способ индикации биоцидной активности перекисных дезинфицирующих растворов к ботулиническому нейротоксину

Формула изобретения

Способ индикации биоцидной активности перекисных дезинфицирующих растворов к ботулиническому нейротоксину, заключающийся в приготовлении препаратов глобулярных белков бактериальной природы, воздействии дезинфицирующей композиции на приготовленные препараты, экспозиции и оценке эффективности дезинфектанта по сохранению специфических свойств белков после дезинфекционной обработки, отличающийся тем, что в качестве препарата глобулярных белков используются белковые комплексы класса С, инициирующие льдообразование переохлажденной воды, продуцируемые микроорганизмами родов Erwinia и Pseudomonas, а оценка эффективности дезинфицирующих растворов производится инструментальным криоскопическим микрокапельным методом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам определения дезинфицирующей активности перекисных растворов в отношении микробных токсинов белковой природы и может быть использовано в биотехнологии, санитарной, медицинской и прикладной микробиологии.

Определение биоцидной активности дезинфицирующих средств предполагает воздействие ими на тест-объект с последующей оценкой его биологической активности до и после воздействия. Применительно к ботулиническому нейротоксину определение биологической активности заключается в количественном определении белка по его токсическим свойствам.

Имеется большое количество методов определения активности ботулинических токсинов, среди которых необходимо отметить индикацию ботулинических токсинов по реакции задержки фагоцитоза и восстановления его в присутствии специфических сывороток (Матвеев К.И. Ботулизм. - М., 1959, - 407 с.). Однако метод не нашел широкого признания ввиду ориентировочности получаемых результатов. Малоупотребительными, ввиду недостаточной чувствительности, остаются и обычные серологические методы, основанные на реакции между токсином и соответствующими антителами. В настоящее время разработаны многочисленные варианты иммуноферментных твердофазных или гомогенных методов анализа. Они основаны на специфической фиксации определенных антител или антигенов на нерастворимой основе с последующим тестированием связанного компонента с помощью индикационной системы - антитела (или антигена), ковалентно связанного с ферментом (Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М., 1991, - 286 с.). Однако реализация иммуноферментного метода требует индивидуальной специфичности конъюгатов для каждого типа антигенов и высокой степени их очистки, что снижает возможность их использования в широкой практике.

Известен также способ определения активности токсинов по уменьшению люминесценции бактерий после воздействия токсинами. Способ информативный, в некоторой степени инструментальный, но является недостаточно точным вследствие использования биологического компонента (Способ определения активности бактериальных токсинов, патент RU 2075081. Поляков В.М., Текутьев С.И., Андрусенко И.Т. и др., 1997).

В качестве ближайшего аналога определения биоцидной активности перекисных дезинфицирующих растворов к токсинам микробного происхождения выбран суспензионный способ, включающий "Способ" определения эффективности дезинфицирующих средств в отношении токсинов титрованием на лабораторных животных" (Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. - М.: Медицина, 1978, С.258-260).

Токсичность исследуемой пробы определяют путем титрования на белых беспородных мышах весом 18-20 г без банальной патологии. Для этого пробу разводят фосфатно-питательным буферным раствором с рН 6,5...6,7 десятикратным шагом. Каждое разведение вводят внутрибрюшинно 4 белым мышам по 0,5 мл каждой. Контролем служит прогретая 30 минут при 100°С опытная проба в аналогичных разведениях. За зараженными и контрольными животными наблюдают в течение 4-х суток, ежедневно регистрируя их гибель и отмечая появление симптомов, характерных для интоксикации ботулиническим нейротоксином (учащенное дыхание, полное расслабление мышц, западание мышц брюшной стенки - осиная талия, параличи конечностей). После получения результатов предварительного исследования определяют токсическую активность тем же способом, но при двухкратном шаге разведения пробы. Одновременно определяют концентрацию белка в пробе по методу Лоури (Loury О.Н.3 Farr A.R. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol.19. - P.265-275). Активность пробы выражают величиной ЛД₅₀ в мл^-1 с определением среднеквадратичного отклонения. Вычисляют так же удельную активность пробы ЛД ₅₀ в мл^-1 белка. Активность пробы (ЛД₅₀ ) рассчитывают по методу Кербера в модификации Ашмарина (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях - Л.: Медгиз, 1962). Продолжительность анализа по биологической пробе на лабораторных животных составляет от 7 до 8 суток.

Общим с заявленным способом является этап приготовления из исследуемого белкового препарата предварительных разведении необходимой кратности, режимы и способы дезинфекции, отбор проб для анализа.

К недостаткам данного метода следует отнести трудоемкость и сложность определения биоцидной активности дезинфицирующих перекисных растворов по биологической пробе на лабораторных животных, длительность и низкую точность определения вследствие использования не стандартизованных по чувствительности лабораторных животных.

Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего нетрудоемкое, экспрессное определение эффективности дезинфектантов в отношении ботулинического нейротоксина, представляющего собой глобулярный белковый комплекс, сформированный из нескольких субъединиц, на этапах разработки прописей дезинфицирующих композиций, режимов и технических средств их применения.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способа индикации биоцидной активности перекисных дезинфицирующих растворов предусмотрено использование:

в качестве объекта тестового воздействия, препаратов бактериальных белков, инициирующих льдообразование (БИЛ), регистрация биологической активности которых осуществляется по наличию в пробе центров нуклеации (ЦН) переохлажденной воды, формируемых белками этого типа;

методики капельного замораживания для количественного обнаружения ЦН в пробах, сущность которой заключается в подсчете относительного числа кристаллизующихся микрокапель серийных разведении исследуемых проб при определенной температуре переохлаждения и использовании известной зависимости концентрации ЦН от доли замерзающих микрокапель, подчиняющейся распределению Пуассона;

рациональной температуры анализа, находящейся в интервале от минус 7°С до минус 11°С, т.к. при этой температура чистая вода и разбавленные растворы солей, не содержащие гетерогенных ядер нуклеации, в микрокаплях сохраняются в переохлажденном состоянии продолжительное время;

миникриостата с регулируемой температурой (производства ОАО "Био-машприбор", г. Йошкар-Ола), сконструированного на основе элементов "Пельтье", обеспечивающих охлаждение и термостабилизацию рабочей поверхности с точностью 0,2°С в интервале температур от минус 1°С до минус 13°С;

активных штаммов-продуцентов белков, инициирующих льдообразование (БИЛ) - микроорганизмов Erwinia herbicola, штаммы №1211 и №1123 (также возможно использование Pseudomonas syringae, штамм 1567, Pseudomonas fluorescens штамм 1475) из Всероссийской коллекции микроорганизмов, продуцирующих в значительных количествах белковые комплексы класса С, инициирующие кристаллизацию переохлажденной воды при температуре от минус 7°С и ниже, представляющие собой глобулярные образования из нескольких субъединиц, имеющие молекулярную массу около 150 кДт и изоэлектрическую точку в кислой зоне рН, что аналогично ботулиническому нейротоксину (Виноградова И.Д., Уварова Р.Н., Иванов К.К. и др. Получение нейротоксина и гемаглютинина Clostridium botulinum типа А и характеристика нейротоксина // Биохимия. - 1983. - Т.4, вып.5 - С: 788-795; Burke M.J., Lindow S.E. Surface properties and size of the ice nucleation site in ice nucleattion active bacteria: Theoretical considerations // Cryobiology. - 1990 - Vol.- 27, №1. - Р.80-84). Другим доказательством подобия льдообразующих белков и белков ботулинического нейротоксина являются сопоставимые уровни энергии активации (Е_акт) и предэкспоненциального множителя (А) в уравнении Аррениуса (k=А_ехр(-Е_акт /RT), характеризующего термоустойчивость микроорганизмов. Так энергия активации и предэкспоненциальный множитель для Clostridium botulinum типа А равны 72 ккал×моль^-1 и 2×10 ³⁹ с^-1, а для Pseudomonas fluorescens 69 ккал×моль^-1 и 3×10⁴³ с^-1 соответственно (Мунблит В.Я., Тальрозе В.Л., Трофимов В.И. Термоинактивация микроорганизмов. - М.: Наука, 1985, - 247 с.).

Способ включает следующие этапы:

приготовление тест-объекта из белкового препарата;

проведение инактивации препарата перекисными дезинфектантами;

определение содержания ЦН в тест-объекте до и после воздействия дезинфицирующего раствора криоскопическим микрокапельным методом;

обработка результатов.

Способ выполняется следующим образом.

Для получения тест-препарата выращивают культуру продуцента, из которой выделяют БИЛ.

Выращивание микробов продуцентов осуществляется на поверхности плотной питательной среды, на основе ферментативного гидролизата мяса, содержащей аминный азот в количестве (110±10) мг %, имеющей концентрацию водородных ионов (7,2±0,2) ед. рН. Получение микробных культур производится при температуре (24±4)°С в течение 3 суток с последующим смывом колоний физиологическим раствором хлористого натрия.

Выделение БИЛ осуществляют путем разрушения клеток суспензии микроорганизмов встряхиванием со стеклянными бусами или обработкой ультразвуком. БИЛ выделяют из культуральной жидкости методом солевого осаждения в присутствии сульфата аммония при рН среды 3,5...5,5 ед. рН с последующим центрифугированием. На основе полученной белковой пасты готовят тест-препарат, соответствующий раствору ботулинического нейротоксина по содержанию белка, минеральных солей и кислотности.

Инактивацию белкового препарата исследуемыми дезинфицирующими растворами осуществляют суспензионным методом при соотношении препарата и дезинфицирующего средства 1:9 и экспозиции от 5 до 30 мин с периодическим встряхиванием.

Для регистрации ЦН в пробах проводят следующие операции:

по описанию, прилагаемому к криостату, подготавливают прибор к работе. Устанавливают рабочую температуру минус 7°С.

Разводящую жидкость - фосфатный буфер готовят на основе растворов солей однозамещенного и двузамещенного фосфорнокислого калия и дистиллированной воды. Концентрация водородных ионов (рН) должна находиться в пределах 7,3...7,6 ед. рН. Приготовленный буфер стерилизуется при 120°С в течение 30 минут. Стерильный буфер проверяют на наличие абиогенных центров нуклеации. Для этого буфер разливают в стерильные пробирки по 4...10 мл и замораживают в криостате при температуре минус (7...9)°С в течение 5 мин. Замерзшие при этой температуре пробирки отбраковывают.

Приготовление парафинированных кювет осуществляют из алюминиевой фольги и переплавленного парафина, растворенного в ксилоле или хлороформе в концентрации 3%. Кюветы готовят в виде круга диаметром 8...10 см с загнутыми краями и высотой бортов 5...10 мм. Раствор парафина наносится на поверхность кюветы с избытком. Излишек раствора сливают. Кювету подсушивают в течение 2...3 минут над пламенем спиртовки для испарения растворителя.

Стерильные мерные пробирки в количестве, необходимом для выполнения требуемых десятикратных разведений, заполняют 4,5 см³ фосфатного буфера. Исследуемую пробу тщательно перемешивают и 0.5 см ³ вносят в первую пробирку с фосфатным буфером. Дальнейшие разведения осуществляют десятикратным шагом. Анализу подвергают исходную пробу и все 5...8 десятикратных разведений.

Микропипеткой наносят на поверхность алюминиевой парафинированной кюветы по 20...40 капель (объемом 0,01 см³) (контролей фосфатного буфера и исследуемого дезинфицирующего раствора) и каждого анализируемого разведения. Кюветы устанавливают в криостат и визуально определяют количество замерзших капель в каждой кювете через три минуты с момента начала кристаллизации. Замерзание капель регистрируют по их помутнению. Изменяют температуру охлаждающей поверхности криостата и через 3 мин повторяют подсчет числа замерзших микрокапель.

При расчете концентрации центров нуклеации используют кюветы, в которых отмечено замерзание части нанесенных капель. Анализ считается зачетным, если в контролях (фосфатном буфере и исследуемом дезинфицирующем растворе) ЦН при выбранной температуре не регистрируются.

Расчет концентрации ЦН в пробах ведут следующим порядком.

Для каждого разведения пробы (i) по формулам 1 и 2 рассчитывают долю замерзших капель - эффект кристаллизации (f_i) и соответствующую этому эффекту концентрацию центров нуклеации (С_fi).

где: f_i - эффект кристаллизации, доля;

С_fi - концентрация центров нуклеации в исследуемой жидкости, ц.н. см^-3;

N_oi - общее количество зачетных капель исследуемого разведения на данной кювете;

N_3i - число замерзших капель исследуемого разведения на данной кювете;

d - степень разведения;

V - объем капли на кювете (0,01 см³).

На основе полученных значений методом наименьших квадратов рассчитывают концентрацию центров нуклеации, соответствующую 50 - процентному эффекту кристаллизации.

Статистическую обработку результатов параллельных определений выполняют в соответствии с общепринятыми нормами.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами показано в таблице 1.

Таблица 1 Сведения о причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами
Виды технического результата и их размеры	Показатели фактические или расчетные		Совокупность отличительных признаков, улучшающих показатели заявляемого объекта
	прототипа	заявляемого объекта
1	2	3	4
Средняя продолжительность определения биоцидного эффекта дезинфицирующего раствора в 10 пробах, час	96	2	Использование методики капельного замораживания микробных белков, имитирующих ботулинический нейротоксин, определяемых инструментальным методом, обеспечивающее экспрессное определение биоцидной активности перекисных дезинфектантов по сравнению с прототипом, где регистрация дезинфицирующего эффекта производится по биологической пробе на лабораторных животных.
1	2	3	4
Обеспечение безопасности работающего персонала при выполнении работ по проведению дезинфекции и регистрации ее эффективности (требуется/не требуется)	требуется	не требуется	Безопасность работающего персонала при работах с активными препаратами ботулинического нейротоксина обеспечивается соответствующими нормами и правилами работ с патогенными материалами 1-2 групп патогенности в соответствии с СП 1.2.011-94, проведением работ в лабораторных помещениях, оборудованных специальными инженерными системами биологической безопасности, и квалификацией персонала, что исключается при реализации предлагаемого способа индикации.
Ошибка определения эффективности дезинфекционного мероприятия, процент	>25	<10	Использование нестандартизованных лабораторных животных (белые мыши) не обеспечивает точность регистрации эффекта лучше 25% (допустимая биологическая погрешность), при 10% точности инструментального метода в предлагаемом способе индикации.
1	2	3	4
Среднее количество анализов определения биоцидного эффекта двумя лаборантами за рабочую смену, проб	10	40	Производительность анализов биоцидного эффекта у прототипа ниже за счет необходимости их выполнения в зонированных лабораториях и в средствах индивидуальной защиты, а также продолжительностью (96 часов) наблюдения за лабораторными животным для регистрации результатов, что исключает предлагаемый способ.

Предлагаемый способ индикации биоцидной активности перекисных дезинфицирующих растворов в отношении микробных токсинов имеет следующие преимущества перед прототипом:

сокращается продолжительность регистрации биоцидного эффекта дезраствора на льдообразующие белки, являющиеся биологическим имитатором ботулинического нейротоксина;

исключается опасность для персонала, выполняющего работы по проведению дезинфицирующих мероприятий и регистрации результатов;

повышается точность определения эффективности проводимой дезинфекции за счет исключения еще одного биологического фактора - использования лабораторных животных для определения остаточной токсичности и полноты дезинфекционных мероприятий;

существенно снижаются затраты на проведение исследований за счет исключения работ, требующих специальных мер защиты (зонированных лабораторий и вивариев, СИЗ кожных покровов и органов дыхания, специальной подготовки персонала и т.п.);

повышается производительность при использовании инструментального метода регистрации биоцидного эффекта перекисных дезинфектантов по активности биологических центров нуклеации.

Возможность осуществления предлагаемого способа показана на следующих примерах.

Пример 1. Оценка деструктивного действия 5%-ного раствора перекиси водорода на БИЛ бактерий Erwinia herbicola произведена в динамике при температурах регистрации эффекта кристаллизации минус 7°С и минус 11°С суспензионным методом.

Таблица 2 Деструктивное влияние перекиси водорода на БИЛ бактерий Erwinia herbicola штамм №1211
Время воздействия дезинфектанта, мин	Концентрация центров нуклеации при температуре минус... °С, цн·см-3
	7	11
0	4,7·10 4	5,4·10 5
5	3,1·102	5,1·10 4
15	0,1·101	2,6·103
30	0	1,5·10 2

Из представленных данных следует, что простой раствор перекиси водорода обладает некоторой деструктивной активностью в отношении изучаемых белков. Более крупные и лабильные белковые комплексы, регистрируемые при температуре минус 7°С, инактивируются за 30 мин. Стабильные белковые комплексы, регистрируемые при температуре минус 11°С, полностью не инактивируются. Остаточная их концентрация после 30-минутной экспозиции свидетельствует о том, что полней деструкции белков не наступает.

Пример 2. Оценка деструктивного действия активированного муравьиной кислотой раствора перекиси водорода на белки Erwinia herbicola штамм №1211 в тех же условиях, что и в примере 1.

Таблица 3 Деструктивное влияние активированного раствора перекиси водорода на БИЛ бактерий Erwinia herbicola штамм №1211
Время воздействия дезинфектанта, мин	Концентрация центров нуклеации при температуре минус... °С, цн·см-3
	7	11
0	5,1·10 3	5,8·105
5	2,0·101	3,1·103
15	0	1,4·101
30	0	0

Примечание. Состав дезинфицирующего раствора: перекиси водорода 5%, муравьиная кислота 1%, сульфонол 0,3%.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что деструктивная активность активированного раствора перекиси водорода существенно выше чем у ее простого раствора. Однако достижение полной деструкции белков достигается только после 15-минутной экспозиции, что свидетельствует о некоторой ненадежности используемого дезсредства для этих целей.

Пример 3. Оценка деструктивного действия 10%-ного раствора перекиси водорода с 35%-ным раствором этилового спирта на белки Erwinia sp. №16. Условия проведения опыта аналогичны примеру №1.

Воздействие спиртово-перекисного раствора испытанной концентрации вызывает полную деструкцию белков Erwinia herbicola штамм №1211 уже после 5-минутной экспозиции, что свидетельствует о получении высокого биоцидного эффекта действия испытанного раствора.

Таблица 4 Деструктивное влияние спиртово-перекисного раствора на БИЛ бактерий Erwinia herbicola штамм №1211
Время воздействия дезинфектанта, мин	Концентрация центров нуклеации при температуре минус... °С, цн·см-3
	7	11
0	5,5·103	6,3·105
5	0	0
15	0	0
30	0	0

Адекватность использования белков инициирующих льдообразование в качестве модели ботулинического нейротоксина для экспрессного определения эффективности дезинфектантов обусловлена результатами экспериментальных исследований их действия на нейротоксин. Исследования эффективности дезинфектантов на основе перекиси водорода показали, что полная инактивация ботулотоксина наблюдается в интервале от 5 до 30 минут. При этом установлено, что максимальную биоцидность проявляет 10%-ный раствор перекиси водорода с 35%-ным раствором этилового спирта, минимальную - раствор перекиси водорода, а раствор перекиси водорода, активированный муравьиной кислотой с добавлением сульфонола, занимает промежуточное положение. Эти результаты полностью согласуются с экспериментальными данными, полученными с использованием льдообразующих белков бактерий Erwinia herbicola штамм №1211 (таблицы 2, 3 и 4).

Также следует отметить, что действующая нормативная документация (Санитарно-эпидемиологические правила. Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности (опасности) - СП - 1.3.1285 - 03) предписывает для инактивации токсинов микробного происхождения использование дезинфицирующих растворов на основе перекиси водорода.