способ диагностики субклинической формы мастита микробной этиологии у коров

Формула изобретения

Способ диагностики субклинической формы мастита микробной этиологии у коров, включающий забор пробы молока, выделение чистых культур, их идентификацию и определение у выделенных возбудителей способности к инактивации факторов естественной противоинфекционной резистентности, отличающийся тем, что у выделенных чистых культур возбудителей определяют антилактоферриновую активность (АЛфА) и при уровне выраженности данного признака хотя бы у одного из выделенных возбудителей как для стафилококков, так и для стрептококков АЛфА больше или равной 2,0 мкг/мл диагностируют субклиническую форму мастита, вызванную выделенным возбудителем.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для диагностики субклинических (скрытых) форм мастита микробной этиологии у коров.

Мастит - наиболее часто встречающееся заболевание коров, которое наносит значительный ущерб сельскому хозяйству [Касянчук В.В. Некоторые особенности течения мастита у коров. // Ветеринария. - №8. - 1991. - С.40].

Наибольшую хозяйственно-экономическую проблему представляет субклинический мастит, который встречается в 4-5 раз чаще, чем клинически выраженный [Загаевский И.С. Профилактика заболеваний коров маститами. Кишинев: "Картя Молдовеняскэ", 1974. - С.9.], и наносит большой экономический ущерб животноводству за счет снижения молочной продуктивности, ухудшения качества молока, преждевременной выбраковки животных и затрат на лечение [Гончаров В.П., Карпов В.А., Якимчук И.Л. Профилактика и лечение маститов у животных. М.: Россельхозиздат, 1987. - С.3].

Патогенез заболевания сложен, а причины не всегда ясны, что вызывает затруднение в диагностике и лечении. Ведущую роль в возникновении мастита имеет микробный фактор [Ивашура А.И. Гигиена производства молока. М.: Росагропромиздат, 1989. - С.218]. Известно, что спектр возбудителей мастита представлен преимущественно микроорганизмами рода Staphylococcus и Streptococcus [Демидова Л.Д. Этиология мастита у коров. / Тезисы IX Международного симпозиума по машинному доению сельскохозяйственных животных. - Оренбург, 1997. - С.188-189].

Традиционный подход к решению проблемы диагностирования субклинических форм мастита связан с исследованием молока с помощью диагностических тестов - пробы с димастином, мастидином и др. [Гончаров В.П., Карпов В.А., Якимчук И.Л. Профилактика и лечение маститов у животных. М.: Россельхозиздат, 1987. - С.36-38].

Однако диагностирование субклинической формы мастита данными методами не позволяет достаточно полно оценить картину заболевания и является только основанием для отбора коров подозрительных по заболеванию маститом для проведения дальнейшего бактериологического обследования коров [Мутовин В.И. Борьба с маститами коров. М.: Издательство сельскохозяйственной литературы, журналов и плакатов, 1963. - С.97].

Известен способ диагностики субклинического мастита микробной этиологии у коров путем подсчета количества бактериальных клеток основных возбудителей болезни в молоке коров [Серебряков Е.В., Вилиток И.Г. Борьба с маститами при машинном доении коров. Киев: Издательство "Урожай", 1969. - 53-54; 58-60]. Недостатком данного способа является то, что он не учитывает биологические свойства возбудителей мастита, тогда как степень развития воспалительного процесса в молочной железе зависит от вирулентности возбудителя, с одной стороны, и резистентности организма коровы, с другой стороны [Загаевский И.С. Профилактика заболеваний коров маститами. Кишинев: "Картя Молдовеняскэ", 1974. - С.11].

Известен способ диагностики хронического и острого течения субклинического мастита у коров, основанный на определении у золотистых стафилококков и Е.coli биологических свойств, включающих группу свойств направленных на инактивацию факторов естественной противоинфекционной резистентности макроорганизма [Чернова О.Л., Комарова Н.К., Матюшина С.Б. Роль факторов персистенции микроорганизмов при хроническом течении мастита. / Тезисы IX Международного симпозиума по машинному доению сельскохозяйственных животных. - Оренбург, 1997. - С.219-220].

Однако данный способ позволяет диагностировать только течение уже выявленного субклинического мастита, вызванного данными видами возбудителей.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ диагностики субклинической формы мастита микробной этиологии, в частности вызванных S.aureus, S.epidermedis и E.coli, путем определения у выделенных чистых культур возбудителей способности к инактивации факторов естественной противоинфекционной резистентности. У выделенных чистых культур возбудителей определяют антилизоцимную и лизоцимную активность (АЛА и ЛА соответственно). По наличию и уровню выраженности данных признаков диагностируют форму мастита, вызванную выделенным возбудителем [Чернова О.Л. Особенности микрофлоры и содержание лизоцима в молоке при мастите коров // Ветеринария. - №4. - 2001 г. - С.32-34].

Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков:

1) Позволяет диагностировать субклинические маститы, инициируемые Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermedis, что сужает область применения способа, так как за чертой диагностической неопределенности остаются маститы, инициируемые стрептококками и другими видами стафилококков.

2) Способность к инактивации фактора естественной противоинфекционной резистентности, а именно антилизоцимную активность у выделенных чистых культур возбудителей, определяют чашечным методом, который характеризуется низкой чувствительностью и существенной погрешностью при количественном определении диагностических признаков.

Заявляемый способ решает задачу повышения эффективности диагностики субклинического мастита микробной этиологии у коров.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе диагностики субклинической формы мастита микробной этиологии у коров, включающем забор пробы молока, выделение чистых культур, их идентификацию и определение у выделенных чистых культур возбудителей способности к инактивации факторов естественной противоинфекционной резистентности, у выделенных чистых культур возбудителей определяют антилактоферриновую активность (АЛфА) и при уровне выраженности данного признака хотя бы у одного из выделенных возбудителей как для стафилококков, так и для стрептококков АЛфА больше или равной 2,0 мкг/мл диагностируют субклиническую форму мастита, вызванную выделенным возбудителем.

Новым в заявляемом способе является то, у выделенных чистых культур возбудителей определяют антилактоферриновую активность (АЛфА) и при уровне выраженности данного признака хотя бы у одного из выделенных возбудителей как для стафилококков, так и для стрептококков АЛфА больше или равной 2,0 мкг/мл диагностируют субклиническую форму мастита, вызванную выделенным возбудителем.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что заявляемый способ повышает эффективность диагностики субклинических форм мастита микробной этиологии у коров за счет возможности диагностирования субклинических форм мастита, инициируемых разными видами стафилококков и стрептококков, и высокой точности количественного определения диагностических признаков.

В патентной и научно-технической литературе способов диагностики заболеваний микробной этиологии или прогнозирования течения заболевания с определением способности микроорганизмов инактивировать природный гликопротеин лактоферрин (антилактоферриновую активность) не обнаружено.

В настоящее время установлено, что природный гликопротеин лактоферрин обладает рядом защитных свойств: бактериостатическим и бактерицидным действием [Arnold R.R., Russell J.E., Champion W.I. et al. // Immunity." 1982. - Vol.35. - P.792-799], принимает участие в процессах местной защиты слизистых оболочек [Дворецкий Л.И., Дидковский Н.А., Чарлыев Г. Изучение содержания лактоферрина в бронхиальном содержимом у больных хроническим бронхитом. // Здравоохранение Туркменистана. - 1985. - №10. - C.15-18], в регуляции гуморальных и клеточных иммунологических реакций, в противовоспалительных процессах, воздействует на систему комплемента, регулирует гранулоцитопоэз [Broxmeyer H.E., De Sousa M., Smithyman А. // Blood. - 1980. - Vol.55. - P.324], гемопоэз по принципу обратной связи [Bagby G., Bennett R. // Blood. - 1982. -Vol.60. - P.108-112].

Авторами экспериментально установлена информативность определения уровня выраженности антилактоферриновой активности у разных видов стафилококков и стрептококков для диагностики субклинической формы мастита у коров. Установлено, что антилактоферриновая активность определялась у всех микроорганизмов, выделенных из молока здоровых и больных субклинической формой мастита коров, однако у выделенных возбудителей субклинического мастита уровень выраженности данного признака был в 1,9 выше. Результаты исследований представлены в табл.1.

Проведен сравнительный анализ информативности антилактоферриновой, антилизоцимной и лизоцимной активности, для этого изучено 400 чистых культур разных видов стафилококков и стрептококков, выделенных из молока 150 коров с субклинической формой мастита и 150 здоровых животных.

Из исследуемого материала (молоко) выделяли чистую культуру возбудителя. Микроорганизмы идентифицировали до вида с использованием биохимических тестов фирмы "Lachema" (Чехия). У выделенных чистых культур определяли антилактоферриновую активность согласно известной методике [патент РФ №2156807, МПК 7 С 12 Q 1/02, 1/04, 2000]. В соответствии с прототипом определяли у выделенных чистых культур возбудителей антилизоцимную и лизоцимную активность (АЛА и ЛА соответственно). Результаты представлены в табл.2.

Как видно из табл.2, для разных видов стафилококков и стрептококков, выделенных из молока здоровых животных и больных субклинической формой мастита, характерно 100% наличие антилактоферриновой активности. Причем стафилококки и стрептококки, выделенные из молока больных коров, обладали более высоким уровнем выраженности данного признака (от 2,57 до 2,99 мкг/мл) по сравнению с выделенными из молока здоровых коров (от 1,11 до 1,82 мкг/мл).

Наличием антилизоцимной активности характеризовались 19,0%-58,5% возбудителей субклинического мастита и 11,1%-33,3% микроорганизмов, выделенных от здоровых животных. Лизоцимный признак определялся в пределах от 0% до 50,0%, в зависимости от вида микроорганизмов.

При изучении средних значений АЛфА было установлено, что АЛфА среди разных видов Staphylococcus, выделенных из молока животных больных субклинической формой мастита, составила 2,51 мкг/мл, среди Streptococcus - 2,73 мкг/мл. АЛфА у стрептококков и стафилококков, выделенных из молока здоровых животных, - 1,32 и 1,48 мгм/мл соответственно. Среднее значение антилизоцимной активности колебалось от 1,0 мкг/мл до 3,5 мкг/мл и существенно не отличалось у выделенной чистой культуры возбудителей субклинического мастита и микроорганизмов, изолированных от здоровых животных.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить, что все виды стафилококков и стрептококков, выделенные из молока животных с субклинической формой мастита, обладают антилактоферриновой активностью с уровнем выраженности данного признака больше или равной 2 мкг/мл.

Таким образом, при обнаружении у исследуемой чистой культуры возбудителей, выделенной из молока обследуемого животного, антилактоферриновой активности с уровнем выраженности данного признака больше или равной 2 мкг/мл можно диагностировать субклиническую форму мастита и подобрать наиболее оптимальные схемы лечения.

Предложенный способ диагностики субклинической формы мастита микробной этиологии у коров был испытан в БПХ им. Куйбышева Оренбургского района Оренбургской области. Эффективность диагностики, проведенной в соответствии с заявляемым способом, составила 95,0%.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Исследуемый материал (молоко) забирают в стерильные пробирки и засевают на чашки с кровяным агаром.

2. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов.

3. Выросшие колонии пересевают на скошенный агар и изучают их морфологию при окраске мазков по Граму.

4. Чистую культуру идентифицируют до вида с использованием биохимических тестов фирмы "Lachema" (Чехия).

5. У всех выделенных стафилококков и стрептококков определяют антилактоферриновой активности по известной методике [патент РФ №2156807, МПК 7 С 12 Q 1/02, 1/04, 2000].

6. При обнаружении хотя бы у одного из выделенных возбудителей антилактоферриновой активности с уровнем выраженности больше или равной 2 мкг/мл диагностируют субклиническую форму мастита.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. У коровы забирали пробу молока в стерильную пробирку и засевали на чашки с кровяным агаром. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов. Выросшие колонии пересевали на скошенный агар и изучали их морфологию при окраске мазков по Граму. По совокупности морфологических (кокки, расположенные гроздьями) и тинкториальных (положительные при окраске по Граму) свойств отнесли данный штамм к представителям рода Staphylococcus. Затем чистую культуру идентифицировали до вида с использованием биохимических тестов фирмы "Lachema" (Чехия) и определили как Staphylococcus aureus. На следующем этапе работы у выделенного стафилококка определяли антилактоферриновую активность.

На основании полученных результатов о наличии у возбудителя антилактоферриновой активности с уровнем выраженности 2,71 мкг/мл, был поставлен диагноз - субклиническая форма мастита микробной этиологии.

Дальнейшее обследование животного подтвердило правильность диагноза, поставленного с использованием заявляемого способа.

Пример 2. Бактериологическое обследование молока, взятого у клинически здорового животного, осуществлялось согласно примеру 1.

При бактериологическом анализе из молока выделены ассоциации Staphylococcus aureus, обладающие уровнем выраженности антилактоферриновой активности 1,34 мкг/мл и Streptococcus agalactiae - с уровнем выраженности антилактоферриновой активности 2,69 мкг/мл. На основании полученных результатов был поставлен диагноз - субклиническая форма мастита микробной этиологии. Диагноз был подтвержден в ходе дальнейшего обследования.

Пример 3. В ходе планового профилактического обследования у коровы взята проба молока. Клинически животное здорово. Проба с димастидином отрицательная. При бактериологическом анализе из молока выделен Staphylococcus epidermidis с уровнем выраженности антилактоферриновой активности 2,54 мкг/мл. Был поставлен диагноз - субклиническая форма мастита микробной этиологии. Дальнейшее наблюдение за животным показало правильность диагноза.

Пример 4. В ходе планового профилактического обследования у коровы взята проба молока. Клинически животное здорово. Проба с димастидином сомнительная. При бактериологическом анализе из молока выделен Staphylococcus saprophyticus с уровнем выраженности антилактоферриновой активности 1,04 мкг/мл. Было сделано заключение о том, что животное здорово. Дальнейшее наблюдение за животным подтвердило правильность сделанного заключения.

Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность диагностики субклинических форм мастита микробной этиологии у коров за счет возможности диагностирования субклинических форм мастита, инициируемых разными видами стафилококков и стрептококков, и высокой точности количественного определения диагностических признаков. Своевременное и эффективное выявление животных с субклинической формой мастита позволит сократить экономический ущерб, наносимый животноводству.

Таблица 1 Сравнительный анализ уровня выраженности антилактоферриновой активности у микроорганизмов, выделенных из молока здоровых животных и больных субклинической формой мастита
Виды микроорганизмов	Состояние животного	АЛфА (мкг/мл)
		Наименьшее значение	Наибольшее значение	Среднее значение
Staphylococcus Aureus (n=137)	Здоровые (n=18)	1,03	1,87	1,54
	Больные (n=119)	2,08	2,99	2,57
Staphylococcus Epidermidis (n=43)	Здоровые (n=10)	1,1	1,78	1,31
	Больные (n=33)	2,03	2,97	2,78
Staphylococcus Saprophyticus (n=10)	Здоровые (n=2)	1,0	1,22	1,11
	Больные (n=8)	2,03	2,34	2,19
Streptococcus Agalactiae (n=165)	Здоровые (n=15)	0,65	1,44	1,17
	Больные (n=150)	2,3	2,79	2,79
Streptococcus Lacttis (n=14)	Здоровые (n=5)	1,33	1,90	1,82
	Больные (n=9)	2,2	2,8	2,45
Streptococcus Uberus (n=11)	Здоровые (n=3)	1,2	1,8	1,70
	Больные (n=8)	2,04	2,88	2,67
Streptococcus Pyogenes (n=20)	Здоровые (n=6)	0,9	1,5	1,21
	Больные (n=14)	2,1	3,0	2,91