6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид и фармацевтическая композиция на его основе

Формула изобретения

1. 6-Алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид общей формулы (I)

где R является алкилом с 1-4 атомами углерода.

2. Гидрохлорид по п.1, проявляющий антимикобактериальную и иммунотропную активность.

3. Фармацевтическая композиция, обладающая антимикобактериальной и иммунотропной активностью, включающая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид общей формулы (I) по п.1 в эффективном количестве.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биологическиактивных веществ, в частности к 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлоридам, которые обладают антимикобактериальной и иммунотропной активностью и могут быть использованы в качестве иммуномодулятора и антимикобактериальных средств, а также к фармацевтической композиции на их основе.

Известны щелочные соли N-(6-алкил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида формулы (А) (Изодинафон)

где R является алкилом с 1-4 атомами углерода и М является щелочным металлом, обладающие аналогичной активностью с токсичностью 7000 мг/кг (см. международную заявку на патент WO 01/32650). Однако их активность не достаточно высока (см. нижеследующие таблицы).

Известен также N-(6-метил-2.4-диоксо-1.2.3.4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N-изоникотиноилгидразид гидрат (В), обладающий антимикобактериальной и иммуномодулирующей активностями (патент RU 2141322). Однако данное соединение (В) не растворяется в воде, физрастворе и других растворителях, имеет плохую растворимость в биологических жидкостях, что свидетельствуют о его низкой биологической активности, невысокой биодоступности.

В основу изобретения положена задача - изыскание новых близких по структуре соединений, обладающих более высокой активностью.

Задача решается предложенными 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфо-гидразоил)урацилгидрохлоридами общей формулы (I)

где R является алкилом с 1-4 атомами углерода.

6-Метил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид формулы (I) представляют собой мелкокристаллический порошок от белого до кремового цвета с температурой плавления Тпл= 253-254°С.

Предложенные соединения получают путем взаимодействия гидразида изоникотиновой кислоты с 6-метилурацил-5-сульфохлоридом в растворителе.

Соединения формулы (I) обладают антимикобактериальной и иммунотропной активностью.

Задача также решается предложенной фармацевтической композицией, обладающей антимикобактериальной и иммунотропной активностью, включающей активное вещество и целевые добавки, отличие которой состоит в том, что в качестве активного вещества она содержит 6-алкил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацилгидрохлорид общей формулы (I) в эффективном количестве.

Дозировка зависит от возраста, состояния и веса пациента, а также от вида введения. Согласно изобретению, предлагаемая фармацевтическая композиция содержит активного вещества в количестве от 0,1 до 4 г.

Токсичность предложенных соединений была определена на белых беспородных мышах весом 18-20 г в остром опыте по методу Литчфильда-Уилкоксона и составила более 7000 мг/кг.

Заявленные соединения были испытаны в экспериментах на животных.

Определение иммунотропной активности предложенного гидрохлорида

а) Влияние на гуморальный иммунитет изучали с помощью метода локального гемолиза в геле. Мышей гибридов F1 (СВА × С₅₇BI₆) иммунизировали эритроцитами барана в дозе 5×10⁶ и сразу после этого вводили изучаемые вещества как перорально в крахмальной суспензии, так и парентерально. На 5-е сутки подсчитывали количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей и определяли индекс стимуляции иммунного ответа по отношению число АОК в опытной группе к числу АОК в контрольной группе.

Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1. Влияние исследуемых соединений на накопление антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей (различие достоверно (р меньше 0,01) по отношению к норме).
Название препарата	Способ введения	Доза м кг/мышь	Количество АОК в селезенке	Кол-во животных	Индекс стимуляции иммунного ответа
Контроль	перорально	0,5 мл крахм. суспензии	500±50	12	1,0
Гидрохлорид	перорально	500	2850±150	12	5,3±0,5
Изодинафон	перорально	500	2360±250	12	4,6±0,7
Контроль	парентерально	0,2 мл физиол. раствора	510±50	12	1,0
Гидрохлорид	парентерально	100	1800±100	12	403±0,6
Изодинафон	парентерально	100	1650±280	12	3,20±0,6

Индексы стимуляции иммунного ответа гидрохлорида и изодинафона при введении препаратов внутрь достоверно неразличимы между собой. Это говорит о том, что исследуемые препараты обладают близким действием на гуморальный иммунитет, тестируемый в реакции накопления АОК в селезенке мышей.

б) Влияние исследуемых препаратов на пролиферацию Т-лимфоцитов изучали на модели in vitro. Для этого проводили предварительную 3-х часовую инкубацию мононуклеарных клеток человека в присутствии различных концентраций каждого исследуемого вещества. Изучали широкий диапазон концентраций каждого исследуемого вещества: от 0,01 до 5 мкг/л. В качестве негативного контроля добавляли физиологический раствор 0,9% NaCI.

Результаты влияния новых соединений на интенсивность пролиферации Т-лимфоцитов человека в культуре клеток in vitro представлены в таблице 2.

Таблица 2. Влияние гидрохлорида на пролиферацию Т-лимфоцитов в культуре in vitro.
Препарат	Доза, мкг/мл	Интенсивность включения 3Н-тимидинов ДНК культивируемых клеток (импульс/мин)
		Спонтанная	Активированная ФГА
Физраствор		800	20002
Гидрохлорид	5	900	20132
	1	1275	25400
	0,1	1301	38000
	0,03	1980	31150
	0,01	1530	29990
Изодинафон	5	620	19142
	1	812	22068
	0,1	1144	28145
	0,03	1762	34284
	0,01	1496	29586

Таким образом, предлагаемый гидрохлорид также как и изодинафон обладает как собственной митогенной активностью, так и в ответ на фитогемагглютинин, но проявляет эту активность при добавлении в меньшей дозе.

в) Влияние исследуемых препаратов на фагоцитарную активность макрофагов изучали по клиренсу туши в крови, взятой из ретроорбитального синуса мышей, получавших препараты перорально. Результаты оценивали по фагоцитарному индексу (таблица 3).

Таблица 3. Влияние исследуемых препаратов на фагоцитарную активность макрофагов (различие достоверно (р меньше 0,01) по отношению к норме).
Препарат	Способ введения	Доза, мкг/мышь	Фагоцитарный индекс	Кол-во животных
Крахмальная сусп.	перорально	0,5 мл	4,2±0,06	12
Гидрохлорид	перорально	500	7,1±0,03	12
Изодинафон	перорально	500	6,64±0,12	12
Физраствор	парентерал.	0,2 мл	4,1±0,07	12
Гидрохлорид	парентерал.	100	7,5±0,06	12
Изодинафон	парентерал.	100	7,12±0,09	12

Результаты, приведенные в таблице, говорят о том, что гидрохлорид стимулирует фагоцитарную активность макрофагов в большей степени, чем изодинафон при любом способе введения.

г) Иммунокорригирующая способность гидрохлорида была определена на модели иммунодефицита, вызванного облучением мышей F₁ (СВА х С₅₇BI₆) в дозе 4 Грэя.

Показано, что облучение мышей в дозе 4 Грэя уменьшает иммунный ответ в 15-20 раз, его восстановление начинается на 6-8 сутки и заканчивается к 30 суткам (Ярилин А.А., Полушкина Э.Ф., Филатов П.П. Действие ионизирующей радиации на соотношение популяций лимфоидных клеток у мышей, Радиобиология, 1976 г., т. 16, №3, стр. 451-454). При использовании этой модели подопытным животным вводили испытуемые препараты в дозах 500 мкг/мышь перорально в 0,5 мл крахмальной суспензии и 100 мкг/мышь парентерально в 0,2 мл физраствора. Препараты вводили трижды на 6,7,8 сутки после облучения. Контрольная группа животных получала 0,5 мл крахмальной суспензии или 0,2 мл физраствора. На 15 сутки у этих животных определяли количество АОК в селезенке методом локального гемолиза в геле.

Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4. Влияние гидрохлорида на восстановление процесса формирования антителообразующих клеток селезенки у облученных животных.
Препарат	Способ введения	Дозы мкг/мышь	Кол-во животных	АОК на селезенку	Индекс стимуляции
Облученный контроль			12	309±36
Гидрохлорид	Перорально	500	12	1080±39	3,5±0,4
Изодинафон	Перорально	500	12	995±12	3,2±0,5
Контроль физ. раствор	Парентерально	0,2 мл	12	312±40
Гидрохлорид	Парентерально	100	12	1200±54	4,0±0,2
Изодинафон	Парентерально	100	12	1074±12 8	3,5±0,5

На основании полученных данных по восстановлению иммунного ответа после облучения можно сделать вывод, что гидрохлорид проявляет большую иммунокорригирующую активность чем у препаратов сравнения.

Определение противотуберкулезной активности гидрохлорида.

Активность проверялась в сравнении с изодинафоном. Для заражения использовались лабораторные штаммы микобактерий туберкулеза Н₃₇RV обычный и тубазидоустойчивый до 100 мг. 230 мышей линии СВА заражали внутривенно 0,25 мг культуры микробактерий туберкулеза в 0,5 мл физраствора. Опыт продолжался 2 месяца. Под наблюдением находилось 20 групп животных по 15 мышей в каждой группе, все животные содержались в одинаковых условиях вивария на стандартном рационе. Контрольные группы получали в течение всего опыта через зонд 5 раз в неделю 0,5 мл крахмальной суспензии или 0,2 мл физраствора парентерально. Опытные группы животных получали препараты перорально в различных дозах в 0,5 мл крахмальной суспензии или в 0,2 мл физраствора парентерально. Все животные, как павшие, так и забитые, по окончании опыта взвешивались, также взвешивались их внутренние органы, определялась степень поражения внутренних органов, оцениваемая в «+», кроме этого о действии препарата судили по средней продолжительности жизни (СПЖ).

Результаты экспериментов приведены в таблице 5.

Таблица 5. Влияние исследуемых веществ на противотуберкулезную активность.
Препараты, дозы, способ введения	Н37RV			H 37RV-тубазидоустойчивость
	СПЖ, сутки	Вес легкого, мг	Индекс поражения	СПЖ, сутки	Вес легкого, мг	Индекс поражения
Контроль 0,5 мл крах.	24,2	619,2	2,48	23,8	632,4	2,42
суспензии перорально	±2,7	±50,4	±0,22	±0,22	±70,2	±0,19
Гидрохлорид 100	3,5	500±	105	37,3	450,5	1,7
мкг/мышь перорально	±5,0	51,2	±0,13	±3,8	±51,7	±0,2
Изодинафон 100	33,4	526,1	2,01	32,4	492,8	1,96
мкг/мышь перорально	±5,1	±47,2	±0,12	±3,5	±63,4	±0,21
Контроль 0,2 мл	22,8	628,3	2,52	24,1	648,2	2,72
физраствора парентерально	±2,2	±61,4	±0,21	±4,0	±71,4	±0,21
Гидрохлорид	31,2	530	1,7	33,4	590,3	1,9
50 мкг/мышь парентерально	±2,1	±21,5	±0,03	±3,2	±75,5	±0,1
Изодинафон	30,5	580,2±	1,80	31,6	607,8	2,03
50 мкг/мышь парентерально	±4,6	46,2	±0,09*	±3,1	±59,2	±0,21*
* Величины, достоверно отличающиеся от контроля, Р<0,05

Вышеизложенные результаты показывают, гидрохлорид обладает выраженным противотуберкулезным действием как на микобактерии, чувствительные к большинству противотуберкулезных препаратов, так и на микобактерии, резистентные к тубазиду. Судя по индексу поражения легких, зараженных животных, противотуберкулезная активность гидрохлорида проявляется в большей степени, чем у препаратов сравнения.

Определение противолепрозной активности гидрохлорида в сравнении с изодинафоном.

Противолепрозная активность гидрохлорида в сравнении с изодинафоном изучалась на мышах самцах линии СВА, зараженных лабораторным штаммом Кур-4 микобактерии лепры, взятыми в количестве 5000 и введенными интраплантарно по методу Шепарда. Опыт продолжался 6 месяцев. Под наблюдением находилось 5 групп по 20 мышей в каждой группе. Все мыши содержались в одинаковых условиях вивария на стандартном рационе.

Первая группа - контрольная: в течение 6 месяцев мыши этой группы получали через зонд 5 раз в неделю 0,5 мл крахмальной суспензии. В другой серии опытов контрольным животным парентерально в исследуемые сроки вводили 0,2 мл физраствора, а опытным - препараты, разведенные в физрастворе.

Через 6 месяцев животные были забиты цервикальным смещением позвоночника, органы были подвергнуты бактериоскопическому исследованию, никаких патологических отклонений, характерных для какой-либо группы, не обнаружено. При бактериоскопическом исследовании места заражения (лапку) растирали в 2 мл 0,1% раствора альбумина, из 0,01 мл суспензии делали мазок, окрашивали по Цилю-Нильсену и подсчитывали количество микобактерий на 1 мышь в каждой группе.

Результаты исследований представлены в таблице 6.

Таблица 6. Влияние исследуемых веществ на противолепрозную активность (различие достоверно (р меньше 0,01) по отношению к норме).
Группа	Доза мкг/мышь	Кол-во мышей в группе	Кол-во микобактерий в лапке х106	% инфицированных животных
Контроль	0,5 мл крах. сусп. перор.	20	1,14±0,12	100
Гидрохлорид	50	20	-	0
Изодинафон	50	20	-	0
Контроль	0,2 мл физраствора парентерально	20	1,27±0,14	100
Гидрохлорид	25	20	-	0
Изодинафон	25	20	-	0

Как следует из приведенных данных, гидрохлорид во всех исследуемых дозах и способах применения проявляет выраженную противолепрозную активность так же, как и изодинафон в дозе 25 мкг/мышь.

Изучение антимикробного действия гидрохлорида

Антимикробное действие гидрохлорида в сравнении с изодинафоном исследовалось на культурах Bacillus cereus и Staphylococcus aureus. Для определения антимикробного действия препаратов на В. cereus брали по 100 мг каждого препарата, разводили в 10 мл фосфатного буфера (рН 7,0) и добавляли по 1 мл в пробирки, содержащие 1 мл расплавленной среды №1 (Государственная Фармакопея СССР, изд-е XI, вып.1, т.2, стр.200) и 1 мл суточной бульонной культуры В. cereus, разведенной в 1000 раз физ-раствором. Содержимое пробирки сразу выливали на чашку Петри, содержащую 15 мл застывшей среды №1, чашки ставили в термостат при температуре от 30 до 35°С.

Для определения антимикробного действия препаратов на St. aureus брали по 100 мг каждого препарата, разводили в среде №8 (Государственная Фармакопея СССР, изд.XI, вып.1, т.2, стр.208) и добавляли по 1 мл в пробирки, содержащие по 4 мл расплавленной среды №10 (Государственная Фармакопея СССР, изд.XI, вып.1, т.2, стр.208) и 1 мл суточной бульонной культуры Staphylococcus aureus, разведенной физраствором в 1000 раз. Содержимое пробки сразу же выливали в чашки Петри, содержащие 15 мл застывшей среды №10, чашки ставили в термостат с температурой от 30 до 35°С. Эксперимент длился 5 суток.

В случае отсутствия роста тест-штаммов на соответствующих питательных средах отмечают антимикробное действие препаратов. Результаты эксперимента представлены в таблице 7.

Таблица 7. Антимикробное действие гидрохлорида в сравнении с изоди-нафоном.
Тест-культура	Гидрохлорид			Изодинафон
	24ч.	48ч.	5 сут.	24ч.	48ч.	5 сут.
S. cereus	-	-	-	-	-	-
St. aureus	-	-	-	-	-	±

+ - наличие роста микроорганизмов

- - отсутствие роста микроорганизмов

± - незначительный рост микроорганизмов

Как показывают результаты проведенных экспериментов, гидрохлорид обладает бактерицидным действием на микроорганизмы В. cereus и выраженным бактериостатическим действием на St. aureus.

Способ получения предложенных соединений формулы (I) иллюстрируется следующим примером.

Пример

Смешивают 1,26 г (0,01 моль) гидразида изоникотиновой кислоты и 2,245 г (0,01 моль) 6-метилурацил-5-сульфохлорида в ацетонитриле при температуре кипения растворителя в течение 5 часов.

Фильтруют, выпавший в осадок гидрохлорид и очищают в несколько стадий следующим образом: 0,5 г гидрохлорида кипятят в 15 мл спирта в течение 10 минут, далее фильтруют, промывают осадок 6 мл спирта, сушат на воздухе. Так повторяют еще один или два раз до момента, когда останутся только следовые количества примесей.

Получают 3,115 г 6-метил-5-(2-изоникотиноилсульфогидразоил)урацил-гидрохлорида (примерно выход 90%), который представляет собой мелкокристаллический порошок от белого до кремового цвета. Т_пл= 253-254°С

Примеры рецептур фармацевтических композиций

Капсулы

Гидрохлорид в желатиновых капсулах по 0,1 г и по 0,2 г получают фасованием ручным способом в капсулы №1 и №0 с помощью капсульниц с запорным устройством. Состав: гидрохлорид - 0,1 г и 0,2 г без наполнителей и консервантов.

Навеску гидрохлорида 10,0 г помещают на пластину капсульницы, распределяют по поверхности пластины и далее в соответствии с описанием процесса работы с капсульницей.

Желатиновые капсулы состоят из: хинолина эпу - 0,05%, титана диоксида-1,0%, желатина - до 100%. Входящие в состав капсул вещества разрешены к медицинскому применению в России.

Таблетки

Активное вещество - соединение формулы (I) в количестве 100 мг, 200 мг - массовая часть 40%. Целевые добавки (лактоза, аэросил, стеарат кальция) - массовая часть 60%.

Смешивают основное и вспомогательные вещества в соотношениях, указанных в таблице 8 (расчет на массу таблетки):

Таблица 8
Масса таблетки (Мт), г		Массовый состав, %
0,250	0,500
Гидрохлорид - 0,1	гидрохлорид - 0,2	40
Лактоза - 0,144	Лактоза - 0,288	57,6
Аэросил - 0,004	Аэросил - 0,008	1,6
Стеарат Са - 0,002	Стеарат Са - 0,004	0,8

Диаметр шаров - 5 мм. Масса шаров на 100г готовой формы - 500 г.

Прессование таблеток осуществляют на прессе РТМ-12. На таблетки наносят покрытие на основе ацетилфталилцеллюлозы (АФЦ) на аппарате "Strea-1". Состав покрытия (массовые части): ацетон - 56,4; этиловый спирт 96% - 37,6; касторовое масло - 1,0; АФЦ - 5,0; тропеолин - добавляют до светло-коричневой окраски раствора. Расход покрытия: количество покрытия (мл) = 50% от массы таблеток (г).

Раствор для инъекции

Гидрохлорид для инъекций представляет собой рассыпку порошка лекарственного средства, включающее активное вещество и его фармацевтически приемлемые соли в дозировке 0,1-0,5 г.

Конкретные составы указаны в таблице 9.

Таблица 9
Составляющие		Количество, мл
		1	2	3
соединение формулы (I), г		0,1	0,2	0,5
Растворитель	Приемлемый растворитель	5	-
	Приемлемый растворитель	-	5
	Приемлемый растворитель			5

Эксперимент на животных (кроликах) показал, что около 50% этого соединения в неизменном видеобнаруживается в продуктах их жизнедеятельности. Биологические же испытания гидрохлорида (I) показали, что его действие на гуморральный иммунитет при приеме перорально незначительно выше, чем у соединения (В), тогда как при парентеральном введении одинаковый эффект достигается при введении в 8 раз меньших доз гидрохлорида.

Гидрохлорид по сравнению с вышеуказанным соединением (В) показал антимикробную активность, в случае с В. cereus - бактерицидную, а в случае с St. aureus - бактериостатическую, о чем свидетельствуют данные таблицы 10.