способ изготовления контрольной панели сывороток ay энд ad субтипов hbsag для контроля качества диагностики гепатита b

Формула изобретения

1. Способ изготовления контрольной панели сывороток AY & AD субтипов HBsAg для контроля диагностики гепатита В, включающий отбор донорских сывороток, не содержащих специфические антитела к основным маркерам вирусных инфекций, изготовление разводящих растворов на основе отобранных сывороток, разведение препарата HBsAg в разводящем растворе, проведение теста термодеградации для установления сроков годности панели, отличающийся тем, что отбор разводящих сывороток проводят путем анализа донорских сывороток методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции на наличие ДНК вируса гепатита В, анти HBs антител, неспецифичного связывания HBsAg, причем в качестве разводящих сывороток выбирают сыворотки с отрицательным результатом в данных методах, титрование препаратов HBsAg осуществляют в разводящем стабилизированном растворе до требуемой концентрации HBsAg (0,1-2 МЕ/мл) AD & AY субтипов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве препарата HBsAg используют плазменные очищенные и/или рекомбинантные антигены, принадлежащие к различным субтипам HBsAg и содержащие не менее 95% основного белка, причем каждый положительный образец панели в жидком состоянии имеет вязкость, равную средней вязкости пула сывороток здоровых доноров.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для формирования контрольной панели изготовляют 10 образцов с концентрацией HBsAg от 2 до 0,1 МЕ/мл, в том числе 5 образцов AY субтипа, приготовленных на основе плазменного очищенного антигена, и 5 образцов AD субтипа, приготовленных на основе плазменного (или рекомбинантного) антигена, содержащих не менее 95% искомого белка и 4 отрицательных образца.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что приготовленные образцы контрольной панели лиофильно высушивают до остаточной влажности не более 1,5 мас.%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления контрольных панелей сывороток, содержащих антигены наиболее опасных вирусных инфекций.

Образцы крови доноров в России обязательно скринируют на присутствие HBsAg, анти-HIV 1+2, анти-HCV и сифилиса антител. Приблизительно 1% всех образцов посылается на повторное подтверждение в контрольные лаборатории. Однако эффективность подтверждения результатов зависит не только от качества тест-систем, но и от наличия в контрольных лабораториях стандартных препаратов на анализируемые инфекционные маркеры [1, 2].

При использовании высокочувствительных HBsAg скриннинговых тестов носители гепатита В с низкой концентрацией HBsAg могут быть выявлены, в частности, среди лиц, которые являются носителями анти-Hbc антител.

Использование в каждодневной работе референс-препаратов различных субтипов HBsAg позволит расширить спектр диагностируемых маркеров и использовать эти материалы для контроля качества выполнения анализов препаратов крови на выявление маркеров гепатита В.

Для того чтобы решать такие проблемы, разработан способ изготовления и способ аттестации сывороток крови человека, содержащих оба основных субтипа HBsAg в концентрации выше 0.1 МЕ/мл.

Из литературы известны способы изготовления панелей сывороток Boston Biomedical Inc. (США): Hepatitis В Surface Antigen Proficiency Panel (PHA 806). Панель включает 10-12 сывороток с концентрацией HBgAg от 2,5 нг/мл до 0,1 нг/мл и 1 отрицательную сыворотку.

Однако эти панели не утверждены в качестве референс-препарата США и предназначены для использования только во внутрилабораторных исследованиях. Кроме того, сыворотки, входящие в состав этих панелей, представлены в жидкой форме и поэтому должны храниться в замороженном состоянии [3].

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ приготовления панелей сывороток, разработанный в лаборатории стандартов Красного Креста (Голландия) для приготовления контрольных панелей Pelicheck и Pelispy run controls. Эти панели представляют собой образцы препаратов AY и AD субтипов HBsAg, разведенных в пуле донорских сывороток, не содержащих маркеров других вирусных инфекций. Способ включает приготовление стандартных сывороток, содержащих HBsAg и имеющих разную концентрацию этого белка. Основными этапами изготовления стандартных сывороток являются:

- выбор очищенных препаратов HBsAg, не содержащих посторонних белков;

- сбор донорских сывороток, не содержащих анти-HBs антитела и маркеры вирусных инфекций;

- изготовление разводящего раствора (PP) из пула отобранных донорских сывороток;

- разведение препаратов HBsAg в РР до требуемой концентрации.

Основные недостатки прототипа;

- образцы панели "Pelicheck" не аттестованы количественно по концентрации HBsAg, и изготовители не гарантируют воспроизводимости получаемых при анализе результатов. Для другого пула сывороток этим же разведениям будут отвечать другие концентрации HBsAg;

- сыворотки панели-прототипа не стабилизированы и не лиофилизированы. Рассылка и хранение панелей требуют строгого соблюдения низкотемпературных режимов [3];

- эти панели сывороток не аттестуют по значениям концентрации HBsAg, что значительно снижает их метрологическое назначение.

Задачей данного изобретения является создания такого способа, который обеспечивал бы изготовление образцов контрольной панели с аттестованной концентрацией различных субтипов HBsAg от 2 МЕ/мл до 0,1 МЕ/мл и позволил бы сохранить специфические характеристики этих образцов в течение длительного времени (не менее 2 лет) при хранении их при (2-6)°С.

Поставленная задача решается тем, что используют способ изготовления контрольных панелей сывороток, содержащих HBsAg для контроля производства тест-систем и контроля качества лабораторных исследований при диагностике гепатита В, включающий отбор донорских сывороток, не содержащих специфические антитела к основным маркерам вирусных инфекций, изготовление разводящих растворов на основе отобранных сывороток, приготовление рабочего стандарта HBsAg в разводящем растворе, проведение ускоренного теста, термодеградации для установления сроков годности панели и, согласно изобретению, отбор разводящих сывороток проводят путем анализа донорских сывороток методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции на наличие ДНК вируса гепатита В, анти-HBs антител, неспецифичного связывания HBsAg, причем в качестве разводящих сывороток выбирают сыворотки с отрицательным результатом в данных методах. Проводят титрование образцов HBsAg в разводящем стабилизированном растворе до требуемой концентрации HBsAg (2,0-0,1 МЕ/мл), с величиной оптической плотности меньше критической (в диапазоне 0,5-0,8 ОП крит), В качестве препаратов HBsAg используют плазменный очищенный и/или рекомбинантный антигены различных субтипов HBsAg, содержащие не менее 95% основного белка. В пуп разводящих сывороток для изготовления стандартной панели вводят стабилизатор. Каждый положительный образец панели в жидком состоянии имеет вязкость, равную средней вязкости пула сывороток здоровых доноров. Отрицательные образцы панели представлены сыворотками доноров и лиц из групп риска. Вязкость их не корректировалась.

Для формирования контрольной панели изготовляют 10 образцов с концентрацией HBsAg от 2 МЕ/мл до 0.1 МЕ/мл, в том числе 5 образцов AY субтипа, приготовленных на основе плазменного очищенного антигена, и 5 образцов AD субтипа, приготовленных на основе плазменного и/или рекомбинантного антигенов, содержащих не менее 95% искомого белка, и 4 отрицательных образца, приготовленных из сывороток здоровых доноров. Приготовленные образцы контрольной панели лиофильно высушивают до остаточной влажности не более 1,5 масс.%.

Такая модель выбрана на основании следующих предпосылок. Известно, что при растворении инфекционного маркера в нормальной человеческой сыворотке (НЧС) происходит неспецифическое связывание искомого маркера, обуславливающее снижение аналитического сигнала HBsAg относительно величины этого сигнала, полученного при растворении маркера в буферном растворе. Поэтому для приготовления контрольной панели выбираются сыворотки, которые демонстрируют различный уровень неспецифического связывания. Это, с одной стороны, усредняет наблюдаемые эффекты снижения уровня ИФА сигнала и, с другой стороны, позволяет проанализировать уровень специфичности различных скриннинговых и подтверждающих тест-систем. Более того, положительные образцы панели AY и AD субтипов HBsAg приготавливают растворением одинакового количества AY и AD препаратов HBsAg в пулах НЧС и в фетальной сыворотке крупного рогатого скота (ФБС). В соответствии с требованиями приказа МЗ РФ приготавливают образцы панели с концентрацией HBsAg в диапазоне 0,1-2,0 МЕ/мл для обоих субтипов.

Лучшие российские тест-системы имеют чувствительность 0.1-0,3 МЕ/мл, но только для AY субтипа HBsAg. Зачастую чувствительность тестов к AD субтипу, обычно, не превышает 0.5 МЕ/мл.

Для установления связи между величиной аналитического сигнала ИФА и количеством HBsAg в разводящем растворе необходимо использовать ИФА тест-системы, которые в диапазоне от 3 до 0.2 МЕ/мл сохраняют прямолинейную связь между оптической плотностью и титром раствора HBsAg..

Поэтому решение проблемы аттестации образцов панели по концентрации HBsAg следует проводить в следующих направлениях:

1) использовать для создания образцов контрольной панели концентрированные препараты плазменного или рекомбинантного антигенов с содержанием HBsAg не менее 95%;

2) в качестве разводящего раствора использовать стабилизированный пул сывороток нормальной человеческой крови, которые не содержат маркеров основных инфекций.

Предлагаемая нами модель контрольной панели HBsAg предназначена:

- для контроля чувствительности, специфичности и сроков годности тест-систем при их производстве;

- для контроля профессионального уровня работников диагностических лабораторий.

Таким образом, полный набор контрольной панели должен включать 14 образцов: 4 образца пулов донорских сывороток, 5 образцов ау субтипа и 5 - ad субтипа HbsAg, приготовленных титрованием определенного количества соответственно ad или ау препарата HBsAg в разводящей сыворотке.

Основные этапы приготовления плазменных препаратов HBsAg следующие. Реактивные сыворотки перерабатывают с целью очистки от частиц Дейна для инактивации вируса гепатита В и концентрирования раствора HBsAg. В процессах разделения и концентрирования белков выделяют фракции с содержанием HBsAg выше 95% в соответствии с данными электрофореза, В процессе концентрирования HBsAg проводят обработку сывороток трипсином, фильтрование через 0.45 мкм и 0.22 мкм фильтры, скоростное центрифугирование и концентрирование. Полученный продукт под названием "очищенный плазменный HBs-антиген" аттестуют на содержание белка и активность взаимодействия с анти-HBs антителами.

Рекомбинантные полнокопийные препараты HBsAg являются высокоочищенными препаратами и содержат около 99% основного белка.

Для установления взаимосвязи между аналитическим сигналом ИФА и массовой концентрацией HBsAg в растворе необходимо:

- изучить и привести в соответствие фракционно-дисперсный состав (ФДС) первичного стандарта и тестируемого препарата;

- использовать ИФА тест-системы, которые в диапазоне от 3 МЕ/мл до 0.2 МЕ/мл демонстрируют прямолинейную связь между оптической плотностью и количеством HBsAg в растворе.

Следует отметить, что в литературе мало уделено внимания связи между ФДС препарата и величиной аналитического сигнала. Для наглядности можно сравнить результаты титрования препаратов в ИФА и иммуноблотинге. Например, мы сравниваем величины титров «ау» плазменного препарата HBsAg, изображенного на электронной фотографии (фиг.2). Как следует из анализа дисперсности, ау препарат представлен в форме отдельных молекул диаметром 6-7 им, сферических частиц диаметром 20-22 нм и фрагментов частиц диаметром 12-15 нм. ФДС препарата в РР представлен на графике. Именно в форме таких частиц препарат будет связываться первичными антителами в лунках иммунопланшета ИФА. Для проведения иммуноблотинга все частицы HBsAg необходимо перевести в молекулярную форму диаметром 6-7 нм для проведения электрофоретического разделения протеинов. Очевидно, что число молекул будет значительно больше числа частиц в исходном препарате и, следовательно, физический титр HBsAg в иммуноблоте будет в несколько раз выше, чем в ИФА.

Из приведенного примера следует, что для аттестации массовой концентрации препарата HBsAg в образцах стандартной панели необходимо подбирать первичный стандарт с идентичным ФДС. Различие ФДС референс-препаратов может объяснить тот факт, что коэффициент пропорциональности между Международными Единицами (МЕ) и нг для панелей компании BBI (Бостон, США) равен 10, а коэффициент пропорциональности для европейских HBsAg панелей равен 4-5. Для оценки ФДС препаратов HBsAg, использованных при изготовлении образцов контрольной панели, используют методы электронной микроскопии и атомной силовой микроскопии.

Важной проблемой при использовании HBsAg тест-систем в клинических диагностических лабораториях является правильность результатов анализа. Основным критерием правильности результатов серологического анализа служит аттестованное значение аналитического сигнала (например, ОП в ИФА) для каждого образца контрольной панели.

Вопрос о сохранении специфических свойств сывороток панели, содержащих IgG-антитела, решен в [4]. В настоящем изобретении для сохранения вязкости образцов сывороток для стабилизации уровня HbsAg предлагается использовать бактерицидные компоненты с добавлением антибиотиков.

Низкая вязкость раствора стабилизатора для контрольной панели является критичным параметром для выявления HBsAg на практике, т.к. многие производители тест-системы стараются сократить время анализа. В этих условиях большое значение приобретает снижение диффузионного торможения процесса взаимодействия МКА + HBsAg, обусловленное, в первую очередь, уменьшением вязкости раствора.

Применимость созданных по настоящему изобретению референс-препаратов - сывороток с нормированным уровнем HBsAg - была подтверждена при анализе панелей в научных лабораториях и в контрольных лабораториях службы предприятий-производителей тест-систем в соответствии с программой их аттестации, разработанной национальным органом контроля РФ - ГИСК им. Л.А.Тарасовича. По результатам, представленным аналитическими лабораториями - участниками, будут окончательно установлены аттестованные значения концентраций HBsAg в образцах панели.

Таким образом, процедура аттестации сывороток панели включает три этапа, результаты которых независимы и позволяют надежно идентифицировать HBsAg. Сравнение контрольных панелей, приготовленных в соответствии с заявляемым способом, с панелями-прототипом того же назначения, показало, что отличная от прототипа совокупность существенных признаков обеспечивает новое ранее неизвестное свойство: возможность изготовления контрольных панелей в лиофильной форме с аттестованной концентрацией различных субтипов HBsAg, что позволяет оценивать чувствительность тест-систем и специфичность к различным субтипам HBsAg и контролировать уровень профессионального мастерства работников клинических диагностических лабораторий.

Фиг.1 - результаты теста подавления HBsAg в сыворотках донорской крови.

Фиг.2 - гистограмма распределения по размерам (ФДС) частиц AY препарата HBsAg.

Фиг.3 - средневзвешенная кривая титрования AY препарата HBsAg.

Пример выполнения способа.

Приготовление пулов сывороток. Отбор донорских сывороток проводят в несколько этапов:

а) Отбор сывороток, не содержащих антитела к ВИЧ, вирусам гепатита В и С, сифилису; каждую из 69 сывороток анализируют на присутствие ДНК ВГВ. Результаты анализа ДНК ВГВ для всех донорских сывороток отрицательные.

б) Контроль донорских сывороток, предназначенных для разведения HBsAg препаратов, на содержание общего белка (норма 6.5-8.5%).

в) Определение уровня неспецифического связывания HBsAg в тестируемых сыворотках.

Донорские сыворотки, отобранные после проведения 3-х этапов, объединяются в пул. В пул вносят стабилизатор в сухой форме, компоненты которого не оказывают подавляющего эффекта на аналитический сигнал HbsAg.

Приготовление разводящего раствора проводится в соответствии с [4].

В качестве PP для получения положительных образцов панели с определенной концентрацией HBsAg в работе используют стабилизированные донорские сыворотки, не содержащие маркеров вирусных инфекций. Сыворотки готовят сразу после забора крови. Центрифугируют со скоростью 1800-2000g при комнатной температуре в течение 15 мин и декантируют надосадочный раствор. Хранят до использования при 2-4°C. Для приготовления панели отбирают образцы сывороток янтарного цвета, прозрачные на свету. Всего отобрана 61 качественная сыворотка.

После приготовления все сыворотки анализируют на анти-HBs антитела и вирусную контаминацию. Было обнаружено 9 сывороток, содержащих антитела, они были забракованы.

На следующем этапе ставят тест на подавление. С этой целью отбирают аликвоты по 1 мл от каждого номера сыворотки и вводят в них одинаковое количество HBsAg, рассчитанное на конечную концентрацию 2 МЕ/мл и 1 МЕ/мл в сыворотке (фиг.1). Как следует из фиг.1 почти каждая сыворотка неспецифически взаимодействует с HbsAg в большей или меньшей степени. Для приготовления панели отбирают сыворотки с уровнем неспецифического взаимодействия менее 15%. Из отобранных сывороток готовят пул объемом до 3 литров.

Каждый пул доводят до рН 6,8-7,1 с помощью 0,1 М NaCl. В качестве бактерицидной добавки вводят мертиолят в количестве 0,01% и гентамицин 0,2% от массы раствора. Полученный раствор служит РР для приготовления контрольной панели. РР разливают в емкости по 250-500 см ³ и используют сразу или хранят при температуре (2-8)°C в течение не более 1 месяца.

Приготовление рабочих стандартов (PC).

На основе РР готовят и аттестуют PC АУ & AD субтипов антигена. Под рабочим стандартом понимают раствор HBsAg того или иного субтипа в РР, оттитрованный относительно международного стандарта в диапазоне концентраций 3-5 МЕ/мл. Для приготовления больших объемов PC используют плазменные очищенные антигены:

- антиген AY субтипа производства НПК Иммуноген (Н.Н.),

- антиген AD субтипа GeneDiagnostics Lab's (Singapore).

PC используют на стадии титрования препаратов HBsAg для оценки их концентрации в качестве референс-препаратов.

Приготовление положительных образцов стандартной панели. Каждый положительный образец панели в жидком состоянии имеет вязкость, равную средней вязкости пула сывороток здоровых доноров, Отрицательные образцы панели представлены сыворотками доноров и лиц из групп риска. Вязкость их не корректировалась.

Для приготовления 5 образцов стандартной панели AY субтипа используют плазменный очищенный HBsAg субтипа AY (НПК «Препарат», г. Н.Новгород) и РР.

С этой целью препарат оттитровывают в ФСБК (50 mM фосфатно-солевой буфер с добавкой 0.2% казеина) с помощью различных ИФА тест-систем. Методом матстатистики из отдельных кривых титрования строят средневзвешенную кривую (фиг.3). По усредненной кривой определяют, какое количество препарата HBsAg необходимо ввести в РР, чтобы конечная концентрация антигена соответствовала 3,0 МЕ/мл. В нашем примере 500 мкл плазменного препарата AY субтипа вводят в 500 мл PP, что соответствует расчетной концентрации образцов AY субтипа 3,0 МЕ/мл в ФБС.

Для приготовления 5 образцов контрольной панели AD субтипа используют плазменный антиген Adw субтипа компании GeneDiagnostics Lab's (Singapore) или рекомбинантный HBsAg субтипа ATdw, полученный из вакцины H-B-VAX-II (Merck, Шарп и Доум, Голландия) методом экстракции в ФСБ. Аналогично готовят 5 образцов AY субтипа. С этой целью к 500 мл РР добавляют по 500 мкл. Это соответствует расчетной концентрации образцов AY субтипа 3,0 МБ/мл в ФБС.

Приготовление остальных образцов HBsAg AD & AY субтипов проводят методом кратного разведения в РР до концентраций 1,0 МЕ/мл; 0,5 МЕ/мл; 0,25 МЕ/мл и 0,1 МЕ/мл. Таким образом готовят по 5 образцов панели AY & AD субтипов с концентрацией 3,0 МЕ/мл; 1,0 МЕ/мл; 0,5 МЕ/мл; 0,25 МЕ/мл; и 0,1 МЕ/мл - всего 10 положительных образцов контрольной панели.

На последнем этапе все образцы панели фильтруют через фильтры 0,8 и 0,45 мкм.

Определение ОП сывороток всех номеров проводят в ИФА тест-системах различного формата российского и иностранного производства относительно PC обоих субтипов.

Профильтрованные образцы стандартной панели разливают в ламинарном шкафу по 0.8 мл во флаконы объемом 3 мл, закрывают резиновыми пробками и размещают в металлические кассеты для замораживания. Замораживание препарата во флаконах проводят при температуре прилавка - 50-60°С в течение 10-12 ч. Замороженные образцы во флаконах переносят в сублимационную камеру лиофильной установки TG-50, полки которой охлаждены до минус 30°С. Температуру препарата на стадии сублимационного обезвоживания поддерживают ниже температуры его стеклования (-30°С). Включают компрессор установки для охлаждения десублиматора и полок сушильной камеры. На каждую из пяти полок помещают по кассете с флаконами, в один из которых вморожен датчик измерения температуры материала. Заданная температура на всем протяжении сушки поддерживается автоматически с погрешностью 2-4°С. Значения температуры каждой полки, температуру материала на каждой полке, а также температуры сублиматора записываются постоянно самописцем КП-35.

Через 24 ч после установления на полках температуры +10°С поднимают эадатчиком РП-32 температуру досушивания материала до 27°С. Выдерживают при этой температуре материал в течение 6-8 ч. Средняя скорость нагревания материала на этапе досушивания составляет 6°С/мин, время термостатирования при 27°С составляет 10 ч. Флаконы с препаратом укупоривают под вакуумом. Контроль окончания процесса сушки осуществляют по показаниям датчика остаточного давления. Лиофильно высушенный препарат имеет остаточное содержание воды около 1,0-2,0 мас.%. Определение проводят по методике [5]. Общее среднее время сушки составляет 32 ч.

Для проведения испытаний срока годности изготовленные препараты помещают в термостат при температуре 40°С. Специфическую активность образцов контролируют 1 раз в неделю.

На основании полученных результатов по термодеградации проводят оценку срока годности препаратов с аттестованной концентрацией HBsAg по стандартной методике ВОЗ [6]. Для хранения препаратов при температуре 40°С срок годности вычисляют:

t=4.0 нед.·30=120 нед.

Таким образом, с помощью теста термодеградации определяют срок годности панели - более 2-х лет.

Экономическая эффективность применения предлагаемого способа изготовления HbsAg образцов панели заключается в том, что указанные антигены используются как прогностические маркеры гепатита В. Они циркулируют в крови инфицированных на 2-3 недели раньше, чем появляются антитела. Именно сокращение сроков установления диагнозов для инфицированных пациентов и более ранняя медицинская помощь и контролируемое по количеству HbsAg лечение составляют социально-значимую и экономическую эффективность, связанные с сокращением сроков лечения и сроков трудовой недееспособности людей.

Кроме того, введение в практику серологии контрольной панели с аттестованной концентрацией HBsAg AY и AD субтипов создают основу для контроля качества диагностики, на содержание этих маркеров в крови и тем самым составляют юридическую основу для разрешения конфликтов между производителями и пользователями HBsAg тест-систем.

Введение российской контрольной панели значительно уменьшит расходы средств контрольных организаций здравоохранения на приобретение дорогостоящих заграничных аналогов.

Литература

1. Fields Н.А., David C.I., BrADley D, W. and MAYnard J.E. Experimental conditions affecting the sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assAY (ELISA) for detection of hepatitis В surface antigen (HBsAg). // Bulletin of the World Health Organization, 1983, v.61, 1, p.135-142.

2. Канев А.Н., Воробьева М.С., Шалунова Н.В. и др. Конструирование и производство референс-панелей сывороток для контроля качества тест-систем в России. // Вестник АМН 1998, №3.

3. Информационный бюллетень фирмы Boston Biomedica Inc., 1994, р.12.

4. Б.А.Гутова, А.Н.Канев, Е.Ю.Шалаев. Стабилизирующий состав для контрольных сывороток, положительных на антитела к вирусным и микробным антигенам. Патент РФ №2011202, 1993.

5. Вараксин Н.А., Аборнева И.В., Рябичева Т.Г. и др. Изучение условий гидролиза желатина с целью разработки защитных сред для лиофилизации биопрепаратов, // Биотехнология 2000, 2, 14-23.

6. Kirkwood, T.B.L. Принципы приготовления и утверждения международных и других стандартов и эталонных материалов биологических препаратов, Сер. техн. докл. N 37. ВОЗ, Женева, 1990. 14а // J. biol. Standardization. - 1984. - Vol.12. - P.207-224.