способ регенерации меристем

Формула изобретения

Способ регенерации меристем, включающий вычленение меристематических эксплантов размером 0,1-0,2 мм в асептических условиях, высадку их на стерильную питательную среду в пробирки и культивирование, отличающийся тем, что в состав питательной среды на первом этапе ввода добавляется препарат эмистим в концентрации 10^-5 -10^-11 мл/л.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к способам размножения растений.

Известен способ получения безвирусных клонов винограда при помощи термотерапии (Т.Д.Вердеревская, В.Г.Маринеску "Вирусные и микроплазменные заболевания плодовых культур и винограда"). Кишинев, Штиинца, 1985 г. с.276).

Недостатком способа является то, что применение термотерапии в ряде случаев приводит к отставанию в росте и деформации органов меристемных растений. Этот прием может также увеличить латентные и термостойкие вирусные инфекции.

Известен способ культивирования меристематических верхушек в асептических условиях на искусственных питательных средах (Г.С.Муромцев, Р.Г.Бутенко и др. "Основы сельскохозяйственной биотехнологии", М., 1990., стр.225). Наибольшее число здоровых растений получается в этом случае при использовании меристематических эксплантов размером 0,1-0,2 мм.

Недостатком способа является то, что меристематические экспланты таких размеров характеризуются слабой способностью к регенерации. Процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого нормального пробирочного растения, идет в этом случае наиболее трудно.

Известен способ микроклонального размножения ежевики, включающий использование препарата эмистим (Высоцкий В.А., Карпова О.В., Янина М.М., 1999). Способ применяется на организменном уровне для стимуляции корнеобразования у побегов, полученных в результате пролиферации. Способ осуществляется на обедненной питательной среде Мурасиге и Скуга.

К недостатку способа относится то, что в результате его применения наблюдается только стимуляция ризогенеза. Кроме этого, отмечена сортоспецифичность на этапе индукции ризогенеза в зависимости от генотипа растения, слабая отзывчивость на эмистим и даже угнетение отдельных сортов.

Известен способ регенерации меристем, включающий вычленение меристематических эксплантов размером 0,1-0,2 мм в асептических условиях, высадку их на стерильную питательную среду в пробирки и культивирование (Н.П.Дорошенко, Г.В.Лузгин, А.Ф.Карлов "Способ регенерации меристем", патент на изобретение №2120739, 1998 г.). В данном способе для повышения регенерационной способности меристем воздействуют на них электромагнитным СВЧ-полем в комплексе с узкополосным лазерным лучом.

Недостатком способа является необходимость облучения единичных пробирок с меристемами в течение довольно продолжительного времени, что отрицательно влияет на скорость выполнения работы. Кроме этого, стимуляция развития меристем происходит только за счет внутренних резервов растительного организма.

Целью предложенного способа регенерации меристем является улучшение приживаемости меристем, оздоровление растений винограда от вирусной инфекции, повышение выхода оздоровленных растений.

Поставленная цель осуществляется тем, что в способе регенерации меристем, включающем вычленение меристематических эксплантов размером 0,1-0,2 мм в асептических условиях, высадку их на стерильную питательную среду в пробирки и культивирование, в состав питательной среды на первом этапе ввода добавляется препарат эмистим в концентрации 10^-5-10^-11 .

Эмистим - это препарат серии "симбионт", выделенный из грибов Acremonium lichenicola, композиция ростовых веществ цитокининовой и гиббереллиновой природы, положительно влияет на процессы роста и развития растений, снижает влияние неблагоприятных и стрессовых факторов внешней среды. Это свидетельствует о перспективности его применения для регуляции роста различного типа клеток, для усиления роста клеток стебля, стимуляции клеточного деления, фотосинтеза, повышения устойчивости растений и создает предпосылки для использования в технологии in vitro.

Особое значение имеет применение этого препарата на этапе ввода меристем в культуру ткани. Меристемы размером 0,1-0,2 мм, выделенные и высаженные на питательную среду, нуждаются в защите от стресса и патогенов, в стимуляции клеточного деления для их роста и усиления пролиферации (новообразование узлов и побегов) на следующем этапе собственно микроразмножения.

Новым в предложенном способе является воздействие эмистима на клеточном уровне на меристематические ткани, которые представляют собой группы недеференцированных клеток, из которых образуются все постоянные ткани и органы растительного организма. Под влиянием эмистима повышается меристематическая активность тех участков меристемы конуса нарастания, которые не проявляют видимой активности в данное время, а будто "выжидают" своего времени для образования тех или иных тканей или структур, то есть сокращается период "меристемы ожидания". В результате повышается и надолго сохраняется способность клеток к делению. Таким образом, активизируются ростовые формообразовательные и функциональные процессы.

Эмистим включает защитные механизмы меристематических тканей, которые приобретают способность активно сопротивляться инфекции, в результате чего повышается их устойчивость к патогенам и приживаемость меристем.

Существенным является применение препарата эмистим в пределах 10^-5-10 ^-11 мл/л.

Способ осуществляется следующим образом. Для получения эксплантов срезают растущие или вызревшие побеги винограда диаметром 2-4 мм с глазками, удаляют листья, разрезают поперек на отрезки 1,0-1,5 см и вдоль, чтобы отрезок стебля с глазком (сегмент) имел плоское основание. Затем осуществляют поверхностную стерилизацию.

Техника стерилизации заключается в следующем. Сегменты тщательно моют теплой водой с мылом и промывают дистиллированной водой, опускают на несколько секунд в спирт, а затем в 10%-ный раствор гипохлорита кальция. Через 30 минут сегменты переносят в стакан со стерильной дистиллированной водой, выдерживают 10 минут, а затем меняют воду еще 2 раза, выдерживая в каждой порции 15-20 минут.

Экспланты вычленяют в асептических условиях в бокс-комнате в ламинарном боксе "Фотран" под бинокулярным микроскопом МБС-9 при 25-кратном увеличении с помощью препаровальных и дисцизионных игл. Эксплант представляет собой меристематический купол с одним-двумя примордиальными листьями или без листовых примордиев размером 0,1-0,2 мм.

Сразу после вычленения экспланты высаживают на твердую стерильную питательную среду в короткие пробирки (70-80 мм) и закрывают стерильными пробками. Основной средой является питательная среда Мурасиге и Скуга, модифицированная следующим образом: ¾ макроэлементов, микроэлементы и хелат железа по Мурасиге и Скугу; 170 мг/л NaH ₂PO₄, мезоинозит 100 мг/л, сахароза 30 г/л, 6-БАП 0,5 мг/л, рН 5,1. Приготовление среды осуществляют по общепринятой методике.

В приготовленную среду добавляют эмистим в количестве от 10^-5 до 10^-11 мл/л в зависимости от сортовых особенностей оздоравливаемого сорта. Концентрацию эмистима предварительно определяют опытным путем.

В процессе культивирования на твердой питательной среде меристемы в различной степени увеличиваются в размере. Для того чтобы ускорить дифференциацию органов и их дальнейшее развитие, меристемы среднего (1-2 мм) и крупного (более 2-х мм) размера переносят на жидкую питательную среду Мурасиге и Скуга на косые мостики из фильтровальной бумаги, а пробирки помещают на вращающийся аппарат роллерного типа с тем, чтобы меристемы все время омывались питательной средой.

Следующим этапом является процесс собственно микроразмножения - пролиферация (новообразование) пазушных побегов у увеличившихся после прохождения второго этапа ввода меристем, основанная на снятии апикального доминирования путем введения в питательную среду Мурасиге и Скуга (по прописи) регулятора роста с цитокининовой активностью - 6-бензиламинопурина.. (6-БАП). Это приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки и меристематические бугорки дают начало новым побегам. Экспланты на этой среде приобретают вид пучков маленьких побегов, каждый из которых может быть повторно рекультивирован и образовать новые побеги.

Эффективность применения эмистима оценивается по приживаемости меристем (репаративная регенерация) и по образованию побегов на этапе собственно микроразмножения (продуктивная регенерация).

Как следует из данных, приведенных в табл.1-5, препарат эмистим оказывает положительное влияние на улучшение регенерационной способности меристем. Эффективность действия эмистима зависит от сортовых особенностей винограда и от концентрации этого препарата в составе питательной среды, применяемой на первом этапе ввода того или иного сорта винограда в культуру in vitro.

Четкое улучшение приживаемости меристем под влиянием эмистима как на первом, так и на втором этапе ввода отмечено у сорта Дружба (табл.1). Особенно это отмечено на первом этапе ввода, когда приживаемость меристем увеличилась с 56,1% до 71,8-81,2% при концентрации эмистима 10^-9 и 10 ^-11 мл/л. На втором этапе ввода приживаемость меристем также улучшилась в вариантах с введением этого препарата в состав питательной среды.

У сорта Каберне северный (табл.2) на первом этапе ввода при применении эмистима наблюдалось некоторое снижение приживаемости меристем, наиболее значительное при концентрации 10^-5 мл/л. Однако на втором этапе ввода при содержании эмистима в питательной среде 10^-5-10^-9 мл/л приживаемость меристем даже несколько увеличилась по сравнению с контролем.

Улучшение репаративной регенерации меристем при применении эмистима отмечено у сортов Платовский и Шардоне (табл.3), наиболее значительное при концентрации 10^-5 -10^-6 мл/л.

Более значительное влияние препарат эмистим оказал на продуктивную регенерацию (новообразование узлов и побегов, срезка побегов для укоренения и дальнейшего микроразмножения). Этот показатель также зависел от сортовых особенностей. При этом оптимальная концентрация препарата была различной для каждого отдельного сорта. У сорта Дружба наибольшее число побегов - 216 шт. - было срезано в варианте с концентрацией эмистима 10 ^-11 мл/л (в 3,5 раза больше чем в контроле). Для сорта Каберне северный эта концентрация также была оптимальной (табл.2) - срезано побегов в 1,5 раза больше чем в контроле. Для сорта Платовский и Шардоне (табл.3) более эффективным оказалось применение более высоких концентраций этого препарата 10^-5-10 ^-6 мл/л. Число срезанных побегов увеличилось по сравнению с контролем у сорта Шардоне в 1,6 раза, а у сорта Платовский в 3,5 раза.

Увеличение продуктивной регенерации произошло благодаря увеличению продолжительности этапа собственно микроразмножения, увеличению числа пассажей вообще, в том числе продуктивных. Кроме этого, показателями, характеризующими продуктивную регенерацию, являются: число срезанных побегов в расчете на одну выделенную меристему, на один пассаж, в том числе на один продуктивный пассаж (табл.5).

Таблица 1 Репаративная и продуктивная регенерация меристем при добавлении в питательную среду различных концентраций эмистима, сорт Дружба, 1999-2001 гг.
Варианты	Приживаемость меристем, %		Срезано побегов в пассаже, штук
	на первом этапе	на втором этапе	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	всего
Контроль (без эмистима)	56,1	39,0	2	3	10	3	5	19	10	4	3	1	1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	61
Эмистим 10-11	71,8	46,0	0	3	3	3	5	12	8	5	4	11	12	22	30	24	27	14	16	9	3	3	2	216
Эмистим 10-9	81,2	46,8	2	2	13	7	9	1	13	6	3	2	4	1	0	0	0	0	10	-	-	-	-	73
Эмистим 10-7	68,7	46,8	1	0	7	4	6	11	12	6	17	23	6	5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	98
Эмистим 10-5	64,5	41,9	2	1	9	3	3	3	1	2	3	5	19	10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	61
Эмистим 10-3	54,5	30,0	0	1	3	0	1	6	5	2	0	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	18

Таблица 2 Репаративная и продуктивная регенерация меристем при добавлении в питательную среду различных концентраций эмистима, сорт Каберне северный
Варианты	Приживаемость меристем		Срезано побегов в пассаже
	на первом этапе	на втором этапе	1	2	3	4	5	6	7	8	9	всего
Контроль (без эмистима	96,4	77,7	1		19	3	5	5	9	8	23	73
Эмистим 10-13	89,2	76,0	1	1	5	3	3	-	-	-	-	13
Эмистим 10-11	89,2	72,0	1	9	5	2	2	13	13	18	44	107
Эмистим 10-9	89,2	84,0	2	2	5	2	9	24	6	16	23	89
Эмистим 10-7	89,2	84,0	5	12	6	5	3	8	6	11	8	64
Эмистим 10-5	60,7	94,1	3	3	3	-	4	-	-	3	-	15
Эмистим 10-3	40,3	63,2	1	1	0	0	1	-	-	-	-	3

Таблица 3 Репаративная и продуктивная регенерация меристем сортов винограда Платовский и Шардоне при добавлении в питательную среду различных концентраций эмистима, 2001-2002 г.
Варианты	Приживаемость меристем, % на этапе		Срезано побегов в пассаже, штук
	первом	втором	1	2	3	4	5	6	7	8	9	всего
	Платовский
Контроль (без эмистима)	86,6	43,3	1	2	0	10	3	5	0	-	-	21
Эмистим 10-13	73,3	60,0	0	5	6	13	7	2	4	0	-	37
Эмистим 10-9	63,3	56,6	0	5	6	10	4	2	5	-	-	32
Эмистим 10-7	80,0	60,0	0	2	8	17	11	7	3	0	5	53
Эмистим 10-5	90,0	70,0	1	3	9	14	9	16	12	5	8	77
Шардоне
Контроль (без эмистима)	92,8	65,3	0	3	8	5	11	8	1	-	-	36
Эмистим 10-10	89,2	32,0	1	2	0	2	3	2	0	-	-	10
Эмиистим 10-8	96,4	74,0	1	6	3	6	19	0	0	-	-	35
Эмистим 10-6	96,4	75,5	0	12	20	16	11	0	1	-	-	60

Таблица 4 Влияние различных концентраций эмистима на прохождение этапа собственно микроразмножения у различных сортов винограда
Варианты	Продолжительность этапа, дней	Число пассажей, шт.		Срезано побегов, штук
		всего	продуктивных	всего	в расчете на меристему	на один пассаж	на продуктивный пассаж
Дружба
Контроль	205	11	11	61	3,8	5,5	5,5
Эмистим 10-11	414	21	20	216	16,7	10,3	10,8
Эмистим 10-9	342	17	13	73	4,8	4,3	5,6
Эмистим 10-7	247	12	11	98	6,5	8,1	8,9
Эмистим 10-5	219	12	12	61	4,7	5,1	5,1
	Каберне северный
Контроль	293	8	8	73	2,6	9,1	9,1
Эмистим 10-13	228	5	5	13	0,4	2,6	2,6
Эмистим 10-11	310	9	9	107	3,8	11,9	11,9
Эмистим 10-9	310	9	9	89	3,1	9,9	9,9
Эмистим 10-7	293	9	9	64	2,2	7,1	7,1
Эмистим 10-5	228	5	5	15	0,5	3,0	3,0
Шардоне
Контроль	91	7	6	36	1,2	5,1	6,0
Эмистим 10-10	105	6	5	10	0,3	1,6	2,0
Эмистим 10-8	45	5	5	35	1,2	8,7	8,7
Эмистим 10-6	91	5	5	60	2,1	12,0	12,0
Платовский
Контроль	168	7	5	21	0,7	3,0	4,2
Эмистим 10-13	153	9	6	37	1,2	4,1	6,1
Эмистим 10-9	153	9	6	32	1,1	5,3	5,3
Эмистим 10-7	195	9	7	53	1,7	5,8	7,5
Эмистим 10-5	195	9	9	77	2,5	8,5	8,5

Таблица 5 Влияние добавления в питательную среду препарата эмистим на регенерационную способность меристем винограда при оздоровлении растений от вирусной инфекции
Показатели	Заявленное техническое решение	Прототип
1. Приживаемость меристем на первом этапе ввода их в культуру, %	100,0	71,8
2. Приживаемость меристем на втором этапе ввода их в культуру, %	80,0	46,2
3. Продолжительность этапа собственно микроразмножения, дней	414,0	84,0
4. Число продуктивных пассажей, шт.	20	5
5.Срезано побегов в течение этапа собственно микроразмножения, шт.	216	22,0
6. Срезано побегов в расчете на одну выделенную меристему	16,7	4,4

По комплексу этих показателей наиболее отзывчивым на эмистим оказался сорт Дружба. При продолжительности этапа собственно микроразмножения 414 дней был осуществлен 21 пассаж, 20 из которых оказались продуктивными. В каждом пассаже было срезано 10,3 побега (в 2 раза больше, чем в контроле). В расчете на одну выделенную меристему число срезанных побегов составило 16,7 штук, что в 4,4 раза больше чем в контроле. Оптимальная концентрация эмистима 10^-11 мл/л.

На втором месте по отзывчивости находится сорт Платовский. При концентрации 10^-5 мл/л продолжительность этапа пролиферации увеличилась по сравнению с контролем на 30 дней, более чем в 2 раза увеличилось число продуктивных пассажей, в 2,8 раза возросло число срезанных побегов в расчете на один продуктивный пассаж и в 3,6 раза в расчете на одну выделенную меристему.

У сорта Шардоне отзывчивость на эмистим несколько ниже. Тем не менее, при концентрации 10^-6 мл/л произошло увеличение числа срезанных побегов в 1,6 раза по сравнению с контролем, число срезанных побегов в расчете на одну выделенную меристему увеличилось в 1,7 раза, в расчете на один пассаж в 2,3 раза, на один продуктивный пассаж в 2,3 раза.

У сорта Каберне северный под воздействием препарата в концентрации 10 ^-11 мл/л произошло небольшое увеличение продолжительности этапа собственно микроразмножения, несколько увеличилось число пассажей. Общее число срезанных побегов, число срезанных побегов в расчете на одну выделенную меристему, на один пассаж увеличилось при этой концентрации в 1,3-1,4 раза. При концентрациях препарата 10^-13-10^-5 мл/л наблюдалось угнетение продуктивной регенерации меристем.

Таким образом, при добавлении в состав питательной среды препарата эмистим в концентрации 10^-5 -10^-11 мл/л происходит улучшение приживаемости меристем как на первом, так и на втором этапе ввода их в культуру, увеличение продолжительности этапа собственно микроразмножения, числа продуктивных пассажей. Все это способствует тому, что увеличивается число срезанных побегов и регенерационная способность меристем размером 0,1-0,2 мг/л и, следовательно, эффективность оздоровления растений винограда от вирусной инфекции.