию, возникающую при связывании лиганда с рецептором. Например, воздействие на нервную клетку, экспрессирующую рецептор Trk, нейротрофином, который связывается с данным рецептором, обусловливает выживаемость и дифференцировку нейронов. Когда тот же рецептор экспрессирован фибробластом, под действием нейротрофина происходит пролиферация фибробластов (Glass, et al., 1991, Cell 66:405-413).

Идентифицирован класс выделяемых из клеток димерных митогенов с избирательностью в отношении эндотелиальных клеток сосудов, который назван фактором роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF). VEGF выделен из кондиционированной питательной среды клеток глиомы крыс [Conn et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87. pp.2628-2632]; кондиционированной питательной среды звездчатых клеток гипофизарных фолликул крупного рогатого скота [Ferrara and Henzel, (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, pp.851-858; Gozpadorowicz et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, pp.7311-7315] и кондиционированной питательной среды клеток U937 человека [Connolly, D.T. et al. (1989), Science, 246, pp.1309-1312]. VEGF является димером со средней молекулярной массой около 46 кДа, при это каждая субъединица имеет среднюю молекулярную массу около 23 кДа. VEGF имеет некоторое структурное сходство с полученным из тромбоцитов фактором роста (PDGF), который является митогеном для клеток соединительной ткани и не является митогеном для эндотелиальных клеток крупных сосудов.

Установлено, что мембраносвязанный рецептор тирозинкиназы, известный как Flt, является рецептором VEGF [DeVries, С. et al., (1992), Science, 255, pp.989-991]. Рецептор Flt связывает VEGF, который индуцирует митогенез. Известно, что другая форма рецептора VEGF, именуемая KDR, также связывает VEGF и индуцирует митогенез. Кроме того, известна неполная последовательность кДНК и почти полноразмерная белковая последовательность KDR [Terman. B.I. et al., (1991), Oncogene 6, pp.1677-1683; Terman, В.I. et al., (1992), Biochem. Biophys. Res. Comm. 187. pp.1579-1586].

Постоянный ангиогенез может стать причиной возникновения или обострения некоторых заболеваний, таких как псориаз, ревматоидный артрит, гемангиома, ангиофиброма, диабетическая ретинопатия и неоваскулярная глаукома. Ингибитор активности VEGF должен быть полезен для лечения таких заболеваний и других типов VEGF-индуцированного патологического ангиогенеза, а также заболеваний, связанных с проницаемостью сосудов, таких как васкуляризация опухоли. Настоящее изобретение относится к ингибитору VEGF на основе рецептора Flt1 VEGF.

Потеря плазмы, которая является основным показателем воспалительного процесса, возникает в отдельной совокупности микрососудов. В частности, потеря плазмы в большинстве органов происходит в венулах. В отличие от артериол и капилляров потеря плазмы из венул возникает под действием многочисленных медиаторов воспаления, включая гистамин, брадикинин и серотонин. Одной отличительной особенностью воспаления является потеря плазмы, которая происходит из межклеточных брешей, образующихся в эндотелии венул. Экспериментальные модели воспалительного процесса показывают, что указанные межклеточные бреши возникают между эндотелиальными клетками посткапиллярных и собирающих венул (Baluk, P., et al., Am. J. Pathol. 1998, 152:1463-76). Установлено, что определенные лектины можно использовать для обнаружения очагов потери плазмы, эндотелиальных брешей и патологических процессов на границах эндотелиальных клеток в воспаленных венулах (Thurston, G., et al., Am. J. Physiol, 1996, 271: Н2547-62). В частности, растительные лектины используют для визуализации морфологических изменений на границах эндотелиальных клеток в воспаленных венулах, например, трахеи крыс. Лектины, такие как конконавалин А и рицин, которые очагово связываются с воспаленными венулами, позволяют обнаружить области в стенке субэндотелиального сосуда с брешами, соответствующими местам потери плазмы (Thurston, G., et al., Am. J. Physiol, 1996, 271: H2547-62).

Капиллярные сосуды характеризуются динамическими свойствами. Хронические воспалительные заболевания обусловлены, в частности, изменением микрососудов, включая ангиогенез и увеличение капиллярных микрососудов. Капиллярные сосуды могут также измениться в результате приобретения неправильных фенотипических свойств. В мышиной модели хронического воспаления дыхательных путей капилляры дыхательных путей приобретают свойства венул, выражающиеся в увеличении диаметра сосудов, повышенной иммунореактивности на фактор фон Виллебранда и повышенной иммунореактивности на Р-селектин. Кроме того, просачиваемость измененных сосудов может возникать под воздействием таких воспалительных медиаторов, которые не оказывают влияния на аналогичные сосуды дыхательных путей у здоровых мышей.

Установлено, что определенные вещества уменьшают или подавляют проницаемость сосудов и/или потерю плазмы. Например, мистиксины являются синтетическими полипептидами, которые подавляют потерю плазмы, не блокируя образование эндотелиальных брешей (Baluk, P., et al., J. Pharmacol. Ехр. Ther., 1998, 284: 693-9). Кроме того, формотерол - агонист бета-2-адренергических рецепторов - уменьшает просачиваемость капиллярных сосудов, подавляя образование эндотелиальных брешей (Baluk, P., and McDonald, D.M., Am. J. Physiol., 1994, 266:L461-8).

Ангиопоэтины и члены семейства факторов роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF) являются единственными факторами роста, которые, как известно, являются в высшей степени специфичными для эндотелиальных клеток сосудов. Исследования по инактивации гена-мишени у мышей показывают, что VEGF необходим на ранних стадиях развития сосудов и Ang-1 необходим на поздних стадиях изменения сосудов.

В патенте США №6011003, выданном 4 января 2000 г. фирме Metris Therapeutics Limited, описана измененная растворимая форма полипептида FLT, способная связываться с VEGF и оказывать таким образом ингибирующее действие на указанный фактор, причем данный полипептид содержит пять или меньше полных доменов иммуноглобулина.

В патенте США №5712380, выданном 27 января 1998 г. фирме Merck & Co., описаны ингибиторы фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF), которые представляют собой природные или полученные методом рекобинантных ДНК растворимые формы, содержащие или не содержащие С-концевую трансмембранную область рецептора для VEGF.

Фирме Merck & Со. принадлежит также заявка РСТ № WO 98/13071, опубликованная 2 апреля 1998 г., в которой описаны методы гемотерапии для подавления первичного роста опухоли и метастазов путем переноса генов нуклеотидной последовательности, кодирующей растворимый рецепторный белок, связывающийся с VEGF.

В заявке фирмы Genentech, Inc. PCT № WO 97/44453, опубликованной 27 ноября 1997 г., описаны новые химерные белки рецепторов VEGF, содержащие аминокислотные последовательности, полученные из рецепторов Flt1 и KDR фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF), включая мышиный гомолог рецептора FLK1 KDR человека, в которых указанные химерные белки рецепторов VEGF связываются с VEGF и оказывают антагонистическое действие на пролиферативную и ангиогенную активность эндотелиальных клеток.

В заявке фирмы Toa Gosei Co., LTD PCT № WO 97/13787, опубликованной 17 апреля 1997 г., описан низкомолекулярный ингибитор VEGF, используемый для лечения болезней, сопровождающихся образованием новых сосудов, таких как солидные опухоли. Полипептид, содержащий первый и второй иммуноглобулиноподобные домены во внеклеточной области рецептора FLT VEGF, но не имеющий шестого и седьмого иммуноглобулиноподобных доменов, оказывает ингибирующее действие на VEGF.

Sharifi, J. et al., 1998, The Quarterly Jour. of Nucl. Med. 42:242-249, указывают, что, поскольку моноклональные антитела (MAb) являются основными, положительно заряженными белками, а клетки млекопитающего заряжены отрицательно, то электростатическое взаимодействие между указанными элементами может вызывать более высокие уровни фонового связывания, что ведет к низкому соотношению между объемом опухоли и нормального органа. Чтобы преодолеть указанных эффект, исследователи попытались увеличить выведение MAb разными методами, в частности при помощи вторичных агентов, а также химической модификации и изменения заряда самого MAb.

Jensen-Pippo, et al., 1996, Pharmaceutical Research 13:102-107, указывают, что обработка полиэтиленгликолем лечебного белка, рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (PEG-G-CSF) человека увеличивает стабильность и сохраняет биологическую активность in vivo при интра-дуоденальном способе введения.

Tsutsumi, et al., 1997, Thromb Haemost. 77:168-73, описывают эксперименты, в которых тромбопоэтическую активность in vivo модифицированного полиэтиленгликолем интерлейкина-6 (MPEG-IL-6), в котором 54% 14 аминогрупп лизина в IL-6 связано с PEG, сравнивали с активностью природного IL-6.

Yang, et al., 1995, Cancer 76:687-94, указывают, что конъюгируя полиэтиленгликоль с рекомбинантным интерлейкином-2 (IL-2) человека, можно получить соединение, а именно модифицированный полиэтиленгликолем IL-2 (PEG-IL-2), которое сохраняет in vitro и in vivo активность IL-2, но характеризуется значительно более продолжительным периодом полужизни в кровотоке.

R. Duncan and F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290-306, 296 (1994), описывают эксперименты по увеличению периода полужизни в плазме аспарагиназы путем конъюгирования с полиэтиленгликолем.

В международной патентной заявке № WO 99/03996 фирмы Regeneron Pharmaceuticals, Inc. и правления Калифорнийского университета, опубликованной 28 января 1999 г., описаны модифицированные полипептиды человека с делениями областей основных аминокислот. Установлено, что модифицированные "ноггин" - полипептиды человека сохраняют биологическую активность, обладая более низким сродством к гепарину и более высокой фармакокинетикой в сыворотке животного по сравнению с немодифицированными "ноггин" - полипептидами человека.

Краткое изложение существа изобретения

Настоящее изобретение относится к антагонистам VEGF с улучшенными фармакокинетическими свойствами. Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый полипептид, способный связывать полипептид VEGF, включающий (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую компонент рецептора VEGF, функционально связанный с (b) нуклеотидной последовательностью, кодирующей мультимеризующий компонент, и в котором компонент рецептора VEGF является единственным компонентом рецептора VEGF слитого полипептида и при этом нуклеотидная последовательность (а) состоит по существу из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность домена 2 Ig внеклеточного домена первого рецептора VEGF, и из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность домена 3 Ig внеклеточного домена второго рецептора VEGF.

В другом варианте осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота первого рецептора VEGF является Flt1.

В другом варианте осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота второго рецептора VEGF является Flk1.

В другом варианте осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота второго рецептора VEGF является Flt4.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая домен 2 Ig внеклеточного домена первого рецептора VEGF, расположена выше нуклеотидной последовательности, кодирующей домен 3 Ig внеклеточного домена второго рецептора VEGF.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая домен 2 Ig внеклеточного домена первого рецептора VEGF, расположена ниже нуклеотидной последовательности, кодирующей домен 3 Ig внеклеточного домена второго рецептора VEGF.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения мультимеризующий компонент содержит домен иммуноглобулина.

В другом варианте осуществления изобретения домен иммуноглобулина выбирают из группы, состоящей из домена Fc IgG, тяжелой цепи IgG и легкой цепи IgG.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения относятся к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный слитый полипептид рецептора Flt1, в которой кодирующая область молекулы нуклеиновой кислоты состоит из нуклеотидной последовательности, выбираемой из группы, состоящей из:

(a) нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 13A-13D;

(b) нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 14А-14С;

(c) нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 15А-15С;

(d) нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 16A-16D;

(e) нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 21А-21С;

(f) нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 22А-22С;

(g) нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 24А-24 С и

(h) нуклеотидной последовательности, которая вследствие вырожденности генетического кода отличается от нуклеотидной последовательности (а), (b), (с), (d), (е), (f) или (g) и которая кодирует молекулу слитого полипептида, обладающую биологической активностью модифицированого слитого полипептида рецептора Flt1.

В другом варианте осуществления изобретения слитый полипептид кодируется вышеописанными выделенными молекулами нуклеиновой кислоты.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к композиции, способной связывать молекулу VEGF с образованием нефункционального комплекса, содержащего мультимер слитого полипептида.

Кроме того, предпочтительной является композиция, в которой мультимер является димером.

В другом варианте осуществления изобретения указанная композиция находится в носителе.

Другой вариант осуществления изобретения относится к вектору, который содержит вышеописанные молекулы нуклеиновой кислоты, включая экспрессирующий вектор, содержащий описанные молекулы нуклеиновой кислоты, в котором молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регулирующей экспрессию последовательностью.

Другие варианты осуществления изобретения относятся к системе вектор-хозяин, предназначенной для продуцирования слитого полипептида, которая содержит экспрессирующий вектор в приемлемой клетке-хозяине; к системе вектор-хозяин, в которой приемлемая клетка-хозяин является бактериальной клеткой, дрожжевой клеткой, клеткой насекомого или клеткой млекопитающего; к системе вектор-хозяин, в которой приемлемая клетка-хозяин является Е.Coli; к системе вектор-хозяин, в которой приемлемая клетка-хозяин является клеткой COS; к системе вектор-хозяин, в которой приемлемая клетка-хозяин является клеткой СНО.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу получения слитого полипептида, который включает выращивание клеток системы вектор-хозяин в условиях, обеспечивающих продуцирование и выделение таким образом полученного слитого полипептида.

Дополнительные варианты осуществления изобретения относятся к слитому полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 10A-10D или 24А-24С, который модифицирован ацетилированием или обработкой полиэтиленгликолем, причем ацетилирование производят по крайней мере при 100-кратном молярном избытке ацетилирующего реагента или при молярном избытке ацетилирующего реагента в пределах от примерно 10-кратного молярного избытка до около 100-кратного молярного избытка либо обработку этиленгликолем производят при использовании PEG с молекулярной массой 10000 или 20000.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу уменьшения или подавления потери плазмы у млекопитающего, который включает введение млекопитающему вышеописанного слитого полипептида, включая варианты осуществления изобретения, в которых млекопитающее является человеком, слитый полипептид ацетилирован или обработан полиэтиленгликолем.

Другие варианты осуществления изобретения относятся к слитому полипептиду, который специфически связывает лиганд рецептора VEGF.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу блокирования роста кровеносных сосудов у человека, который включает введение эффективного количества вышеописанного слитого полипептида.

Кроме того, предпочтительным является способ подавления активности лиганда рецептора VEGF у млекопитающего, который включает введение млекопитающему эффективного количества вышеописанного слитого полипептида.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения относятся к указанным способам, в которых млекопитающее является человеком.

Другие варианты осуществления изобретения относятся к способам замедления или предотвращения роста опухоли у человека; уменьшения или предотвращения отека у человека, в частности отека мозга; уменьшения или предотвращения образования асцита у человека, в частности асцита, обусловленного раком яичника.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения относятся к слитому полипептиду, способному связывать полипептид VEGF, который включает: (а) компонент рецептора VEGF, функционально связанный с (b) мультимеризующим компонентом, причем компонент рецептора VEGF является единственным компонентом рецептором VEGF в слитом полипептиде и состоит по существу из аминокислотной последовательности домена 2 Ig внеклеточного домена первого рецептора VEGF и аминокислотной последовательности домена 3 Ig внеклеточного домена второго рецептора VEGF.

Другой вариант осуществления изобретения относится к слитому полипептиду, в котором первый рецептор VEGF является Flt1.

Другой вариант осуществления изобретения относится к слитому полипептиду, в котором второй рецептор VEGF является Flk1.

Другой вариант осуществления изобретения относится к слитому полипептиду, в котором второй рецептор VEGF является Flt4.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения относятся к слитому полипептиду, в котором аминокислотная последовательность домена 2 Ig внеклеточного домена первого рецептора VEGF расположена выше от аминокислотной последовательности домена 3 Ig внеклеточного домена второго рецептора VEGF, и к слитому полипептиду, в котором аминокислотная последовательность домена 2 Ig внеклеточного домена первого рецептора VEGF расположена ниже от аминокислотной последовательности домена 3 Ig внеклеточного домена второго рецептора VEGF.

В другом варианте осуществления изобретения мультимеризующий компонент слитого полипептида содержит домен иммуноглобулина, включая вариант осуществления изобретения, в котором домен иммуноглобулина выбирают из группы, включающей домен Fc IgG, тяжелую цепь IgG и легкую цепь IgG.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения относятся к слитому полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность модифицированного рецептора Flt1, причем аминокислотную последовательность выбирают из группы, состоящей из:

(а) аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 13A-13D;

(b) аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 14А-14С;

(с) аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 15А-15С;

(d) аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 16A-16D;

(е) аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 21А-21С;

(f) аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 22А-22С; и

(g) аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 24А-24С.

Другой предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу уменьшения или подавления потери плазмы у млекопитающего, который включает введение указанному млекопитающему вышеописанного слитого полипептида.

Альтернативный предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу подавления активности лиганда рецептора VEGF у млекопитающего, который включает введение млекопитающему эффективного количества вышеописанного слитого полипептида.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. IEF-анализ в геле немодифицированного и ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc. Немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc не способен проникать в гель из-за своего показателя pl>9,3, в то время как ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc проникает в гель и уравновешивается при pl 5/2.

Фиг. 2. Связывание немодифицированного и ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc с планшетами, покрытыми Matrigel®. Немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc хорошо связывается с компонентами внеклеточного матрикса в Matrigel®, в то время как ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc не связывается с указанными компонентами.

Фиг. 3. Связывание немодифицированного, ацетилированного и обработанного полиэтиленгликолем белка Flt1(1-3)-Fc при выполнении анализа на основе Biacore. Ацетилированный белок (столбцы 13-16), обработанный полиэтиленгликолем белок (столбцы 17-20) и обработанный гепарином белок Flt1(1-3)-Fc (столбцы 21-24) способны успешно конкурировать со связанным с чипом Biacore белком Flt1(1-3)-Fc по связыванию с VEGF по сравнению с контрольным белком (столбцы 1-4) и посторонним белком (столбцы 5-8). Немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc (столбцы 5-6), по-видимому, лишь частично конкурируют со связанным с чипом Biacore белком Flt1(1-3)-Fc по связыванию с VEGF.

Однако в результате промывки связанных образцов 0,5 М раствором NaCl (столбцы 7-8) получают профиль связывания, аналогичный модифицированным формам Flt1(1-3)-Fc, который свидетельствует о том, что немодифицированный белок проявляет неспецифическое связывание с чипом, которое можно разрушить, производя промывку солевым раствором.

Фиг. 4. Связывание немодифицированного, ацетилированного и обработанного полиэтиленгликолем белка Flt1(1-3)-Fc с VEGF при выполнении твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Обработанные полиэтиленгликолем и ацетилированные белки Flt1(1-3)-Fc связываются с VEGF со сродством, приближающимся к значению, характерному для немодифицированного белка Flt1(1-3)-Fc.

Фиг. 5. Фармакокинетические профили немодифицированного, ацетилированного и обработанного полиэтиленгликолем белка Flt1(1-3)-Fc. Мышам Balb/с (23-28 г) подкожно инъецируют 4 мг/кг немодифицированного, ацетилированного или обработанного полиэтиленгликолем белка Flt1(1-3)-Fc. У мышей из хвоста берут кровь через 1, 2, 4, 6, 24 часа, 2 дня и 3 дня после инъекции белка и анализируют сыворотку, выполняя стандартный анализ ELISA, предназначенный на обнаружения белка Flt1(1-3)-Fc. Т_max для всех белков Flt1(1-3)-Fc находится в интервале от 6 до 24 часов. С_max для разных белков имеет следующие значения: немодифицированный белок: 0,06 мкг/мл - 0,15 мкг/мл; ацетилированный белок: 1/5 мкг/мл - 4,0 мкг/мл и обработанный полиэтиленгликолем белок: примерно 5 мкг/мл.

Фиг. 6А-6В. IEF-анализ в геле немодифицированного и ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc. Немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc не способен проникать в гель из-за своего показателя pl>9,3, в то время как большинство образцов ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc (образцы, ацетилированные 30-100-кратным молярным избытком) проникают в гель и уравновешиваются при pl 4/55-8,43 в зависимости от степени ацетилирования.

Фиг. 7. Связывание немодифицированного и ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc с планшетами, покрытыми Matrigel®. Как и в случае постороннего контрольного белка, rTie2-Fc, ступенчато ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc (образцы, ацетилированные 20- и 30-кратным молярным избытком) не связываются с планшетом, покрытым Matrigel, в то время как неацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc характеризуется значительным связыванием. Образец, ацетилированный 10-кратным молярным избытком, отличается пониженным связыванием, но данная степень ацетилирования не является достаточной для полного блокирования связывания с компонентами внеклеточного матрикса.

Фиг.8. Связывание немодифицированного и ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc при выполнении анализа на основе Biacore. При субстехиометрическом соотношении (0,5 мкг/мл немодифицированного или ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc на 0,2 мкг/мл VEGF) в растворе недостаточно белка Flt1(1-3)-Fc (немодифицированного или ступенчато ацетилированного белка) для полного связывания VEGF. При концентрации 1,0 мкг/мл, которая приближается к стехиометрическому соотношению 1:1, как немодифицированный белок, так и ступенчато ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc лучше конкурируют за преимущественное связывание с VEGF, но при этом по-прежнему недостаточно белка Flt1(1-3)-Fc (немодифицированного или ступенчато ацетилированного белка) для полного насыщения имеющегося VEGF. Однако при концентрации 5, 0 мкг/мл, которая в несколько раз выше стехиометрического соотношения 1:1, как белок Flt1(1-3)-Fc, так и ступенчато ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc способны насыщать VEGF независимо от степени ацетилирования.

Фиг. 9. Фармакокинетические профили немодифицированного и ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc. Мышам Balb/c (23-28 г) подкожно инъецируют 4 мг/кг немодифицированного белка или ступенчато ацетилированных 10-, 20-, 40-, 60-и 100-кратным избытком белков Fit1(1-3)-Fc (3 мыши для немодифицированного белка и образцов, ацетилированных 10-, 20- и 40-кратным избытком, 2 мыши для образцов, ацетилированных 60-и 100-кратным избытком). У мышей из хвоста берут кровь через 1, 2, 4, 6, 24 часа, 2 дня и 3 дня после инъекции. Сыворотку анализируют при помощи стандартного анализа на основе ELISA, предназначенного на обнаружения белка Flt1(1-3)-Fc. Т_max для всех испытанных белков Flt1(1-3)-Fc соответствует 6 часам. С_max имеет следующие значения: немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc - 0/06 мкг/мл; образец, ацетилированный 10-кратным избытком, - 0/7 мкг/мл, образец, ацетилированный 20-кратным избытком, - 2 мкг/мл, образец, ацетилированный 40-кратным избытком, - 4 мкг/мл, образец, ацетилированный 60-кратным избытком, - 2 мкг/мл, образец, ацетилированный 100-кратным избытком, - 1 мкг/мл.

Фиг. 10A-10D. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность белка Flt1(1-3)-Fc.

Фиг. 11. Схематическое изображение структуры Flt1.

Фиг. 12А и 12В. Анализ гидрофильности аминокислотных последовательностей домена 2 Ig и домена 3 Ig Flt1.

Фиг. 13A-13D. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность Mut1:

Фиг. 14А-14С. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность Mut2;

Фиг. 15А-15С. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность Mut3: Flt1(2-3)-Fc.

Фиг. 16A-16D. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность Mut4:

Фиг. 17. Связывание немодифицированного белка Flt1(1-3)-Fc, мутантного белка с делецией основной области Flt1(1-3)-Fc и мутантного белка при выполнении анализа на основе Biacore. При субстехиометрическом соотношении (0,25 мкг/мл Flt1(1-3)-Fc немодифицированных, ацетилированных или генетически модифицированных образцов на 0,1 мкг/мл VEGF) белка Flt1(1-3)-Fc недостаточно для блокирования связывания VEGF с белком Flt1(1-3)-Fc, иммобилизованным на чипе Biacore. При концентрации 0,5 мкг/мл немодифицированного, ацетилированного или генетически модифицированного белка Flt1(1-3)-Fc стехиометрическое соотношение приближается к 1:1 и при этом возрастает способность блокировать связывание VEGF с чипом Biacore. При концентрации 1,0 мкг/мл немодифицированного, ацетилированного или генетически модифицированного белка Flt1(1-3)-Fc, которая примерно соответствует стехиометрическому соотношению 10:1, белки Flt1(1-3)-Fc способны блокировать связывание VEGF с чипом Biacore, но их действие не является эквивалентным. Немодифицированный и ацетилированный белок, а также мутантный белок Mut1: по существу одинаково блокируют связывание VEGF, в то время как мутантный белок Mut4: блокирует связывание менее эффективно.

Фиг. 18. Связывание немодифицированного белка Flt1(1-3)-Fc, Mut1: , Mut2: и Flt1(2-3) мутантных белков с планшетами, покрытыми Matrigel®. Немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc интенсивно связывается с указанными лунками, белок Mut3: Flt1(2-3)-Fc связывается несколько слабее, белок Mlt1; связывается еще слабее и белок Mut2: имеет лучший профиль, связываясь гораздо слабее, чем любые другие мутантные белки. Гликозилированный мутантный белок Mut4: характеризуется минимальным преимуществом при выполнении анализа с использованием Matrigel.

Фиг. 19. Связывание немодифицированного белка Flt1(1-3)-Fc, Mut1: , Mut2: и Flt1(2-3) мутантных белков при выполнении анализа на основе ELISA. При испытанных концентрациях немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc и мутантные белки Mut1: , Mut2: и Flt1(2-3) одинаково связывают VEGF.

Фиг. 20. Фармакокинетические профили немодифицированного белка Flt1(1-3)-Fc, Mut1: , Mut2: и Flt1(2-3) мутантных белков. Указанные реагенты имеют следующие значения C_max: немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc - 0,15 мкг/мл; белок Flt1(1-3)-Fc, ацетилированный 40-кратным молярным избытком, - 1,5 мкг/мл; и Mut1: - 0,7 мкг/мл.

Фиг. 21А-21С. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность модифицированного рецептора Flt1, обозначенного Flt1D2.Flk1D3.FcС1 (а).

Фиг. 22А-22С. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность модифицированного рецептора Flt1, рецептора Flt1, обозначенного Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (a).

Фиг. 23. Анализ внеклеточного матрикса (ЕСМ). Результаты данного анализа показывают, что белки Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (а) значительно хуже связываются с ЕСМ, чем белок Flt1(1-3)-Fc.

Фиг. 24А-24С. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность модифицированного рецептора Flt1, обозначенного VEGFR1R2-FcC1 (a).

Фиг. 25А-25С. Анализ фосфорилирования. При 1,5-молярном избытке белка Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40) или временно экспрессированного белка Flt1D2F1k1D3.FcC1 (а) полностью блокируется стимуляция рецептора тремя вышеуказанными модифицированными рецепторами Flt1 по сравнению со стимуляцией контрольной средой. В отличие от этого временно экспрессированный белок Flt1D2VEGFR3D3.FcC1 (а) не вызывает существенного блокирования при указанном молярном избытке по сравнению со стимуляцией положительным контрольным белком VEGF. Аналогичные результаты показаны на фиг. 25В, где модифицированные рецепторы Flt использованы в трехкратном молярном избытке относительно лиганда VEGF165. На фиг. 25С, где модифицированные рецепторы Flt1 использованы в шестикратном молярном избытке относительно лиганда VEGF165, показано, что временно экспрессированный белок Flt1D2VEGFR3D3.FcC1 (а) частично блокирует обусловленную VEGF165 стимуляцию рецепторов на поверхности клетки.

Фиг. 26А-26В. Анализ фосфорилирования. Обнаружение при помощи вестерн-блоттинга фосфорилированного тирозином белка VEGFR2(Flk1) в результате стимуляции лигандом VEGF165 показывает, что рецепторы на поверхности клетки не фосфорилируются стимулирующими образцами, содержащами VEGF165, который предварительно инкубируют с 1- и 2-кратным молярным избытком (фиг. 26А) или 3- или 4-кратным молярным избытком (фиг. 26В) временно экспрессированного белка Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а), постоянно экспрессированного белка Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или временно экспрессированного белка VEGFR1R2-FcC1 (a). При всех испытанных концентрациях модифицированного рецептора Flt1 происходит полное связывание лиганда VEGF165 во время предварительной инкубации, в результате чего отсутствует детектируемая стимуляция рецепторов на поверхности клеток несвязанным VEGF165 по сравнению со стимуляцией контрольной средой.

Фиг. 27. Анализ пролиферации клеток MG/R2. Следующие модифицированные рецепторы Flt, в частности Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (a), а также посторонний рецептор, обозначенный как Tie2-Fc, используемый в качестве отрицательного контрольного образца, титруют в пределах от 40 нМ до 20 пМ и инкубируют на клетках в течение 1 часа при 37°С. Затем во все лунки добавляют рекомбинантный белок VEGF165 человека в концентрации 1,56 нМ, находящийся в среде определенного состава. Отрицательный контрольный рецептор Tie2-Fc, используемый в любой концентрации, не блокирует обусловленную VEGF165 пролиферацию клеток, в то время как Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) блокирует 1,56 нМ VEGF165 при половине максимальной дозы, равной 0,8 нМ. Белки Flt1(1-3)-Fc и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (а) менее эффективно блокируют VEGF165 в данном анализе при половине максимальной дозы, равной ˜2 нМ. Используемый отдельно белок VEGF165 дает результат, равный 1,2 единицам поглощения, при этом фоновое поглощение равно 0,38 единицы.

Фиг. 28. Определение стехиометрии связывания анализом на основе Biacore. Стехиометрию связывания вычисляют в виде молярного отношения связанного VEGF165 к иммобилизованному Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFRlR2-FcC1 (а), используя коэффициент превращения, равный 1000 крысиных единиц (RU), который эквивалентен 1 нг/мл. Результаты показывают, что стехиометрия связывания равна одной димерной молекуле VEGF165 на одну молекулу Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFRlR2-FcC1 (a).

Фиг. 29 и 30. Определение стехиометрии вытеснительной хроматографией. Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (а) в концентрации 1 нМ (которая в 1000 раз превышает KD взаимодействия Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (a) /VEGF165 смешивают с VEGF165 в разных концентрациях. После инкубации измеряют концентрацию свободного Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) в растворе. Данные показывают, что добавление 1 нМ VEGF165 в раствор Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) полностью блокирует связывание Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) с поверхностью VEGF165. Полученный результат позволяет предположить, что стехиометрия связывания равна одной молекуле VEGF165 на одну молекулу Flt1D2Flk1D3.FcC1 (a).

Фиг. 31. Вытеснительная хроматография (SEC) в естественных условиях. Пик №1 соответствует комплексу Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) /VEGF165 и пик №2 соответствует несвязанному белку VEGF165. Фракции, элюированные в пределах 1,1 и 1,2 мл, объединяют и добавляют гидрохлорид гуанидина (GuHCl) до конечной концентрации 4,5 М для диссоциации комплекса.

Фиг. 32. Вытеснительная хроматография (SEC) в условиях диссоциации. Чтобы разделить компоненты комплекса рецептор-лиганд и определить их молярное соотношение, 50 мкл диссоциированного комплекса загружают на колонку с суперозой Superose 12 PC 3.2/30, уравновешенную 6 М раствором GuHCl, и элюируют. Пик №1 соответствует Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) и пик №2 соответствует VEGF165.

Фиг. 33, 34 и 35. Вытеснительная хроматография (SEC) со светорассеянием в оперативном режиме. Для определения молекулярной массы (MW) комплекса рецептор-лиганд используют колонку для вытеснительной хроматографии с детектором светорассеяния в оперативном режиме MiniDawn (Wyatt Technology, Santa Barbara, California) и детекторами показателя преломления (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japan). Как показано на фиг. 33, профиль элюирования включает два пика. Пик №1 соответствует комплексу рецептор-лиганд и пик №2 соответствует несвязанному белку VEGF165. Молекулярную массу высчитывают на основании сигналов светорассеяния (LS) и показателя преломления (RI). Аналогичную процедуру используют для определения молекулярной массы отдельных компонентов комплекса рецептор-лиганд. Ниже приведены результаты указанных определений: молекулярная масса комплекса Flt1D2Flk1D3.FcС1 (a)/VEGF165 в положении пика равна 157300 (фиг. 33), молекулярная масса VEGF165 в положении пика равна 44390 (фиг. 34) и молекулярная масса R1R2 в положении пика равна 113300 (фиг. 35).

Фиг. 36. Пептидное картирование и анализ гликозилирования. Дисульфидные структуры и сайты гликозилирования в Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а) определяют методом пептидного картирования. Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) содержит в общей сложности десять цистеинов, шесть из которых относятся к области Fc. Cys27 связан дисульфидной связью с Cys76. Cys121 связан дисульфидной связью с Cys182. Два первых цистеина в области Fc (Cys211 и Cys214) образуют межмолекулярную дисульфидную связь с двумя аналогичными цистеинами в другой цепи Fc. Однако невозможно определить, образуется ли дисульфидная связь между одинаковыми цистеинами (например, Cys211 с Cys211) или между Cys211 и Cys214. Cys216 связан дисульфидной связью с Cys 306. Cys352 связан дисульфидной связью с Cys410.

В Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а) имеется пять вероятных N-связанных сайтов гликозилирования, которые, как известно, гликозилированы в разной степени. Полное гликозилирование наблюдается на сайтах Asn 33, Asn193 и Asn282. Частичное гликозилирование наблюдается на сайтах Asn65 и Asn120. Сайты гликозилирования на чертеже подчеркнуты.

Фиг. 37. Фармакокинетика Flt1(1-3)-Fc (А40), Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (а). Мышам Balb/c подкожно инъецируют 4 мг/кг Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2Flk1D3.FcC1 (a), временно экспрессированного в яичнике китайского хомячка (СНО), Flt1D2Flk1D3.FcС1 (a), постоянно экспрессированного в СНО, и VEGFRlR2-Fcd(a), временно экспрессированного в СНО. У мышей из хвоста берут кровь через 1, 2, 4, 6, 24 часа, 2 дня, 3 дня и 6 дней после инъекции. Сыворотку анализируют при помощи ELISA, предназначенного для обнаружения Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (a). Т_max для Flt1(1-3)-Fc (A40) соответствует 6 часам, в то время как Т_max для временно и постоянно экспрессированного белка Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) и временно экспрессированного белка VEGFR1R2-FcС1 (а) соответствует 24 часам. С_max для Flt1(1-3)-Fc (A40) равно 8 мкг/мл, C_max для временно экспрессированных белков Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) и VEGFR1R2-FcC1 (а) равно 18 мкг/мл и C_max для постоянно экспрессированного белка VEGFR1R2-FcC1 (а) равно 30 мкг/мл.

Фиг. 38. Фармакокинетика Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcС1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3-FcC1 (a). Мышам Balb/c подкожно инъецируют 4 мг/кг Fltl(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (a), временно экспрессированного в яичнике китайского хомячка (СНО), и Flt1D2.VEGFR3D3-FcC1 (а), временно экспрессированного в СНО. У мышей из хвоста берут кровь через 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 и 20 дней после инъекции. Сыворотку анализируют при помощи ELISA, предназначенного для обнаружения Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) или Flt1D2.VEGFR3D3-FcC1 (a). Flt1(1-3)-Fc (A40) не обнаружен в сыворотке через 5 дней, а Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3-FcC1 (а) обнаружены через 15 и более дней.

Фиг. 39. Способность Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) подавлять рост опухоли фибросаркомы НТ-1080 in vivo. Введение мышам SCID через день или 2 раза в неделю FltlD2.Flk1D3.FcC1 (а) в дозе 25 мг/кг существенно уменьшает рост подкожных опухолей фибросаркомы НТ-1080.

Фиг. 40. Способность Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) подавлять рост опухоли глиомы С6 in vivo. Введение мышам SCID через день или 2 раза в неделю Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) в дозе 2,5 мг/кг существенно уменьшает рост подкожных опухолей глиомы С6.

Фиг. 41. VEGF-индуцированная повышенная проницаемость матки. Подкожное введение PMSG (5 м.е.) с целью овуляции самок крыс в препубертатном периоде стимулирует выброс эстрадиола через 2 дня, что в свою очередь вызывает индукцию VEGF в матке. Указанная индукция увеличивает проницаемость матки и содержание в ней жидкости. Подкожное введение Flt(1-3)-Fc (А40), Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) или FltD2,VEGFR3D3-FcC1 (а) в дозе 25 мг/кг через 1 час после введения PMSG примерно на 50% уменьшает массу жидкости в матке.

Фиг. 42А-42В. Оценка ангиогенеза желтого тела с использованием прогестерона в качестве тестирующего агента. Подкожное введение PMSG (5 м.е.) для индуцирования овуляции самок крыс в препубертатном периоде вызывает образование активного желтого тела с плотной сетью кровеносных сосудов, которое секретирует прогестерон в кровоток, подготавливая матку к оплодотворению. Для образования кровеносных сосудов в желтом теле необходим VEGF. Уровни прогестерона в состоянии покоя равны примерно 5 нг/мл и могут быть доведены до 25-40 нг/мл после введения PMSG. Подкожная инъекция Flt1(1-3)-Fc (А40) или Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) в дозе 25 мг/кг или 5 мг/кг через 1 час после введения PMSG полностью подавляет индукцию прогестерона на 4-й день.

Подробное описание изобретения

В данной области давно существует проблема получения антагониста VEGF на основе рецептора, фармакокинетический профиль которого позволил бы рассматривать антагонист в качестве возможного лекарственного средства. Авторы настоящего изобретения впервые описывают молекулу химерного полипептида, способную подавлять активность VEGF, которая обладает улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с другими известными антагонистами VEGF на основе рецептора. Молекулы химерного полипептида, рассматриваемые в данном описании изобретения, впервые стали пригодны для применения в лечебной практике, целью которой является подавление активности VEGF.

Настоящее изобретение относится к новым молекулам химерного полипептида, полученным путем слияния модифицированного внеклеточного связывающего лиганд домена рецептора Flt1 с областью Fc иммуноглобулина G (IgG).

Внеклеточный связывающий лиганд домен определяется как часть рецептора, который по своей нативной конформации в клеточной мембране имеет внеклеточную ориентацию, где он может контактировать с родственным лигандом. Внеклеточный связывающий лиганд домен не содержит гидрофобных аминокислот, характерных для трансмембранного домена рецептора, или любых других аминокислот, характерных для внутриклеточного домена рецептора. Внутриклеточный или цитоплазматический домен рецептора обычно включает положительно заряженные или полярные аминокислоты (то есть лизин, аргинин, гистидин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту). Предшествующие (15-30), преимущественно гидрофобные или неполярные аминокислоты (то есть лейцин, валин, изолейцин и фенилаланин) образуют трансмембранный домен. Внеклеточный домен содержит аминокислоты, которые предшествуют гидрофобному трансмембранному фрагменту аминокислот. Трансмембранный домен обычно фланкирован положительно заряженными или полярными аминокислотами, такими как лизин или аргинин. Фон Гейне опубликовал детальные правила, позволяющие специалистам в данной области определить, какие аминокислоты данного рецептора относятся к внеклеточным, трансмембранным или внутриклеточным доменам (см. von Heijne, 1995, BioEssays 17:25-30). Информацию о прогнозировании доменов белка можно альтернативно получить на таких Web-сайтах сети Интернет, как http://ulrec3.unil.ch/software/TMPRED_form.html.

Настоящее изобретение относится к конструированию молекул нуклеиновых кислот, кодирующих молекулы химерных полипептидов, которые встраивают в вектор, способный экспрессировать молекулы химерных полипептидов при введении в приемлемую клетку-хозяина. Приемлемыми клетками-хозяевами являются, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Для конструирования экспрессирующих векторов, кодирующих молекулы химерных полипептидов под контролем сигналов транскрипционного/трансляционного контроля, можно использовать любые методы, применяемые специалистами в данной области для встраивания фрагментов ДНК в вектор. Указанные методы могут включать методы рекомбинантных ДНК и методы синтеза in vitro и рекомбинации in vivo (генетическую рекомбинацию) (см. Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY).

Экспрессию молекул нуклеиновых кислот, кодирующих молекулы химерных полипептидов, можно регулировать второй нуклеотидной последовательностью так, чтобы молекула химерного полипептида была экспрессирована в хозяине, трансформированном молекулой рекомбинантной ДНК. Например, экспрессию описанных молекул химерных полипептидов можно регулировать любым промотором/энхансером, известным в данной области. Промоторы, которые можно использовать для регулирования экспрессии молекул химерных полипептидов, включают, но не ограничиваются ими, длинный концевой повтор, описанный в статье Скуинто и др. (Squinto et al., 1991, Cell 65:1-20); раннюю промоторную область SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), промотор CMV, 5'-концевой повтор М-MuLV, промотор, находящийся в длинном 3'-концевом повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), промотор тимидинкиназы герпеса (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), регуляторные последовательности гена металлотионина (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); про-кариотические экспрессирующие векторы, такие как промотор -лактамазы (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) или tac-промотор (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25, см. также "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94); промоторы из дрожжей или других грибов, такие как промотор Gal 4, промотор ADH (алкогольдегидрогеназы), промотор PGK (фосфоглицеролкиназы), промотор щелочной фосфатазы и нижеследующие животные области транскрипционного контроля животных, которые характеризуются тканевой специфичностью и используются в трансгенных животных: область генного контроля эластазы I, которая активна в ацинарных клетках поджелудочной железы (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); область генного контроля инсулина, которая активна в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), область генного контроля иммуноглобулина, которая активна в лимфоидных клетках (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), область вирусного контроля опухоли молочной железы у мышей, которая активна в клетках яичка, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), область генного контроля альбумина, которая активна в печени (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), область генного контроля альфа-фетопротеина, которая активна в печени (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); область генного контроля альфа-1-антитрипсина, которая активна в печени (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), область генного контроля бета-глобина, которая активна в миелоидных клетках (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); область генного контроля основного белка миелина, которая активна в олигодендроцитах головного мозга (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); область генного контроля легкой цепи-2 миозина, которая активна в скелетных мышцах (Shani, 1985, Nature 314:283-286) и область генного контроля гонадотропного гормона, которая активна в гипоталамусе (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением экспрессирующие векторы, способные реплицироваться в бактериальном или эукариотическом хозяине и содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую вышеописанную молекулу химерного полипептида, используют для трансфекции хозяина, тем самым регулируя экспрессию таких нуклеиновых кислот с целью продуцирования молекул химерного полипептида, которые затем могут быть выделены в биологически активной форме. В используемом здесь значении термин "биологически активная форма" означает форму, способную связываться с VEGF.

Экспрессирующие векторы, содержащие описанные молекулы химерной нуклеиновой кислоты, можно идентифицировать по трем общим признакам: (а) гибридизация ДНК-ДНК, (b) наличие или отсутствие функций гена-"маркера" и (с) экспрессия встроенных последовательностей. В соответствии с первым признаком наличие чужеродного гена, встроенного в экспрессирующий вектор, можно обнаружить по гибридизации ДНК-ДНК, используя зонды, содержащие последовательности, которые гомологичны вставленным последовательностям молекул химерных полипептидов. В соответствии с вторым подходом рекомбинантную систему вектор/хозяин можно идентифицировать и выбрать с учетом наличия или отсутствия определенных функций гена-"маркера" (например, активность тимидинкиназы, устойчивость к антибиотикам, фенотип трансформации, образование телец включения в бакуловирусе и т.д.), вызванных введением чужеродных генов в вектор. Например, если последовательность ДНК молекулы химерного полипептида встроена в последовательность гена-маркера вектора, рекомбинанты, содержащие вставку, можно обнаружить по отсутствию функции гена-маркера. В соответствии с третьим подходом рекомбинантные экспрессирующие векторы можно идентифицировать, анализируя продукт чужеродного гена, экспрессированный рекомбинантом. Такие анализы могут быть основаны, например, на физических или функциональных свойствах молекул химерных полипептидов.

Клетки по настоящему изобретению могут временно или предпочтительно структурно и постоянно экспрессировать молекулы химерных полипептидов.

Молекулы химерных полипептидов можно очистить любым методом, который в дальнейшем позволяет получить устойчивую, биологически активную молекулу химерного полипептида. В качестве примера, не ограничивающего объем изобретения, можно отметить, что факторы можно выделить из клеток в виде растворимых белков или телец включения, из которых их можно экстрагировать в количественном отношении 8 М раствором гидрохлорида гуанидина и диализом (см., например, Builder, et al., патент США №5663304). Для дальнейшей очистки факторов можно использовать стандартную ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой и гель-фильтрацию.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая первый компонент, расположена вверху от нуклеотидной последовательности. кодирующей второй компонент. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая первый компонент, расположена внизу от нуклеотидной последовательности, кодирующей второй компонент. Возможны другие варианты осуществления изобретения, в которых изменен порядок расположения первого, второго и третьего компонентов слитого полипептида. Например, если нуклеотидная последовательность, кодирующая первый компонент, обозначена 1, нуклеотидная последовательность, кодирующая второй компонент, обозначена 2 и нуклеотидная последовательность третьего компонента обозначена 3, то порядок компонентов в выделенной нуклеиновой кислоте по данному изобретению при считывания от 5'-конца к 3'-концу может представлять собой любую из следующих шести комбинаций: 1, 2, 3; 1, 3, 2; 2, 1, 3; 2, 3, 1; 3, 1, 2 или 3, 2, 1.

Настоящее изобретение может быть также использовано для диагностических и терапевтических целей. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения методы обнаружения аберраций в функции или экспрессии вышеописанных молекул химерных полипептидов можно использовать для диагностики расстройств. В соответствии с другими вариантами осуществления изобретения, манипулируя молекулами химерных полипептидов, агонистами или антагонистами, которые связывают молекулы химерных полипептидов, можно лечить болезни. В соответствии с другими вариантами осуществления изобретения молекулу химерного полипептида можно использовать в качестве агента, блокирующего связывание связывающего агента с его мишенью.

В качестве примера, не ограничивающего объем изобретения, следует отметить, что способ по данному изобретению можно эффективно использовать для лечения клинических состояний, которые характеризуются проницаемостью сосудов, отеком или воспалением, таких как отек головного мозга, вызванный травмой, инсультом или опухолью; отек, вызыванный воспалительными процессами, такими как псориаз или артрит, включая ревматоидный артрит; астма, генерализованный отек, вызванный ожогами; асциты и плеврит, вызванные опухолями, воспалением или травмой; хроническое воспаление дыхательных путей; синдром проницаемости капиллярных сосудов; сепсис; заболевание почек, вызванное повышенной потерей белка; и заболевания глаз, такие как старческая дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия.

Анализ аминокислотной последовательности Flt1(1-3)-Fc показывает наличие необычайно большого числа (46) основного аминокислотного остатка лизина. IEF-анализ белка Fltl(1-3)-Fc показывает, что значение pl белка превышает 9,3, подтверждая предположение, что данный белок является в высшей степени основным. Существует гипотеза о том, что основная природа белка Flt1(1-3)-Fc заставляет его связываться с компонентами внеклеточного матрикса и что указанное взаимодействие может быть вызвано чрезвычайно коротким обнаруживаемым периодом полувыведения из сыворотки крови, характерным для Flt1(1-3)-Fc, при инъецировании мышам. Для проверки данной гипотезы белок Flt1(1-3)-Fc ацетилируют у остатков лизина, чтобы уменьшить основность. Ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc испытывают, выполняя описанные ниже анализы.

Следующие примеры приведены только для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Экспрессия белка Flt1(1-3)-Fc в клетках К1 СНО

Используя стандартные методы молекулярной биологии (см., например, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY)), ген, кодирующий Flt1(1-3)-Fc, вводят в экспрессирующий вектор рЕЕ14.1 (Lonza Biologies, plc) на сайте множественного клонирования ниже промотора CMV. Клетки К1 СНО трансфецируют конструкцией ДНК рЕЕ14.1/Flt1(1-3)-Fc, используя липофектамин (Gaithersburg, MD). Трансфецированные клетки K1 CHO выращивают в не содержащей глутамина среде DMEM (JRH, Kansas City, МО), включающей 25 мкМ метионинсульфоксимина (MSX) фирмы Sigma Inc., St. Louis, МО, и получают экспрессоры рекомбинантного белка, исследуя супернатанты клеток K1 CHO из более чем 100 собранных вручную изолятов колоний при помощи стандартного иммуноанализа, который позволяет обнаружить и выделить Fc человека. Выбранный собранный вручную клон амплифицируют в присутствии 100 мкМ MSX и выполняют вторую серию исследований амплифицированных клонов. Специфическая продуктивность рекомбинантного белка Flt1(1-3)-Fc самого продуцирующего клона равна 55 пг/клетку/в день.

Выбранный клон размножают в Т-образных колбах емкостью 225 см ² (Corning, Acton, MA) и затем вводят во вращающиеся флаконы емкостью 8/5 л (Corning, Acton, MA), используя вышеописанные среды для культивирования клеток. Клетки удаляют из вращающихся флаконов при помощи стандартной обработки трипсином и помещают в 3,5 л суспендирующей среды. Суспендирующая среда представляет собой не содержащую глутамина среду ISCHO (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), включающую 5% фетальной телячьей сыворотки (FBS фирмы Hyclone Labs, Logan, UT), 100 мкМ MSX и добавку GS (JRH Scientific, Kansas City, МО), которая находится в биореакторе Celligen емкостью 5 л (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) с плотностью 0,3×10⁶ клеток/мл. Когда клетки достигают плотности 3,6×10⁶/мл и адаптируются к суспензии, их переносят в биореактор емкостью 60 л (АВЕС, Allentown, PA) с плотностью 0,5×10⁶ клеток/мл в 20 л среды ISCHO с 5% фетальной телячьей сыворотки. Через два дня в биореатор дополнительно вводят 20 л ISCHO+5% фетальной телячьей сыворотки. Клетки выращивают в течение еще двух дней до достижения конечной плотности, равной 3,1×10⁶ клеток/мл, при этом конечная концентрация Fltl(1-3)-Fc во время сбора клеток равна 95 мг/л. Собранные клетки удаляют фильтрацией тангенциального потока, используя 0,45 мкм фильтры Prostak (Millipore, Inc., Bedford, MA).

Пример 2. Очистка белка Flt1(1-3)-Fc, полученного из клеток К1 СНО

Белок Flt1(1-3)-Fc первоначально очищают аффинной хроматографией. Для связывания с высокой специфичностью части Fc молекулы используют колонку Protein А. Очищенный по сродству белок концентрируют и пропускают через колонку SEC. Затем белок элюируют в буфере. Ниже подробно описаны указанные способы.

Материалы и методы

Все химические вещества предоставлены фирмой J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, за исключением PBS, который предоставлен в виде 10-кратного концентрата фирмой Life Technologies, Gaithersburg, MD. Смолы для препаратов Protein A Fast Flow и Superdex 200 предоставлены фирмой Pharmacia, Piscataway, NJ. Оборудование и мембраны для концентрирования белка предоставлены фирмой Millipore, Bedford, MA.

Примерно 40 л фильтрованной через 0,45 мкм фильтры кондиционированной клетками СНО среды, содержащей белок Flt1(1-3)-Fc, вводят в 290 мл колонку Protein A Fast Flow (диаметр 10 см), которую предварительно уравновешивают PBS. Колонку промывают PBS, содержащим 350 мМ NaCl и 0,02% CHAPS, и связанный белок элюируют 20 мМ лимонной кислоты, содержащей 10 мМ Na₂HPO₄. В результате элюирования получен один пик и его показатель рН доведен до нейтрального значения 1М раствором NaOH. Фракции элюата концентрируют примерно до 9 мг/мл фильтрацией тангенциального потока через регенерированные целлюлозные мембраны с молекулярной массой 10000 и концентрированием перемешиваемых клеток. Чтобы удалить агрегаты и другие загрязняющие примеси, концентрированный белок вводят в колонку, заполненную смолой для препаратов Superdex 200 (10 см ×5 см), и исследуют в PBS, содержащем 5% глицерина. Основные пиковые фракции объединяют, фильтруют в стерильных условиях, отбирают аликвоту белка и хранят при -80°С.

Пример 3. Ацетилирование белка Fltl(1-3)-Fc

Два миллиграмма белка Fltl(1-3)-Fc ацетилируют в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для модификации сульфо-NHS-ацетатом (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat.#26777).

Пример 4. Исследование ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc

(а) IEF-анализ. Белок Fltl(1-3)-Fc и ацетилированный белок Flfc1(1-3)-Fc анализируют, выполняя стандартный IEF-анализ. Как показано на фиг. 1, белок Flt1(1-3)-Fc не способен проникать в гель, поэтому он должен иметь показатель pl выше 9,3, который является наибольшим показателем pl в контроле. Однако ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc может проникать в гель и уравновешивается при pl около 5,2. Полученный результат показывает, что ацетилирование значительно уменьшает суммарный положительный заряд белка, а также показатель pl.

(b) Связывание с компонентами внеклеточного матрикса

Связывание белка Flt1(1-3)-Fc и ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc с компонентами внеклеточного матрикса испытывают, выполняя анализ, имитирующий взаимодействие с компонентами внеклеточного матрикса. При выполнении данного анализа 96-луночные планшеты для культивирования ткани покрывают Matrigel (96-луночный планшет с тонким слоем матрикса Biocoat MATRIGEL®, № каталога 40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA). Планшеты инкубируют, добавляя в лунки разные концентрации белка Flt1(1-3)-Fc, ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc или rTie2-Fc (посторонний контрольный белок). Планшеты инкубируют в течение 1-2 часов при комнатной температуре или 37°С и детектируют связанные белки, добавляя в лунки вторичное, конъюгированное со щелочной фосфатазой антитело против Fc человека. Затем в лунки добавляют субстрат на основе щелочной фосфатазы и измеряют оптическую плотность. На фиг.2 показаны результаты данного анализа. Подобно постороннему контрольному белку rTie2-Fc ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc не связывается с планшетом, покрытым Matrigel, в то время как неацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc характеризуется значительным связыванием. Полученные результаты показывают, что ацетилирование основных аминокислотных остатков является эффективным способом подавлять взаимодействие зарядов, которое происходит между положительно заряженными белками и отрицательно заряженными компонентами внеклеточного матрикса in vivo.

Пример 5. Обработка белка Flt1(1-3)-Fc полиэтиленгликолем

Хотя известно, что обработка белков полиэтиленгликолем (PEG) усиливает их активность in vivo, повышая устойчивость и биологическую доступность и доводя до минимума иммуногенность (см. приведенные выше ссылки), существует противоположное мнение, что молекулы полиэтиленгликоля, которые являются слишком большими и не могут быть отфильтрованы клубочками почек, улучшают фармакокинетические свойства белков. Не ограничивая себя теорией, авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что обработка молекул Flt1(1-3)-Fc полиэтиленгликолем может улучшить фармакокинетические свойства, но не вследствие изменения положительного заряда или уменьшения значения pl Flt1(1-3)-Fc, а в результате физической защиты положительных зарядов от взаимодействия с внеклеточным матриксом. Авторы настоящего изобретения сделали попытку улучшить фармакокинетические свойства молекул Flt1(1-3)-Fc путем присоединения цепей полиэтиленгликолей с молекулярной массой 20000, как это описано ниже.

Материалы и методы

Очищенный белок Flt1(1-3)-Fc, выделенный из клеток СНО (см. выше), используют в нижеследующих экспериментах по обработке полиэтиленгликолем. Функциональные полиэтиленгликоли предоставлены фирмой Shearwater Polymers, Huntsville, AL.; бицин предоставлен фирмой Sigma, St. Louis, МО; колонка с суперозой Superose 6 предоставлена фирмой Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS в виде 10-кратного концентрата предоставлен фирмой Life Technologies, Gaithersburg, MD; глицерин предоставлен фирмой J.Т.Baker, Phillipsburg, NJ; и преформированные гели Bis-Tris предоставлены фирмой Novex, СА.

В лабораторных исследованиях использованы цепи PEG с молекулярной массой 20000, имеющие функциональные аминспецифические концевые части, которые предназначены для оценки разных условий реакций, в которых изменяется стехиометрия PEG:белок. Выполняя указанные реакции и анализируя образцы стандартным методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), белок Flt1(1-3)-Fc в концентрации 1,5 мг/мл подвергают взаимодействию при рН 8,1 с молекулами SPA-PEG (сукцинимидилпропионат полиэтиленгликоля) с молекулярной массой 20000 при молярном соотношении PEG и мономера Flt1(1-3)-Fc, равном 1:6. Реакцию выполняют при 8°С в течение ночи. Для первичной очистки продукты реакции вводят в колонку с суперозой Superose 6, 10 мм×30 см, уравновешенную PBS, содержащим 5% глицерина. В колонке происходит разделение обработанных полиэтиленгликолем молекул Flt1(1-3)-Fc в соответствии со степенью обработки полиэтиленгликолем. Объединяют фракции, соответствующие однократно и двукратно обработанному полиэтиленгликолем димерному белку Flt1(1-3)-Fc, судя по характеру полос на восстанавливающих и невосстанавливающих гелях для SDS-PAGE. Концентрацию белка определяют, измеряя оптическую плотность при 280 нм. Обработанный полиэтиленгликолем белок Flt1(1-3)-Fc фильтруют в стерильных условиях, отбирают аликвоту белка и хранят при -40°С.

Пример 6. Связывание немодифицированного, ацетилированного и обработанного полиэтиленгликолем белка Flt1(1-3)-Fc при выполнении анализа на основе Biacore

Немодифицированные, ацетилированные и обработанные полиэтиленгликолем белки Flt1(1-3)-Fc испытывают, выполняя анализ на основе Biacore, с целью оценки их способности связываться с лигандом Flt1, VEGF. При выполнении данного анализа немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc иммобилизуют на поверхности чипа Biacore (см. инструкции по использованию чипа Biacore, фирма Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, для выполнения стандартных анализов) и образец, содержащий 0,2 мкг/мл VEGF и немодифицированный, ацетилированный или обработанный полиэтиленгликолем белок Flt1(1-3)-Fc (каждый в концентрации 25 мкг/мл) пропускают через чип, покрытый Flt1(1-3)-Fc. Чтобы свести до минимума эффекты неспецифического связывания, связанные образцы промывают 0,5 М раствором NaCl. В одном образце немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc смешивают с гепарином. Гепарин имеет отрицательно заряженную молекулу, и белок Flt1(1-3)-Fc имеет положительно заряженную молекулу, поэтому при смешивании двух таких молекул они должны взаимодействовать благодаря своим зарядам. Это по существу нейтрализует присущий белку Flt1(1-3)-Fc положительный заряд, при этом молекула приобретает свойства химически или генетически модифицированной молекулы, в связи с чем уменьшается ее заряд и способность связываться в результате взаимодействия зарядов. Как показано на фиг. 3, ацетилированные (столбцы 13-16), обработанные полиэтиленгликолем (столбцы 17-20) и обработанные гепарином белки Flt1(1-3)-Fc (столбцы 21-24) способны полностью конкурировать со связанным с чипом Biacore белком Flt1(1-3)-Fc за связывание с VEGF по сравнению с контрольным образцом (столбцы 1-4) и посторонним белком (столбцы 5-8). Немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc (столбцы 5-6), по-видимому, только частично конкурирует со связанным с чипом Biacore белком Flt1(1-3)-Fc за связывание VEGF. Однако, промывая связанные образцы 0,5 М раствором NaCl (столбцы 7-8), получают профиль связывания, аналогичный модифицированным формам белка Flt1(1-3)-Fc, который свидетельствует о том, что немодифицированный белок образует неспецифическую связь с чипом, которую можно разрушить, производя промывку солевым раствором.

Пример 7. Связывание немодифицированного, ацетилированного и обработанного полиэтиленгликолем белка Flt1(1-3)-Fc при выполнении анализа на основе ELISA

Немодифицированные, ацетилированные и обработанные полиэтиленгликолем белки Flt1(1-3)-Fc испытывают при помощи стандартного анализа на основе ELISA с целью оценки их способности связывать лиганд VEGF рецептора Flt1. Как показано на фиг. 4, как обработанные полиэтиленгликолем, так и ацетилированные белки Flt1(1-3)-Fc способны связываться с VEGF, свидетельствуя о том, что модификация белка обработкой полиэтиленгликолем или ацетилированием не влияет на его способность связывать указанный лиганд.

Пример 8. Фармакокинетический анализ немодифицированного, ацетилированного и обработанного полиэтиленгликолем белка Flt1(1-3)-Fc

Эксперименты in vivo выполняют для оценки фармакокинестических профилей немодифицированного, ацетилированного и обработанного полиэтиленгликолем белка Flt1(1-3)-Fc. Мышам Balb/c (23-28 г; 3 мыши в группе) подкожно инъецируют 4 мг/кг немодифицированного, ацетилированного или обработанного полиэтиленгликолем белка Flt1(1-3)-Fc. У мышей из хвоста берут кровь через 1, 2, 4, 6, 24 часа, 2 дня и 3 дня после инъекции белка. Сыворотку анализируют при помощи стандартного анализа на основе ELISA, предназначенного для обнаружения белка Flt1(1-3)-Fc. Процедуру анализа можно кратко описать следующим образом: планшет для ELISA покрывают VEGF, связывают сыворотку, содержащую немодифицированный, ацетилированный или обработанный полиэтиленгликолем белок Flt1(1-3)-Fc, и считывают результаты, используя антитело против Fc, связанное со щелочной фосфатазой. Как показано на фиг. 5, Т_max для всех белков Flt1(1-3)-Fc находится в интервале от 6 до 24 часов. С_max для разных белков имеет следующие значения: немодифицированный белок: 0,06 мкг/мл - 0,15 мкг/мл; ацетилированный белок: 1,5 мкг/мл - 4,0 мкг/мл и обработанный полиэтиленгликолем белок: примерно 5 мкг/мл.

Пример 9. Ступенчатое ацетилирование белка Flt1(1-3)-Fc

Чтобы определить минимальную степень ацетилирования, необходимую для устранения связывания с компонентами внеклеточного матрикса, производят ступенчатое ацетилирование белка Flt1(1-3)-Fc, используя возрастающие количества молярного избытка ацетилирующего реагента в ацетилируемой реакционной смеси. Используют следующие молярные избытки: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и 100 молей ацетилирующего реагента на 1 моль мономера Flt1(1-3)-Fc. Реакции выполняют в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для модификации сульфо-NHS-ацетатом (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat. #26777).

Пример 10. Исследование ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc

(а) IEF-анализ. Немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc и ступенчато ацетилированные белки Flt1(1-3)-Fc анализируют, выполняя стандартный IEF-анализ. Как показано на фиг. 6А-6В, немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc не способен проникать в гель из-за чрезвычайно высокого значения pl (выше 9,3). Однако большинство ступенчато ацетилированных белков Flt1(1-3)-Fc (образцы, ацетилированные 30-100-кратным молярным избытком) способны проникать в гель и уравновешиваются при значениях pl 4,55-8,43 в зависимости от степени ацетилирования. Полученный результат показывает, что ацетилирование может изменять положительный заряд белка в зависимости от дозы и что значение pl можно уменьшить, регулируя степень ацетилирования.

(b) Связывание ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc с компонентами внеклеточного матрикса

Белок Flt1(1-3)-Fc и ступенчато ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc испытывают на связывание с компонентами внеклеточного матрикса, выполняя вышеописанный анализ, позволяющий имитировать взаимодействие с компонентами внеклеточного матрикса. В лунки планшета добавляют разные концентрации немодифицированного белка Flt1(1-3)-Fc, ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc (образцы, ацетилированные 10-, 20- и 30-кратным молярным избытом) или белок rTie2-Fc (посторонний контрольный белок). Планшеты инкубируют в течение 1-2 часов при комнатной температуре или 37°С и детектируют связанные белки, добавляя в лунки вторичное, конъюгированное со щелочной фосфатазой антитело против Fc человека. Затем в лунки добавляют субстрат на основе щелочной фосфатазы и измеряют оптическую плотность. На фиг. 7 показаны результаты данного анализа. Подобно постороннему контрольному белку rTie2-Fc ступенчато ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc (образцы, ацетилированные 20-и 30-кратным молярным избытком) незначительно связывается с планшетом, покрытым Matrigel, в то время как неацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc характеризуется значительным связыванием. Связывание является насыщаемым, показывая, что белок Flt1(1-3)-Fc скорее всего связывается со специфичными сайтами, а не вступает в более общее обусловленное зарядом взаимодействие, которое не может быть насыщаемым. Образец, ацетилированный 10-кратным молярным избытком, характеризуется меньшим связыванием, но данная степень ацетилирования является недостаточной для полного блокирования связывания с компонентами внеклеточного матрикса. У образцов, ацетилированных 20-кратным и большим молярным избытком, детектируемое связывание отсутствует несмотря на то, что при выполнении IEF-анализа (фиг. 6А и 6В) у образцов, ацетилированных более низким молярным избытком, обнаружен большой суммарный положительный заряд. Полученный результат показывает, что необязательно полностью ацетилировать все имеющиеся основные аминокислоты, чтобы устранить связывание с компонентами внеклеточного матрикса.

(с) Связывание ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc при выполнении анализа на основе Biacore

Немодифицированные и ступенчато ацетилированные белки Flt1(1-3)-Fc испытывают, выполняя анализ на основе Biacore, с целью оценки их способности связываться с лигандом Flt1, VEGF. При выполнении данного анализа немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc (0,5, 1,0 или 5,0 мкг/мл) иммобилизуют на поверхности чипа Biacore (см. инструкции по использованию чипа Biacore, фирма Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, для выполнения стандартных анализов) и раствор, содержащий 0,2 мкг/мл VEGF и немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc (в концентрации 0,5, 1,0 или 5,0 мкг/мл) или 10 разных образцов ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc (в концентрации 0,5, 1,0 или 5,0 мкг/мл каждый), наносят на чип, покрытый Flt1(1-3)-Fc. Как показано на фиг. 8, при субстехиометрическом соотношении (0,5 мкг/мл немодифицированного или ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc на 0/2 мкг/мл VEGF) белка Flt1(1-3)-Fc (как немодифицированного, так и ступенчато ацетилированного) недостаточно в растворе для полного связывания VEGF. При концентрации 1,0 мкг/мл, которая приближается к стехиометрическому соотношению 1:1, как немодифицированные, так и ступенчато ацетилированные белки Flt1(1-3)-Fc лучше конкурируют за преимущественное право связывать VEGF, но белка Flt1(1-3)-Fc (как немодифицированного, так и ступенчато ацетилированного) по-прежнему недостаточно для полного связывания имеющегося VEGF. Однако при концентрации 5,0 мкг/мл, которая в несколько раз превышает стехиометрическое соотношение 1:1, как белок Flt1(1-3)-Fc, так и ступенчато ацетилированные белки Flt1(1-3)-Fc способны связывать VEGF независимо от степени ацетилирования. Это ясно показывает, что ацетилирование не изменяет способность белка Flt1(1-3)-Fc связывать VEGF.

(d) Фармакокинетический анализ ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc

Эксперименты in vivo выполняют для оценки фармакокинетических профилей немодифицированного и ступенчато ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc. Мышам Balb/c (23-28 г) подкожно инъецируют 4 мг/кг немодифицированного белка Flt1(1-3)-Fc или ступенчато ацетилированных белков Flt1(1-3) - Fc (образцы, ацетилированные 10-, 20-, 40-, 60- и 100-кратным молярным избытком) (3 мышам вводят немодифицированный белок, а также образцы, ацетилированные 10-, 20- и 40-кратным молярным избытком, и 2 мышам вводят образцы, ацетилированные 60- и 100-кратным молярным избытком). У мышей из хвоста берут кровь через 1, 2, 4, 6, 24 часа, 2 дня и 3 дня после инъекции. Сыворотку анализируют при помощи анализа на основе ELISA, предназначенного для обнаружения Flt1(1-3)-Fc (описанного выше). На фиг. 9 показаны результаты данного исследования. Т_max для всех испытанных белков Flt1(1-3)-Fc соответствует 6 часам, и С_max имеет следующие значения: немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc - 0,06 мкг/мл; образец, ацетилированный 10-кратным молярным избытком, - 0,7 мкг/мл, образец, ацетилированный 20-кратным молярным избытком, - 2 мкг/мл, образец, ацетилированный 40-кратным молярным избытком, - 4 мкг/мл, образец, ацетилированный 60-кратным молярным избытком, - 2 мкг/мл, образец, ацетилированный 100-кратным молярным избытком, - 1 мкг/мл. Полученные результаты показывают, что ацетилирование или обработка полиэтиленгликолем белка Flt1(1-3)-Fc значительно улучшает его фармакокинетический профиль.

Пример 11. Создание мутанта с делецией основной области Flt1(1-3)-Fc, обозначенного Mut1:

С учетом того, что ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc, у которого показатель pl ниже 6, характеризуется гораздо лучшей фармакокинетикой, чем немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc с высоким положительным зарядом (pl>9,3), возникает вопрос, можно ли отнести различия в фармакокинетике за счет суммарного заряда белка, который вызывает его сцепление с отрицательно заряженным компонентом внеклеточного матрикса, или имеются на поверхности белка Flt1(1-3)-Fc конкретные участки, которые образуют специфичные сайты связывания для компонентов внеклеточного матрикса. Например, известно, что многие белки имеют сайты связывания гепарина, которые часто образуют кластер основных остатков. Иногда указанные остатки встречаются в виде кластера в первичной последовательности белка; в некоторых научных источниках описаны "согласованные последовательности" для таких сайтов связывания гепарина (см., например, Hileman, et al., 1998, Bioassays 20 (2):156-67). В других случаях известная кристаллическая структура белка позволяет выявить кластер положительно заряженных остатков на поверхности белка, но указанные остатки поступают из разных областей первичной последовательности и объединяются только при трехмерной укладке цепи в белке. Таким образом, трудно установить, образует ли выделенный аминокислотный остаток часть кластера основных остатков на поверхности белка. Однако, если в первичной последовательности имеется кластер положительно заряженных аминокислотных остатков, можно небеспричинно предположить, что указанные остатки расположены близко друг от друга в пространственном отношении и поэтому могут быть частью сайта связывания компонентов внеклеточного матрикса. Проведены всесторонние исследования рецептора Flt1 и описаны разные домены (см., например, Tanaka et al., 1997, Jpn. J. Cancer Res. 88:867-876). Рассматривая нуклеотидную и аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 10A-10D, можно идентифицировать сигнальную последовательность, регулирующую секрецию, которая расположена в начале последовательности и доходит до глицина, кодируемого нуклеотидами 76-78. Зрелый белок начинается с Ser-Lys-Leu-Lys, начиная с нуклеотида 79 нуклеотидной последовательности. Домен 1 Ig рецептора Flt1 охватывает нуклеотиды 79-393 и заканчивается аминокислотами Ser-Asp-Thr. Домен 2 Ig рецептора Flt1 охватывает нуклеотиды 394-687 (кодирующие аминокислоты от Gly-Arg-Pro до Asn-Thr-Ile), и домен 3 Ig рецептора Flt1 охватывает нуклеотиды 688-996 (кодирующие аминокислоты от Ile-Asp-Val до Asp-Lys-Ala). Указанный белок имеет связывающую аминокислотную последовательность, Gly-Pro-Gly, кодированную нуклеотидами 997-1005, за которой следует нуклеотидная последовательность, кодирующая Fc человека (нуклеотиды 1006-1701 или аминокислоты от Glu-Pro-Lys до Pro-Gly-Lys-терминирующего кодона).

Более детальный анализ аминокислотной последовательности Flt1 показывает, что существует кластер, а именно аминокислотные остатки 272-281 (KNKRASVRR), показанные на фиг. 10A-10D, в которых 6 из 10 аминокислотных остатков являются основными. Данная последовательность расположена в домене 3 Ig рецептора Flt1 (см. фиг. 11) и сама по себе не имеет существенного значения для связывания лиганда VEGF, но определяет повышенное сродство связывания с лигандом. Сравнительный анализ последовательности домена 3 Ig с последовательностью домена 2 Ig показывает, что в данной области два домена Ig имеют низкий уровень сопоставления друг с другом и в домене 3 Ig имеется примерно 10 дополнительных аминокислот. Анализ профилей гидрофильности (программное обеспечение MacVector) двух указанных доменов отчетливо указывает на наличие гидрофильной области в белке (фиг. 12А-12В). На основании полученных данных можно предположить, что действительная трехмерная конформация домена 3 Ig рецептора Flt1 делает возможной некоторое расширение, что невозможно в домене 2 Ig рецептора Flt1. Для проверки данной гипотезы удаляют 10 дополнительных аминокислот и исследуют полученный белок, чтобы определить, оказывает ли указанная делеция благоприятное влияние на фармакокинетику без серьезного ухудшения сродства рецептора к VEGF. Конструкция ДНК, созданная стандартными методами молекулярной биологии (см., например. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY)) в экспрессирующем векторе рМТ21 млекопитающего (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA), именуется Mut1: . Конструкцию Mut1: получают из Flt1(1-3)-Fc путем делеции нуклеотидов 814-843 (показанных на фиг. 10А-10D), позволяющей удалить высокоосновную последовательность, состоящую из 10 аминокислотных остатков Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg, из домена 3 Ig рецептора Flt1.

Последовательность конечной конструкции ДНК секвенирована при помощи секвенатора ДНК ABI 373A и набора для циклического секвенирования терминатора дидезокси методом (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Последовательность Mut1: показана на фиг. 13A-13D.

Пример 12. Создание мутанта с делецией основной области Flt1(1-3)-Fc, обозначаемого Mut2:

Вторая делеционная мутантная конструкция, обозначаемая Mut2: , получена из конструкции Mut1: путем делеции домена 1 Ig рецептора Flt1, кодируемого нуклеотидами 79-393 (см. фиг. 10A-10D); для удобства нуклеотиды 73-78 (ТСА GGT) заменены ТСС GGA. Благодаря этому введен сайт рестрикции (BspE1) без изменения связанной с ним аминокислотной последовательности Ser-Gly. В данной конструкции ДНК, созданной стандартными методами молекулярной биологии (см., например. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY)) в экспрессирующем векторе рМТ21 млекопитающего (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA), последовательность также была секвенирована с помощью секвенатора ДНК ABI 373A и набора для циклического секвенирования терминатора дидезокси методом (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Последовательность Mut2: показана на фиг. 14А-14С.

Пример 13. Создание делеционного мутанта Flt1(1-3)-Fc, обозначенного Mut3: Flt1(2-3)-Fc

Третья делеционная мутантная конструкция, обозначаемая Mut3: Flt1(2-3)-Fc, создана аналогично мутантной конструкции Mut2: , за исключением того, что домен 3 Ig рецептора Flt1 оставлен без изменения (аминокислоты основной области не удалены). Данная конструкция создана стандартными методами молекулярной биологии и ее последовательность секвенирована так, как это описано выше. Последовательность Mut3: Flt1(2-3)-Fc показана на фиг. 15А-15С.

Пример 14. Создание N-гликозилированного мутанта основной области Flt1(1-3)-Fc, обозначенного Mut4:

Была создана конечная конструкция, в которой сайт N-гликозилирования введен в середину основной области домена 3 Ig рецептора Flt1. Данная конструкция, обозначенная как Mut4: , создана путем замены нуклеотидов 824-825 с GA на АС при одновременной замене кодируемого остатка Arg (AGA) остатком Asn (ААС) (см. фиг. 10A-10D). Поэтому полученная аминокислотная последовательность изменена с Arg-Ala-Ser на Asn-Ala-Ser, что соответствует обязательному сигналу (Asn-Xxx-Ser/Thr) для добавления сайта N-гликозилирования у остатка Asn. Последовательность Mut4: показана на фиг.16A-16D.

Пример 15. Исследование ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc и мутантов Mut1: и Mut4:

(а) Связывание с компонентами внеклеточного матрикса

Чтобы определить, обладают ли три модифицированных белка улучшенными фармакокинетическими свойствами, 96-луночные планшеты, покрытые Matrigel (описанные выше), инкубируют с разными концентрациями мутантных белков и обнаруживают конъюгированные со щелочной фосфатазой антитела против Fc человека. Как показано на фиг. 18, выполненный эксперимент показывает, что если немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc интенсивно связывается с указанными лунками, то белок Mut3: Flt1(2-3)-Fc связывается несколько слабее, белок Mut1: связывается еще слабее и белок Mut2: характеризуется лучшим профилем, связываясь слабее, чем любые другие мутантные белки. Гликозилированный мутантный белок Mut4: обладает минимальным преимуществом, о чем свидетельствуют результаты анализа на Matrigel. Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что линейную последовательность положительно заряженных аминокислот можно удалить из первичной последовательности, в результате чего уменьшается взаимодействие зарядов с компонентами внеклеточного матрикса.

(b) Связывание Mut1: и Mut4: при выполнении анализа на основе Biacore

Немодифицированные и ацетилированные белки Flt1(1-3)-Fc, а также генетически модифицированные белки Mut1: и Mut4: испытывают, выполняя анализ на основе Biacore, с целью оценки их способности связываться с лигандом Flt1, VEGF. При выполнении данного анализа немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc (0,25, 0,5 или 1,0 мкг/мл) иммобилизуют на поверхности чипа Biacore (см. инструкции по использованию чипа Biacore, фирма Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, для выполнения стандартных анализов) и раствор, содержащий 0,1 мкг/мл VEGF и очищенный немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc или супернатант клеток COS, содержащий немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc (в концентрации около 0,25, 0,5 или 1,0 мкг/мл), очищенный ацетилированный белок Flt1(1-3)-Fc (в концентрации 0,25, 0,5 или 1,0 мкг/мл), супернатант клеток COS, содержащий Mut1: (в концентрации примерно 0,25, 0,5 или 1,0 мкг/мл), или супернатант клеток COS, содержащий Mut4: (в концентрации 0,25, 0,5 или 1,0 мкг/мл), пропускают через чип, покрытый Flt1(1-3)-Fc. Как показано на фиг. 17, при субстехиометрическом соотношении (0,25 мкг/мл Flt1(1-3)-Fc немодифицированных, ацетилированных или генетически модифицированных образцов на 0,1 мкг/мл VEGF) белка Flt1(1-3)-Fc недостаточно, чтобы блокировать связывание VEGF с Flt1(1-3)-Fc, иммобилизованным на чипе Biacore. При концентрации 0,5 мкг/мл немодифицированных, ацетилированных или генетически модифицированных белков Flt1(1-3)-Fc стехиометрическое соотношение приближается к 1:1, при этом увеличивается способность белков блокировать связывание VEGF с чипом Biacore. При концентрации 1,0 мкг/мл немодифицированных, ацетилированных или генетически модифицированных белков Flt1(1-3)-Fc стехиометическое соотношение приближается к 10:1, в результате чего белки Flt1(1-3)-Fc обеспечивают связывание VEGF с чипом Biacore, но их способность не является эквивалентной. Немодифицированные, ацетилированные белки и Mut1: по существу в равной степени блокируют связывание VEGF, в то время как Mut4: блокирует связывание менее эффективно. Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что можно уменьшить неспецифичное связывание положительно заряженной молекулы, удаляя генетическим путем линейную последовательность преимущественно отрицательно заряженных аминокислот.

(с) Связывание Muti: , Mut2: и Mut3: Flt1(2-3)-Fc при выполнении анализа на основе ELISA

Способность трех мутантных белков связывать лиганд VEGF рецептора Flt1 определяют, выполняя эксперименты по связыванию, в которых 96-луночные планшеты, покрытые VEGF, инкубируют с разными концентрациями соответствующего мутантного белка, после промывки определяют связанное количество лиганда, инкубируя культуры с конъюгированным со щелочной фосфатазой антителом против Fc человека, и производят количественное определение колориметрическим методом, добавляя соответствующий субстрат на основе щелочной фосфатазы. Как показано на фиг. 19, результаты данного эксперимента свидетельствуют о том, что все мутантные белки способны одинаково связывать VEGF при испытанных концентрациях.

Пример 16. Фармакокинетический анализ ацетилированного белка Flt1(1-3)-Fc, Mut1: и немодифицированного белка Flt1(1-3)-Fc

Эксперименты in vivo выполняют для оценки фармакокинетических профилей немодифицированного белка Flt1(1-3)-Fc, Mut1: и ацетилированного 40-кратным молярным избытком белка Flt1(1-3)-Fc. Мышам Balb/с (25-30 г) подкожно инъецируют 4 мг/кг немодифицированного белка Flt1(1-3)-Fc, ацетилированного 40-кратным молярным избытком белка Flt1(1-3)-Fc и белка Mut1; (по 4 мыши в каждой группе). У мышей из хвоста берут кровь через 1, 2, 4, 6, 24 часа, 2 дня, 3 дня и 5 дней после инъекции. Сыворотку анализируют при помощи анализа ELISA, предназначенного для обнаружения белка Flt1(1-3)-Fc, который заключается в том, что планшеты для ELISA покрывают VEGF, осуществляют связывание Flt1(1-3)-Fc и считывают данные, используя антитело против Fc, связанное со щелочной фосфатазой. Как показано на фиг. 20, C_max для указанных реагентов имеет следующие значения: немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc - 0,15 мкг/мл; ацетилированный 40-кратным молярным избытком белок Flt1(1-3)-Fc - 1,5 мкг/мл и Mut1: - 0,7 мкг/мл.

Пример 17. Создание вектора модифицированного рецептора Flt1

Логическим обоснованием для создания модифицированных вариантов рецептора Flt1 (известного также как VEGFR1) является то, что белковая последовательность Flt1 является высокоосновной и, вероятно, поэтому связывается с внеклеточным матриксом (ЕСМ). Основный характер Flt1, по-видимому, объясняет тот факт, почему немодифицированный белок Flt1(1-3)-Fc (описанный выше) имеет плохую фармакокинетику, что затрудняет его использование в качестве лекарственного средства. Как указывалось выше, химически модифицированная форма ацетилированного 40-кратным молярным избытком белка Flt1(1-3)-Fc, далее именуемая А40, имеет гораздо лучший фармакокинетический (РК) профиль по сравнению с неацетилированным белком Flt1(1-3)-Fc. Поэтому были предприняты попытки сконструировать молекулы ДНК, которые можно использовать для рекомбинантной экспрессии модифицированных форм молекулы рецептора Flt1, обладающих улучшенным фармакокинетическим профилем, характерным для А40, но сохраняющих способность прочно связываться с VEGF.

Из научной литературы известно, что первый домен Ig рецептора Flt1 (который имеет суммарный заряд +5 при нейтральном рН) не имеет важного значения для прочного связывания с VEGF, поэтому данный домен удаляют. Третий домен Ig (имеющий суммарный заряд +11) не имеет важного значения для связывания, но определяет более высокое сродство к VEGF, чем второй домен Ig, поэтому его полностью не удаляют, а заменяют эквивалентными доменами Flk1 (известного также как VEGFR2) и Flt4 (известного также как VEGFR3), родственными рецептору Flt1. Полученные химерные молекулы, обозначаемые соответственно R1R2 (Flt1.D2.Flk1D3.FcC1 (а) и VEGFR1R2-FcC1 (а)) и R1R3 (Flt1D2.VEGFR3D3-FcC1 (а) и VEGFR1R3-FcC1 (а)), где R1 и Flt1D2 означают домен 2 Ig рецептора Flt1 (VEGFR1); R2 и Flk1D3 означают домен 3 Ig рецептора Flk1 (VEGFR2) и R3 и VEGFR3D3 означает домен 3 Ig рецептора Flt4 (VEGFR3), в гораздо меньшей степени связываются с ЕСМ, о чем свидетельствуют результаты описанного ниже анализа связывания с ЕСМ in vitro, и обладают гораздо лучшей фармакокинетикой, как это описано ниже. Кроме того, указанные молекулы способны прочно связываться с VEGF и блокировать фосфорилирование нативного рецептора Flk1, экспрессированного в эндотелиальных клетках, как это описано ниже.

(а) Создание экспрессирующей плазмиды pFlt1D2.Flk1D3.FcC1 (a)

Экспрессирующие плазмиды рМТ21.Flt1(1-3).Fc (6519 п.о.) и рМТ21.Flk-1(1-3).Fc (5230 п.о.) представляют собой плазмиды, которые кодируют устойчивость к ампициллину и Fc-меченые варианты доменов 1-3 Ig рецепторов Flt1 и Flk1 человека. Указанные плазмиды используют для создания фрагмента ДНК, состоящего из химеры домена 2 Ig рецептора Flt1 с доменом 3 Ig рецептора Flk1, достигаемого амплификацией соответствующих доменом Ig при помощи полимеразной реакции синтеза цепи (PCR) с последующим выполнением цикла PCR для слияния указанных двух доменов в один фрагмент. Для домена 2 Ig рецептора Flfc1 использованы следующие затравки для амплификации 5'- и 3'-концов:

5': bsp/flt1D2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')

3': Flt1D2-Flk1D3.as (5'-CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT-3')

Затравка для амплификации 5'-конца кодирует сайт рестрикционного фермента BspE1, расположенный выше от домена 2 Ig рецептора Flfc1 и определяемый аминокислотной последовательностью GRPFVEM (соответствующей аминокислотам 27-33 на фиг. 21А-21С). Затравка для 3'-конца кодирует обратный комплемент 3'-конца домена 2 Ig рецептора Flt1, слитый непосредственно с 5'-концом, начинающийся у домена 3 Ig рецептора Flk1, где точка слияния обозначена как TIID рецептора Flt1 (соответствуя аминокислотам 123-126 на фиг. 21А-21С), и доходящий до VVLS (соответствуя аминокислотам 127-130 на фиг. 21А-21С) рецептора Flk1.

Для домена 3 Ig рецептора Flkl использованы следующие затравки для амплификации 5'- и 3'-концов:

5': Flt1D2-Flk1D3.s (5'-ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGG- 3')

3': Flk1D3/apa/srf.as (5'-GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3')

Затравка для амплификации 5'-конца кодирует конец домена 2 Ig рецептора Flt1, слитый непосредственно с началом домена 3 Ig рецептора Flk1, как это описано выше. Затравка для амплификации 3'-конца кодирует конец домена 3 Ig рецептора Flk1, определяемый аминокислотами VRVHEK (соответствующими аминокислотам 223-228 на фиг. 21А-21С), за которыми следует соединяющая последовательность, которая включает распознающую последовательность для рестрикционного фермента Srf1 и кодирует аминокислоты GPG. Соединяющая последовательность соответствует аминокислотам 229-231 на фиг. 21А-21С.

После цикла амплификации PCR с целью получения отдельных доменов продукты объединяют в пробирке и подвергают еще одному циклу PCR с использованием затравок bsp/Flt1D2 и Flk1D3/apa/srf.as (описанных выше) для получения слитого продукта. Затем продукт PCR расщепляют рестрикционными ферментами BspEI и Smal и полученный фрагмент длиной 614 п.о. субклонируют на сайтах рестрикции с BspEI no Srfl вектора рМТ21/В2.Fc, создавая таким образом плазмиду pMT21/FltD2.Flk1D3.Fc. Нуклеотидную последовательность слитой вставки гена Flt1D2-Flk1D3 проверяют, выполняя стандартное секвенирование. Указанную плазмиду затем расщепляют рестрикционными ферментами EcoRI и Srfl и полученный фрагмент длиной 702 п.о. переносят на сайты рестрикции с EcoRI по Srfl плазмиды pFlt1(1-3)B2-FcC1 (a), получая при этом плазмиду pFlt1D2.Flk1D3.FcC1 (a). Полная ДНК и выведенные аминокислотные последовательности химерной молекулы Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) показаны на фиг. 21А-21С.

(b) Создание экспрессирующей плазмиды pFlt1D2VEGFR3D3FcC1 (a)

Экспрессирующая плазмида рМТ21.Flt1(1-3).Fc (6519 п.о.) кодирует устойчивость к ампициллину и Fc-меченый вариант доменов 1-3 Ig рецептора Flt1 человека. Данную плазмиду используют для получения фрагмента ДНК, содержащего домен 2 Ig рецептора Flt1 при помощи PCR. РНК из линии клеток HEL921.7 используют для получения домена 3 Ig рецептора Flk1 при помощи стандартного метода RT-PCR. Еще один цикл амплификации PCR выполняют для слияния двух доменов Ig в один слитый фрагмент. Для домена 2 Ig рецептора Flt1 используют следующие затравки для амплификации 5'- и 3'-концов:

5': bsp/Flt1D2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')

3': Flt1D2.VEGFR3D3.as(TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT)

Затравка для амплификации 5'-конца кодирует сайт рестрикции BspE1, расположенный выше от домена 2 Ig рецептора Flt1, определяемый аминокислотной последовательностью GRPFVEM (соответствующей аминокислотам 27-33 на фиг. 22А-22С). Затравка для амплификации 3'-конца кодирует обратный комплемент конца домена 2 Ig рецептора Flt1, слитый непосредственно с началом домена 3 Ig рецептора VEGFR3, где точка слияния обозначена как TIID рецептора Flt1 (соответствуя аминокислотам 123-126 на фиг. 22А-22С), и доходящий до IQLL рецептора VEGFR3 (соответствуя аминокислотам 127-130 на фиг. 22А-22С).

Для домена 3 Ig рецептора VEGFR3 используют следующие 5'- и 3'-концевые затравки для выполнения RT-PCR:

5': R3D3.s (ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGCTGCTGGTA)

3': R3D3.as (ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG)

Затравки для амплификации 5'- и 3'-концов соответствуют последовательности VEGFR3. Продукт амплификации длиной 296 п.о., полученный в результате выполнения реакции RT-PCR, выделяют стандартными методами и подвергают второму циклу PCR для введения приемлемых последовательностей, необходимых для слияния доменов Flt1D2 и Flk1D3, а также доменов Flk1D3 и Fc при помощи мостика GPG (см. ниже). Используют следующие затравки для амплификации:

5': Flt1D2.VEGFR3D3.s (TCATAGATATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG)

3': VEGFR3D3/srf.as (GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT)

Затравка для амплификации 5'-конца кодирует 3'-конец домена 2 Ig рецептора Flt1, слитого непосредственного с началом (5'-конец) домена 3 Ig рецептора VEGFR3, как это описано выше. Затравка для амплификации 3'-конца кодирует 3'-конец домена 3 Ig рецептора VEGFR3, определяемый аминокислотами VIVHEN (соответствующими аминокислотам 221-226 на фиг. 22А-22С), за которым следует соединяющая последовательность, которая включает распознающую последовательность для Srf1 и кодирует аминокислоты GPG. Соединяющая последовательность соответствует аминокислотам 227-229 на фиг. 22А-22С.

После одного цикла (для домена 2 Ig рецептора Flt1) или двух циклов (для домена 3 Ig рецептора Flt4) PCR, выполняемой для получения отдельных доменов Ig, продукты PCR объединяют в пробирке и подвергают еще одному циклу амплификации PCR с использованием вышеописанных амплифицирующих затравок bsp/Flt1D2 и VEGFR3D3/srf.as для получения слитого продукта. Затем продукт PCR расщепляют при помощи рестрикционных ферментов BspEl и Smal и полученный фрагмент длиной 625 п.о. субклонируют в сайтах рестрикции BspEI-Srfl вектора pMT21/Flt1B2.Fc (описанного выше) для создания плазмиды pMT21/Flt1D2.VEGFR3D3.Fc. Последовательность слитой вставки гена Flt1D2-VEGFR3D3 проверяют, выполняя стандартное секвенирование. Указанную плазмиду затем расщепляют рестрикционными ферментами EcoRI и Srfl и полученный фрагмент длиной 693 п.о. субклонируют в сайтах рестрикции EcoRI-Srfl плазмиды pFlt1(1-3)B2-FcC1 (а) и получают плазмиду, обозначаемую pFlt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (а). Полная ДНК и выведенная аминокислотная последовательность химерной молекулы Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (а) показаны на фиг. 22А-22С.

Пример 18. Анализ связывания внеклеточного матрикса (ЕСМ)

Покрытые ЕСМ планшеты (№35-4607 по каталогу Becton Dickinson) повторно гидратируют теплым DME, с добавлением глутамина (2 мМ), 100 ед. пенициллина, 100 ед. стрептомицина и 10% BCS, в течение по крайней мере 1 часа перед введением образцов. Затем планшеты инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре с разными концентрациями Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (a) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (а), начиная с концентрации 10 нМ с последующим 2-кратным разведением в PBS и добавлением 10% BCS. Затем планшеты трижды промывают PBS с 0,1% Triton-X и инкубируют с конъюгированным со щелочной фосфатазой антителом против Fc человека (Promega, 1:4000 в PBS с 10% BCS) в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты 4 раза промывают PBS с 0,1% Triton-X, добавляют буфер на основе щелочной фосфатазы и раствор pNPP (Sigma) для окрашивания культуры. Результаты считывают при I=405-570 нм. Результаты эксперимента показаны на фиг. 23 и свидетельствуют о том, что белки Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1(а) в гораздо меньшей степени связываются с ЕСМ по сравнению с белком Flt1(1-3)-Fc.

Пример 19. Временная экспрессия pFlt1D2.FlklD3.FcC1 (а) в клетках K1-CHO (E1A)

Большое количество (2 л) культуры клеток DH10B Е.coli, содержащих плазмиду pFlt1D2.Flk1D3.FcC1 (a), описанную выше в примере 17(а), выращивают в течение ночи в бульоне ТВ, содержащем 100 мкг/мл ампициллина. На следующий день плазмидную ДНК экстрагируют, используя набор QIAgen Endofree Megaprep в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию очищенной плазмидной ДНК определяют стандартными методами, используя ультрафиолетовый спектрофотометр и флуорометр. Плазмидную ДНК проверяют стандартным методом расщепления рестрикционным ферментом аликвот образцов с использованием рестрикционных ферментов EcoRI с Notl и Asel. Все фрагменты, расщепленные рестрикционными ферментами, соответствуют прогнозируемым размерам по результатам анализа на 1% агарозном геле.

Сорок 15 см чашек Петри засевают клетками СНО-К1/Е1А с плотностью 4×106 клеток/чашку. В качестве среды для чашек Петри используют среду F-12 фирмы Gibco Ham с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 100 ед. пенициллина/100 ед. стрептомицина и глутамина (2 мМ). На следующий день все чашки с клетками трансфецируют 6 мкг плазмидной ДНК pFlt1D2.Flk1D3.FcС1 (а), используя препараты Optimem и Lipofectamine фирмы Gibco в объеме 12 мл в оответствии с инструкциями производителя. Через четыре часа после добавления к клеткам трансфецирующей смеси добавляют 12 мл/чашку препарата Optimem, содержащего 10% FBS. Чашки инкубируют при 37°С в инкубаторе с 5% CO₂ в течение ночи. На следующий день среды удаляют изо всех чашек и добавляют 25 мл эксдрессирующей среды (CHO-S-SFM II фирмы Gibco, с добавлением глутамина (2 мМ) и 1 мМ бутирата натрия). Чашки инкубируют при 37°С в течение 3 дней. После инкубации в течение 3 дней среды отсасывают из всех чашек и центрифугируют со скоростью 400 оборотов/минуту в роторе с качающейся корзиной для осаждения клеток. Супернатант декантируют в стерильные флаконы емкостью 1 л и экспрессированный белок очищают, как это описано ниже.

Пример 20. Создание экспрессирующего вектора pVEGFR1R2-FcС1 (а)

Экспрессирующую плазмиду pVEGFR1R2.FcC1 (а) создают путем введения ДНК, кодирующей аминокислоты SDT (соответствующие аминокислотам 27-29 на фиг. 24А-24С), между аминокислотами 26 и 27 Flt1D2-Flk1D3-FcC1 (а) на фиг. 21А-21С (GG), и удаления ДНК, кодирующей аминокислоты GPG, соответствующие аминокислотам 229-231 на данном чертеже. Аминокислотная последовательность SDT родственна рецептору Flt1 и ее вводят для уменьшения вероятности гетерогенного процессинга N-конца. GPG (соединяющую последовательность) удаляют для достижения прямого слияния доменов Flt1 и Flk1 Ig друг с другом. Полная ДНК и выведенные аминокислотные последовательности химерной молекулы pVEGFR1R2.FcC1 (а) показаны на фиг. 24А-24С.

Пример 21. Способ культивирования клеток, используемый для продуцирования модифицированных рецепторов Flt1

(а) Способ культивирования клеток, используемый для продуцирования Flt1D3.Flk1D3.FcC1(a)

Способ продуцирования белка Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) с использованием экспрессирующей плазмиды pFlt1D2.Flk1D3.FcС1 (а), описанный выше в примере 1, включает применение суспензионной культуры рекомбинантных клеток яичника китайского хомячка (К1/Е1А СНО), которые структурно экспрессируют белковый продукт. Указанные клетки выращивают в биореаторах, белковый продукт выделяют и очищают аффинной и вытеснительной хроматографией. Данный способ более подробно описан ниже.

Размножение клеток

Линию клеток, экспрессирующую Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а), находящуюся в двух обеспечивающих слияние клеток колбах Т-225 см², размножают, пассируя клетки в восемь колб Т-225 см² со средой (GMEM+10% сыворотки, фирма GIBCO) и инкубируют при 37°С и 5% CO₂. Когда в колбах происходит слияние клеток (примерно через 3-4 дня), клетки отделяют при помощи трипсина. Добавляют свежую среду для защиты клеток от дальнейшего воздействия трипсина. Клетки центрифугируют, повторно суспендируют в свежей среде, переносят в восемь вращающихся флаконов емкостью 850 см² и инкубируют при 37°С и 5% CO ₂ до слияния.

Суспензионная культура в биореакторах

Клетки, выращенные во вращающихся флаконах, отделяют от поверхности, производя обработку трипсином, и промывают средой для суспензионной культуры. Клетки переносят в асептических условиях в биореактор емкостью 5 л (New Brunswick Celligen Plus), где клетки выращают в 3,5 л суспензионной культуры. Среда для суспензионной культуры представляет собой модифицированную среду IS-CHO без глутамина с низким содержанием глюкозы (Irvine Scientific), в которую добавляют 5% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone), добавку GS (Life Technologies) и 25 мкМ метионинсульфоксимина (Sigma). Показатель рН доводят до 7,2, добавляя в биореатор углекислый газ к подаваемому газу или жидкий раствор карбоната натрия. Растворенный кислород поддерживают на уровне 30% насыщения, добавляя кислород или азот к подаваемому газу, при температуре 37°С. После достижения плотности, равной 4×10⁶ клеткам/мл, клетки переносят в биореактор емкостью 40 л, содержащий такую же среду и имеющий аналогичные параметры. Температуру понижают до 34°С, чтобы замедлить рост клеток и увеличить относительную скорость экспрессии белка.

(b) Способ культивирования клеток, используемый для продуцирования Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (a)

Для продуцирования Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (а) используют те же способы, которые описаны выше для получения Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (a).

Пример 22. Сбор и очистка модифицированных рецепторов Flt1

(а) Сбор и очистка Flt1D2.Flk1D3.FcС1 (а)

Белковый продукт собирают в асептических условиях из биореатора, сохраняя клетки при помощи модулей для фильтрации тангенциального потока Millipore Prostak и механического насоса со слабым сдвигающим усилием (Fristam). В биореактор добавляют свежую среду для замены среды, удаленной во время фильтрации собранных клеток. Примерно 40 л фильтрата собранных клеток вводят в 400 мл колонку, заполненную смолой Protein A Sepharose (Amersham Pharmacia). Введенную смолу промывают буфером, содержащим 10 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, рН 7/2, чтобы удалить любые несвязанные загрязняющие белки. Белок Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) элюируют цитратным буфером с рН 3,0. Элюированный белок нейтрализуют, добавляя Tris-основание и замораживают при -20°С.

Несколько замороженных партий Flt1D2.Flk1D3.FcС1 (а) белка А, полученных при выполнении вышеописанной стадии, оттаивают, объединяют и концентрируют, используя мембрану для фильтрации тангенциального потока, отделяющую вещества с номинальной молекулярной массой 30 кДа (NMWCO). Белок переносят в концентратор с перемешиванием клеток (Millipore) и концентрируют до 30 мг/мл, используя мембрану NMWCO для 30 кДа. Концентрированный белок вводят в вытеснительную колонку, заполненную смолой Superdex 200 (Amersham Pharmacia), которая уравновешена физиологическим раствором с фосфатным буфером и 5% глицерина. Такой же буфер используют для промывки колонки. Фракции, соответствующие димеру Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а), объединяют, фильтруют в стерильных условиях через фильтр 0,22 микрона, отбирают алквоту белка и замораживают.

(b) Сбор и очистка Flt1D2.VEGFR3D3.FcС1 (а)

Для сбора и очистки Flt1D2.VEGFR3D3.FcС1 (а) используют те же способы, которые описаны выше для получения Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (a).

Пример 23. Анализ фосфорилирования временно экспрессированного VEGFR2 Первичные эндотелиальные клетки пупковой вены человека (HUVEC), пассирование 4-6, выдерживают в течение 2 часов в бессывороточной среде DME с высоким содержанием глюкозы. Образцы, содержащие 40 нг/мл (1 нМ) VEGF165 человека, который является лигандом для рецепторов Flt1, Flk1 и Flt4 (VEGFR3) VEGF, предварительно инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре с разными количествами модифицированных рецепторов Flt1, таких как Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) и Flt1D2VEGFR3D3.FcС1 (а), в бессывороточной среде DME с высоким содержанием глюкозы, включающей 0,1% BSA. Клетки стимулируют в течение 5 минут полученными выше образцами +/-VEGF165 и лизируют цельные клетки, используя буфер для полного лизиса. Клеточные лизаты иммуноосаждают антителом против С-конца рецептора VEGFR2. Иммуноосажденные лизаты помещают на 4-12% гель Novex для SDS-PAGE и затем переносят на поливинилиденфторидную мембрану при помощи стандартных методов переноса. Фосфорилированный VEGFR2 обнаруживают иммуноблоттингом с использованием антифосфотирозинового mAb, обозначаемого 4G10 (UBI), и окрашивают при помощи ECL-реагента (Amersham).

На фиг. 25А-25С и 26А-26В приведены результаты данного эксперимента. На фиг. 25А-25С показано, что обнаружение вестерн-блоттингом фосфорилированного тирозином VEGFR2(Flk1) в результате стимуляции лигандом VEGF165 свидетельствует о том, что рецепторы на поверхности клетки фосфорилированы в разной степени в зависимости от того, какой модифицированный рецептор Flt1 использован во время предварительной инкубации с VEGF. Как показано на фиг. 25А, при 1,5-молярном избытке Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (А40) или временно экспрессированного Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) полностью блокируется стимуляция рецептора указанными тремя модифицированными рецепторами Flt1 по сравнению со стимуляцией контрольной средой. В отличие от этого временно экспрессированный белок Flt1D2VEGFR3D3.FcС1 (а) не вызывает значительного блокирования при указанном молярном избытке по сравнению со стимуляцией положительным контрольным белком VEGF. Аналогичные результаты приведены на фиг. 25В, где модифицированные рецепторы Flt использованы в трехкратном молярном избытке относительно лиганда VEGF165. На фиг. 25С показано, что в том случае, когда модифицированные рецепторы Flt1 использованы в шестикратном молярном избытке относительно лиганда VEGF165, временно экспрессированный белок Flt1D2VEGFR3D3.FcC1 (а) частично блокирует вызванную VEGF165 стимуляцию рецепторов на поверхности клеток.

На фиг. 26А-26В показано, что обнаружение вестерн-блоттингом фосфорилированного тирозином VEGFR2 (Flk1) в результате стимуляции лигандом VEGF165 свидетельствует о том, что рецепторы на поверхности клеток не фосфорилированы стимулирующими образцами, содержащими VEGF165, предварительно инкубированный с 1- и 2-кратным молярным избытком (фиг. 26А) или 3- и 4-кратным молярным избытком (фиг. 26В) временно экспрессированного белка Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а), постоянно экспрессированного белка Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или временно экспрессированного белка VEGFR1R2FcC1 (a). При всех испытанных концентрациях модифицированного рецептора Flt1 происходит полное связывание лиганда VEGF165 во время предварительной инкубации, в результате чего не обнаружена стимуляция рецепторов на поверхности клеток несвязанным VEGF165 по сравнению со стимуляцией контрольной средой.

Пример 24. Биоанализ пролиферации клеток

Популяция испытуемых клеток представляет собой клетки MG87, которые устойчиво трансфецированы экспрессирующей плазмидой, содержащей ДНК-вставку, кодирующую внеклеточный домен VEGFR2 (Flk1), слитый с внутриклеточным доменом киназы TrkB, образуя таким образом химерную молекулу. Причина использования внутриклеточного домена киназы TrkB вместо нативного внутриклеточного домена киназы VEGFR2 (Flk1) заключается в том, что внутриклеточный домен киназы VEGFR2 (Flk1) не вызывает сильной пролиферативной реакции при стимуляции VEGF165 в указанных клетках. Известно, что в клетках MG87, содержащих полноразмерный рецептор TrkB, возникает сильная пролиферативная реакция при стимуляции BDNF, поэтому внутриклеточный домен киназы VEGFR2 (Flk1) заменяют внутриклеточным доменом киназы TrkB, чтобы воспользоваться возможностями, предоставляемыми данной пролиферативной реакцией.

5×10³ клеток/лунку культивируют в 96-луночном планшете в течение 2 часов при 37°С. Следующие модифицированные рецепторы Flt, такие как Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcС1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (a), а также посторонний рецептор, именуемый Tie2-Fc и используемый в качестве отрицательного контрольного образца, титруют в пределах от 40 нМ до 20 пМ и инкубируют на клетках в течение 1 часа при 37°С. Затем во все лунки добавляют рекомбинантный VEGF165 человека в среде определенного состава с концентрацией 1,56 нМ. Планшеты инкубируют в течение 72 часов при 37°С, добавляют MTS (реагент Овена, Promega) и планшеты инкубируют еще 4 часа. Затем планшеты считывают спектрофотометром при 450/570 нм. Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 27. Контрольный рецептор Tie2-Fc, используемый в любой концентрации, не блокирует вызванную VEGF165 пролиферацию клеток, в то время как Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) блокирует 1,56 нМ VEGF165 при половине максимальной дозы, равной 0,8 нМ. Flt1(1-3)-Fc и Flt1D2.VEGFR3D3.FcС1 (а) менее эффективно блокируют VEGF165 в данном анализе при половине максимальной дозы, равной ˜2 нМ. Используемый отдельно VEGF165 дает результат, равный 1,2 единицы поглощения, при этом фоновое излучение равно 0,38 единицы поглощения.

Пример 25. Стехиометрия связывания модифицированных рецепторов Flt с VEGF165

(а) Анализ на основе BIAcore

Стехиометрию взаимодействия Flt1D2FlkD3.FcC1 (а) и VEGFR1R2-FcC1 (а) с VEGF165 человека определяют, измеряя уровень насыщения связывания VEGF с поверхностями Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (а) или измеряя концентрацию VEGF165, необходимую для полного предотвращения связывания Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (а) с поверхностью чипа BIAcore, покрытого VEGF.

Модифицированные рецепторы Flt, такие как Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) и VEGFR1R2-FcC1 (а), захватываются со специфическим антителом против Fc, которое сначала иммобилизуют на чипе Biacore (BIACORE) методом связывания с амином. В качестве отрицательного контрольного образца используют поверхность контрольного антитела. VEGF165 инъецируют с концентрацией 1 нм, 10 нМ и 50 нм на поверхности Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) и VEGFR1R2-FcC1 (а) со скоростью 10 мкл/мин в течение одного часа. Регистрируют сигнал связывания в реальном времени и в конце каждой инъекции достигают насыщения связывания. Стехиометрию связывания вычисляют в виде молярного отношения связанного VEGF165 к иммобилизованному Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (а), используя коэффициент пересчета, равный 1000 крысиным единицам, который эквивалентен 1 нг/мл. Результаты показывают, что стехиометрия связывания равна одной димерной молекуле VEGF165 на одну молекулу Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (а) (фиг. 28).

Белок Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (a), находящийся в растворе с концентрацией 1 нМ (которая в 1000 раз выше, чем KD взаимодействия Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (а) с VEGF165), смешивают с разными концентрациями VEGF165. Смесь инкубируют в течение одного часа и измеряют концентрации свободного Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) в растворе в виде сигнала связывания с поверхностью связанного амином VEGF165. Калибровочную кривую используют для превращения сигнала связывания Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) с BIAcore в его молярную концентрацию. Приведенные данные показывают, что добавление 1 нМ VEGF165 в раствор Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) полностью блокирует связывание Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) с поверхностью VEGF165. Полученный результат позволяет предположить, что стехиометрия связывания равна одной молекуле VEGF165 на одну молекулу Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) (фиг. 29 и 30). При построении кривой зависимости концентрации Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) от увеличения концентрации VEGF165 наклон линейной части равен -1,06 для Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) и -1/07 для VEGFR1R2-FcC1 (а). Величина наклона вблизи от -1 свидетельствует о том, что одна молекула VEGF165 связывается с одной молекулой Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (a).

(b) Вытеснительная хроматография

Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) смешивают с трехкратным избытком VEGF165 и комплекс рецептор-лиганд очищают, используя колонку для вытеснительной хроматографии Pharmacia Superose 6. Затем комплекс рецептор-лиганд инкубируют в буфере, содержащем 6М раствора гидрохлорида гуанидина, для его расщепления на составные белки.

Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) отделяют от VEGF165 в колонке для вытеснительной хроматографии Superose 6 с использованием 6 М раствора хлорида гуанидина. Чтобы определить стехиометрию комплекса, инъецируют несколько доз Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а) и VEGF165 и строят график высоты или общей интенсивности пика в зависимости от концентрации вводимого белка. Калибровку выполняют в условиях, идентичных разделению компонентов комплекса Flt1D2Flk1D3.FcC1 (a)/VEGF. Количественное определение состава комплекса Flt1D2Flk1D3.FcC1 (a)/VEGF производят на основе калибровочных кривых. Результаты данного эксперимента, приведенные на фиг. 28, показывают, что соотношение VEGF165 и Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) в комплексе равно 1:1.

Пример 26. Определение стехиометрии связывания комплекса Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а)/VEGF165 при помощи вытеснительной хроматографии

Получение комплекса Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а)/VEGF165

VEGF165 (концентрация =3,61 мг/мл) смешивают с Flt1D2.Flk1D3.FcС1 (а), временно экспрессированным в клетках СНО (концентрация 0,9 мг/мл), в молярном отношении 3:1 (VEGF165:Flt1D2.Flk1D3.FcС1 (а)) и инкубируют в течение ночи при 4°С.

(a) Вытеснительная хроматография (SEC) в естественных условиях

Чтобы отделить комплекс от избытка несвязанного VEGF165, 50 мкл комплекса вводят в колонку Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30, которая уравновешена в буфере на основе PBS. Образец элюируют тем же буфером со скоростью потока 40 мкл/мин при комнатной температуре. Результаты SEC показаны на фиг. 31. Пик №1 соответствует комплексу, и пик №2 соответствует несвязанному VEGF165. Франции, элюированные в пределах 1,1 и 1,2 мл, объединяют и добавляют гидрохлорид гуанидина (GuHCl) до конечной концентрации 4,5 М с целью диссоциации комплекса.

(b) Вытеснительная хроматография (SEC) в условиях диссоциации

Чтобы разделить компоненты комплекса рецептор-лиганд и определить их молярное соотношение, 50 мкл описанного выше диссоциированного комплекса вводят в колонку Superose 12 PC 3.2/30, уравновешенную 6 М раствором GuHCl, и элюируют тем же раствором со скоростью потока 40 мкл/мин при комнатной температуре. Результаты SEC показаны на фиг. 32. Пик №1 соответствует Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) и пик №2 соответствует VEGF165.

(с) Вычисление стехиометрии комплекса Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а) VEGF165

Стехиометрию комплекса рецептор-лиганд определяют с учетом площади или высоты пиков компонентов. Концентрации VEGF165 и Flt1D2Flk1D3.FcС1 (a), соответствующие высоте или площади пиков, получают на основании стандартных кривых для VEGF165 и Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а). Чтобы построить стандартную кривую, четыре разные концентрации (0,04 мг/мл - 0,3 мг/мл) любого компонента инъецируют в колонку Pharmacia Superose 12 PC 3,2/30, уравновешенную 6 М раствором хлорида гуанидина, и элюируют тем же раствором со скоростью потока 40 мкл/мин при комнатной температуре. Стандартную кривую получают, вычерчивая график площади или высоты пика в зависимости от концентрации белка. Молярное соотношение VEGF165:Flt1D2Flk1D3.FcC1 (a), определенное на основании площади пиков компонентов, равно 1,16. Молярное соотношение VEGF165:Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а), определенное на основании высоты пиков компонентов, равно 1,10.

Пример 27. Определение стехиометрии комплекса Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а)/VEGF165 при помощи вытеснительной хроматографии со светорассеянием в оперативном режиме

Получение комплекса

VEGF165 смешивают с временно экспрессированным в клетках СНО белком Flt1D2.Flk1D3.FcС1 (а) в молярном соотношении 3:1 (VEGF165: Flt1D2Flk1D3.FcC1 (a)) и инкубируют в течение ночи при 4°С.

(а) Вытеснительная хроматография (SEC) со светорассеянием в оперативном режиме

Для определения молекулярной массы (MW) комплекса рецептор-лиганд используют колонку для вытеснительной хроматографии с детектором светорассеяния в оперативном режиме MiniDawn (Wyatt Technology, Santa Barbara, California) и детекторы показателя преломления (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japan). Образцы вводят в колонку Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia), уравновешенную буфером на основе PBS, и элюируют таким же буфером со скоростью потока 0,5 мл/мин при комнатной температуре. Как показано на фиг. 33, профиль элюирования имеет два пика. Пик №1 соответствует комплексу рецептор-лиганд, и пик №2 соответствует несвязанному VEGF165. Молекулярную массу высчитывают на основании сигналов LS и RI. Аналогичную процедуру используют для определения молекулярной массы отдельных компонентов комплекса рецептор-лиганд. Получены следующие результаты указанных определений: молекулярная масса комплекса Flt1D2Flk1D3.FcC1 (a)/VEGF165 в положении пика равна 157300 (фиг. 33), молекулярная масса VEGF165 в положении пика равна 44390 (фиг. 34) и молекулярная масса R1R2 в положении пика равна 113300 (фиг. 35).

Полученные данные свидетельствуют о том, что стехиометрия соотношения компонентов в комплексе Flt1D2Flk1D3.FcC1 (a)/VEGF равна 1:1, так как это соответствует сумме молекулярных масс для Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а) и VEGF165. Важно отметить, что указанный способ позволяет доказать в конечном счете, что комплекс Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а)/VEGF165 действительно состоит из одной молекулы лиганда VEGF165 и одной молекулы Flt1D2Flk1D3.FcC1 (a).

Пример 28. Пептидное картирование Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (a)

Дисульфидные структуры и сайты гликозилирования в Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) определяют методом пептидного картирования. В соответствии с данным методом белок сначала расщепляют трипсином. Расщепленные трипсином фрагмены анализируют и идентифицируют при помощи ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией и секвенированием N-конца. Восстановление трипсинового гидролизата помогает идентифицировать фрагменты, имеющие дисульфидные связи. Обработка трипсинового гидролизата препаратом PNGase F (Glyko, Novato, CA) помогает идентифицировать фрагменты с N-связанными сайтами гликозилирования. Результаты суммированы на прилагаемой фиг. 36.

Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) содержит в общем сложности десять цистеинов, шесть из которых относятся к области Fc. Установлено, что Cys27 связан дисульфидной связью с Cys76. Cys121 связан дисульфидной связью с Cys182. Первые два цистеина в области Fc (Cys211 и Cys214) образуют межмолекулярную дисульфидную связь с такими же двумя цистеинами в другой цепи Fc. Однако, поскольку указанные два цистеина невозможно отделить друг от друга ферментативным способом, нельзя определить, существует ли дисульфидная связь между одинаковыми цистеинами (например, между Cys211 и Cys211) или между Cys211 и Cys214. Установлено, что Cys216 связан дисульфидной связью с Cys306. Установлено, что Cys352 связан дисульфидной связью с Cys410.

Flt1D2.Flk1D3.FcС1 (а) содержит пять вероятных N-связанных сайтов гликозилирования. Установлено, что все пять сайтов гликозилированы в разной степени. Полное гликозилирование наблюдается на сайтах Asn33 (аминокислотная последовательность NIT), Asn193 (аминокислотная последовательность NST) и Asn282 (аминокислотная последовательность NST). Кроме того, частичное гликозилирование обнаружено на сайтах Asn65 и Asn120. Сайты гликозилирования подчеркнуты на фиг. 36.

Пример 29. Фармакокинетический анализ модифицированных рецепторов Flt

(а) Фармакокинетический анализ Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и VEGFR1R2-FcC1 (а)

Мышам Balb/ c (25-30 г) подкожно инъецируют 4 мг/кг Flt1(1-3)-Fc (A40), временно экспрессированного в клетках СНО белка Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (a), постоянно экспрессированного в клетках СНО белка Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и временно экспрессированного в клетках СНО белка VEGFR1R2-FcC1 (а). У мышей из хвоста берут кровь через 1, 2, 4, 6, 24 часа, 2 дня, З дня и 6 дней после инъекции. Сыворотку анализируют при помощи анализа ELISA, предназначенного для обнаружения Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (a). При выполнении анализа ELISA планшеты для ELISA покрывают VEGF165, связывают с ним детектируемый белок Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) или VEGFR1R2-FcC1 (а) и считывают результаты при помощи антитела против Fc, связанного с пероксидазой хрена. Результаты экспериментов показаны на фиг. 37. T_max для Flt1(1-3)-Fc (A40) соответствует 6 часам, в то время как Т_max для временно и постоянно экспрессированного белка Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и временно экспрессированного белка VEGFR1R2-FcC1 (а) соответствует 24 часам. C_max для Flt1(1-3)-Fc (A40) равно 8 мкг/мл. Для обоих временно экспрессированных белков (Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и VEGFR1R2-FcC1 (а)) С_max равно 18 мкг/мл и С_max для постоянно экспрессированного белка VEGFR1R2-FcC1 (а) равно 30 мкг/мл.

(b) Фармакокинетический анализ Flt1(1-3)-Fc (A40) Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (a)

Мышам Balb/c (25-30 г) подкожно инъецируют 4 мг/кг Flt1(1-3)-Fc (A40), временно экспрессированного в клетках СНО белка Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и временно экспрессированного в клетках СНО белка Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (a). У мышей из хвоста берут кровь через 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 и 20 дней после инъекции. Сыворотку анализируют при помощи анализа ELISA, предназначенного для обнаружения Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (a). При выполнении анализа ELISA планшеты для ELISA покрывают VEGF165, связывают с ним белок Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (a) или Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (а) и считывают результаты при помощи антитела против Fc, связанного с пероксидазой хрена.Flt1(1-3)-Fc (A40) не обнаружен в сыворотке через 5 дней, в то время как Flt1D2.FlklD3.FcC1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (а) обнаружены через 15 или более дней. Результаты данного эксперименты показаны на фиг. 38.

Пример 30. Оценка способности Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) подавлять рост опухоли in vivo

Для оценки способности Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) подавлять рост опухоли in vivo используют животную модель, которую получают, имплантируя суспензии опухолевых клеток подкожно в правый бок самцам мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID). При выполнении данного анализа используют две линии клеток, в частности линию клеток фибросаркомы человека НТ-1080 (№ доступа АТСС CCL-121) и линию клеток глиомы крыс С6 (№ доступа АТСС CCL-107), которые обладают совершенно разной морфологией и характеристиками роста. Первую дозу Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) (в дозе 25 мг/кг или как показано на фиг. 39 и 40) вводят в день имплантации опухоли. Затем животным делают подкожные инъекции Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) или носителя через день или два раза в неделю в течение 2 недель. Через 2 недели животных обрабатывают фиксатором, опухоли удаляют и образцы анализируют слепым методом. Объем опухоли определяют, измеряя длину и ширину видимых подкожных опухолей. Как Flt1(1-3)-Fc (A40), так и Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) значительно уменьшают рост опухолей, образованных клетками НТ-1080 и С6. Результаты указанных экспериментов приведены на фиг. 39 и 40.

Пример 31. Влияние VEGF165 и модифицированных рецепторов Flt на женскую репродуктивную систему

Стереотипическая картина изменения сосудов, которая имеет место в матке и яичнике на протяжении репродуктивного цикла, хорошо исследована, что делает указанные ткани особенно пригодными для изучения механизмов, регулирующих возникновение, изменение и разрушение сосудов. Действительно, исследования гибридизации in situ в репродуктивных тканях впервые свидетельствуют о том, что VEGF выступает в качестве медиатора физиологического ангиогенеза у взрослых грызунов, а также у человека и приматов, кроме человека (Phillips et al., 1990; Ravindranafch et al., 1992; Shweiki et al., 1993; Kamat et al. 1995). Поскольку циклическое возникновение и изменение сосудов являются главными характеристиками нормального яичника и матки, неудивительно, что аномальный рост и/или неправильное функционирование кровеносных сосудов стали считать признаком многих патологических состояний, которые влияют на данные органы. Кроме того, считается, что указанные патогенные аномалии кровеносных сосудов вызваны или обусловлены неправильной экспрессией одного или нескольких ангиогенных или антиангиогенных факторов, в частности VEGF.

Например, аномальное развитие кровеносных сосудов характерно для поликистозного заболевания яичника, эндометриоза и внутриматочного рака, и в каждом случае VEGF избыточно экспрессирован в пораженной ткани (Kamat et al., 1995, Shifren et al., 1996; Guidi et al., 1996; Donnez et al., 1998). Считается также, что сверхэкспрессия VEGF участвует в патогенезе развития повышенной проницаемости сосудов в случае синдрома гиперстимуляции яичника (McClure et al., 1994; Levin et al., 1998) и преэклампсии (Baker et al., 1995; Sharkey et al., 1996). Кроме того, VEGF действует в качестве фактора увеличения проницаемости, вызывающего асцит, характерный для рака яичника и других опухолей (Senger et al., 1983; Boocock et al., 1995). Весьма вероятно, что вещества, которые эффективно нейтрализуют биологические действия VEGF, должны обладать терапевтическим действием при лечении вышеуказанных и родственных заболеваний.

Возникновение и изменение сосудов являются также признаками внедрения бластоцисты и развития плаценты (Findlay, 1986). VEGF интенсивно экспрессируется в отпадающей оболочке матки и эмбриональных трофобластах, где указанный фактор сначала стимулирует увеличение и повышенную проницаемость сосудистой сети матки в период оплодотворения и последующего образования материнских и эмбриональных компонентов в сосудистой сети плаценты (Shweiki et al., 1993; Cullinan-Bove and Koos, 1993; Chakraborty et al., 1995; Das et al., 1997). VEGF также вызывает развитие кровеносных сосудов желтого тела и обусловленную им секрецию прогестерона, что необходимо для подготовки матки к оплодотворению (Ferrara et al., 1998). Таким образом, вещества, которые подавляют биологическую активность VEGF, могут быть полезны в качестве противозачаточных средств (для предотвращения оплодотворения) или средств, вызывающих аборт на ранних стадиях беременности. Последнее применение может оказаться особенно полезным в качестве нехирургического способа прерывания эктопических беременностей.

Хотя экспрессия рецепторов VEGF в основном ограничена эндотелием сосудов в нормальных репродуктивных тканях, Flt1 также экспрессируется трофобластами в плаценте человека и животных (Clark et al., 1996; He et al., 1999), где, как предполагается, данный белок участвует в инвазии трофобластов. Интересно отметить, что Flt1 и KDR (Flk1) экспрессируются линией клеток хориокарциномы BeWo (Charnock-Jones et al., 1994), при этом установлено, что VEGF стимулирует синтез ДНК и фосфорилирование тирозином МАР-киназы в указанных клетках. Кроме того, первичные и метастатические опухоли яичника не только экспрессируют большие количества VEGF, но в дополнении к эндотелию сосудов опухолевые клетки сами секретируют KDR и/или Flt1 (Boocock et al., 1995). Полученные результаты позволяют предположить, что VEGF не только играет существенную роль в образовании и сохранении сосудистой сети опухоли, но и по крайней мере в некоторых опухолях репродуктивных органов VEGF играет вспомогательную роль, способствуя выживанию и пролиферации опухолевых клеток. Таким образом, вещества, которые блокируют действие VEGF, можно эффективно применять при лечении опухолей репродуктивных органов.

Способы и результаты

(а) Оценка VEGF-индуцированной повышенной проницаемости матки

Сывороточный гонадотрофин беременной кобылы (PMSG) инъецируют подкожно (5 м.д.) самкам крыс для индуцирования овуляции в препубертатном периоде. Это стимулирует выброс эстрадиола через 2 дня, что в свою очередь вызывает индукцию VEGF в матке. Как известно, указанная индукция вызывает повышенную проницаемость матки и увеличение сырой массы матки через 6 часов, что потенциально можно блокировать модифицированными рецепторами Flt, такими как Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (a). В данной модели in vivo нормальная масса матки крысы равна примерно 50 мг, причем ее можно увеличить до 300-350 мг при помощи PMSG. Обезвоживание ткани показывает, что масса увеличивается за счет воды. Подкожная инъекция Flt1(1-3)-Fc (А40), Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcC1 (а) в дозе 25 мг/кг через 1 час после инъекции PMSG примерно на 50% подавляет увеличение сырой массы матки. Увеличение дозы модифицированного рецептора Flt не сокращает увеличение сырой массы, позволяя предположить, что в указанной модели есть независимый от VEGF компонент. Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 41.

(а) Оценка ангиогенеза желтого тела с использованием прогестерона в качестве тестирующего агента

Сывороточный гонадотропин беременной кобылы (PMSG) инъецируют подкожно (5 м.д.) самкам крыс для их овуляции в препубертатном периоде. Через 4 дня образуется активное желтое тело с плотной сетью кровеносных сосудов, которое секретирует прогестерон в кровоток, подготавливая матку к оплодотворению. Для индуцирования образования кровеносных сосудов в желтом теле необходим VEGF; поэтому блокирование VEGF должно устранить образование новых кровеносных сосудов и, следовательно, уменьшить количество прогестерона, секретируемого в кровоток. В данной модели in vivo уровни прогестерона в состоянии покоя равны примерно 5 нг/мл и могут быть увеличены до 25-40 нг/мл после введения PMSG. Подкожная инъекция Flt1(1-3)-Fc (A40) или Flt1D2.Flk1D3.FcC1 (а) в дозе 25 мг/кг или 5 мг/кг через 1 час после введения PMSG полностью подавляет индукцию прогестерона на 4-й день. Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 42А-42В.

Пример 33. Фармакокинетический анализ Flt1(1-3)-Fc (A40) и обработанного полиэтиленгликолем Flt1(1-3)-Fc

Flt1(1-3)-Fc обрабатывают полиэтиленгликолем с длиной цепи 10 кДа или 20 кДа и исследуют их фармакокинетический профиль, используя мышей Balb/c. Установлено, что обе обработанные полиэтиленгликолем формы Flt1(1-3)-Fc имеют гораздо лучшие фармакокинетические профили, чем Flt1(1-3)-Fc (A40), при этом Т_max для обработанных полиэтиленгликолем молекул соответствует 24 часам по сравнению с 6 часами для Flt1(1-3)-Fc (A40).

Пример 34. Анализ VEGF165 при помощи ELISA для определения сродства модифицированных вариантов рецепторов Flt1

10 пМ VEGF165 инкубируют в течение ночи при комнатной температуре с модифицированными вариантами рецепторов Flt1 в количестве от 160 пМ до 0,1 пМ. При выполнении данного эксперимента использованы такие модифицированные варианты рецепторов Flt1, как Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40), временно экспрессированный Flt1D2Flk1D3.FcС1 (а), временно экспрессированный Flt1D2VEFGFR3D3-FcC1 (а), Flt1 (1-3_NAS)-Fc, и Tie2-Fc. Flt1(1-3_NAS)-Fc является модифицированным вариантом Fit1(1-3)-Fc, в котором высокоосновная аминокислотная последовательность KNKRASVRRR заменена NASVNGSR, что позволяет ввести два новых сайта гликозилирования и суммарно удалить пять положительных зарядов с целью уменьшения неблагоприятного воздействия данной последовательности на фармакокинетический профиль. является модификацией, в которой один остаток аргинина (R) в той же основной аминокислотной последовательности заменен цистеином (С) (KNKRASVRRRKNK CASVRRR), что делает возможной обработку полиэтиленгликолем у данного остатка, благодаря чему основная область перестает оказывать неблагоприятное воздействие на фармакокинетический профиль. После инкубации раствор переносят на планшет, содержащий иммобилизованное антитело для VEGF165 (R&D). Затем определяют количество свободного VEGF165, используя антитело для считывания свободного VEGF165. Полученные результаты показывают, что модифицированным вариантом рецептора Fit1 с наибольшим сродством к VEGF165 (определяемым в виде наименьшего количества свободного VEGF165) является Flt1D2Flk1D3.FcC1 (а), за которым следуют Flt1(1-3)-Fc и Flt1(1-3)-Fc (A40) и затем , Flt1(1-3_NAS)-Fc и Flt1D2VEFGFR3D3-FcC1 (a). Tie2Fc не обладает сродством к VEGF165.

Пример 35. Варианты слитых белков рецептора VEGF с доменами разной ориентации

1. Конструирование и экспрессия вариантов слитых белков рецептора VEGF с доменами разной ориентации

Каждый отдельный домен слитого белка рецептора VEGF, Flt1.Ig2 ("R1"), Flk1.Ig3 ("R2") и hFcC1(a) ("Fc"), ампифицировали с помощью ПЦР, применяя специфические олигонуклеотидные праймеры, все из которых содержали одну и ту же дополнительную линкерную последовательность ДНК, дающую возможность расщеплять ее последовательно рестриктазами и лигировать ДНК в заранее определенном порядке так, чтобы каждый отдельный домен мог быть отнесен к какому-либо из трех районов последовательности, кодирующей конечный транслируемый белок. Например, рестрикционное расщепление ферментами "А" и "В" направит фрагмент ДНК в положение один, расщепление ферментами "В" и "С" направит фрагмент ДНК в положение два, а расщепление ферментами "D" и "Е" направит фрагмет ДНК в положение три. Эта стратегия позволяет использовать ПЦР-продукт каждого исходного отдельного домена для конструирования шести возможных комбинаций из трех доменов, являющихся компонентами слитого белка ((1) R1.R2.Fc, (2) R2.R1.Fc, (3) Fc.R1.R2, (4) Fc.R2.R1, (5) R1.Fc.R2 и (6) R2.Fc.R1), со стандартным пептидными линкерами между ними.

После очистки плазмидных ДНК, имеющих желаемые последовательности, каждый из шести типов плазмид, а также "пустой" вектор в качестве отрицательного контроля, индивидуально трансфицировали в клетки СНО RGC38 с использованием Lipofectamine. После трансфицирования клетки культивировали в течение трех дней в среде F12, содержащей фетальную телячью сыворотку с крайне низким содержанием IgG. Кондиционированную среду собирали и определяли при помощи Вестерн-анализа уровень экспрессии для различных конструкций. Также анализирировали способность вариантов в кондиционированной среде связывать VEGF.

2. Способность связывать VEGF при выполнении анализа на основе BiaCore

Анализ на основе BiaCore выполняли как описано в примере 6 данного описания для оценки способности связываться с поверхностью, обработанной VEGF, каждого из шести слитых белков VEGF-рецептора. В этом анализе использовались следующие параметры: чип - СМ5; буфер - HBS-T; скорость потока - 5 мкл/мин; инъекция - 150 мкл; образец - IX супернатант, двойная инъекция; поверхность - hVEGF165-аминосвязанный 3400RU.

3. Результаты

В таблице 1 демонстрируется относительное связывание с VEGF каждого из слитых белков рецептора VEGF: pTE903=R1.R2.Fc, pTE904=R2.R1.Fc, pTE905=Fc.R1.R2, pTE906=Fc.R2.R1, pTE907=R1.Fc.R2, pTE908=R2.Fc.R1. Каждый из шести слитых белков рецептора VEGF продемонстрировал специфическую активную относительную реакцию (RU) на hVEGF165-поверхность. Кроме того, относительное связывание вариантов с различной ориентацией доменов сравнивали с относительным связыванием белка в исходной ориентации (рТЕ903). Никакого фонового связывания не было обнаружено с супернатантом культуры клеток, трансфицированных "пустым" вектором.

Таблица 1
Плазмида		Конфигурация	Сред. RU
рТЕ903		R1.R2.Fc	2449
рТЕ904		R2.R1.Fc	1474
рТЕ905		Fc.R1.R2	1430
рТЕ906	Fc.R2.R1		2188
рТЕ907	R1.Fc.R2		2090
рТЕ908000	R2.Fc.R1.		1016
"Пустая"			-12

4. Выводы

Эти экспериментальные данные показывают, что специфическое связывание с VEGF было получено для каждого из шести слитых белков рецептора VEGF. Соответственно, позиция компонентов в заявленных конструкциях может меняться, тогда как способность связывать VEGF сохраняется.