способ исследования иммунокомпетентных клеток для оценки иммунного статуса норок

Формула изобретения

1. Способ исследования иммунокомпетентных клеток для оценки иммунного статуса норок, включающий выделение лимфоцитов путем центрифугирования из периферической крови, приготовление эритроцитарных маркеров, постановку реакции розеткообразования, инкубацию компонентов реакции и учет результатов реакции, отличающийся тем, что дополнительно выделяют лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов, центрифугирование проводят в течение 40-45 мин, приготовление эритроцитарных маркеров осуществляют с использованием специфического антигена алеутской болезни норок в дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1%-ной суспензии эритроцитов быка и инкубацию компонентов реакции осуществляют при температуре 37,5-40,0°С в течение 60-120 мин.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения Т-лимфоцитов дополнительно осуществляют инкубацию при температуре 10°С в течение 1500-2100 мин.

Описание изобретения к патенту

Способ относится к иммунологическим методам исследования и используется для оценки иммунного статуса животных, а также в качестве дополнительного теста при диагностике инфекционных болезней. В основе метода заложено определение количества лимфоцитов, способных взаимодействовать с эритроцитарными маркерами в виде "розеток".

Известен способ определения количества Т-лимфоцитов в реакции образования спонтанных розеток (Фримель X. Иммунологические методы. М.,- 1979.-С.501-508.). Способ основан на обнаружении в поле зрения микроскопа комплекса Т-лимфоцитов с эритроцитарными маркерами в виде "розеток". Однако данный способ не позволяет комплексно оценивать иммунный статус животного с учетом количества В-лимфоцитов.

Также известен способ определения количества В-лимфоцитов, основанный на использовании эритроцитов быка, сенсибилизированных антителами и комплементом, содержащемся в сыворотке крови белой мыши. Данный способ ограничивает оценку иммунного статуса животного в пределах определения количества В-лимфоцитов (Методические рекомендации по определению Т-, В-лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов в крови, молозиве и молоке крупного рогатого скота/Сост.: Б.И.Кондауров, М.П.Неустроев, Ю.И.Пацула, А.А.Васильев.- Омск, 1981.-С.13-14).

Ближайшим аналогом выбран способ определения количества розеткообразующих Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов, описанный Бажиным М.А. с соавторами (Методы оценки Т- и В-систем иммунитета у крупного рогатого скота при бруцеллезе и туберкулезе: Метод. рекомендации/Сост.: М.А.Бажин, В.А.Мироненко, С.К.Переходова и др.- Омск, 1989.- С.16-22).

Перед постановкой реакции розеткообразования лимфоциты из периферической крови выделяют дифференциальным центрифугированием форменных элементов в градиенте плотности 17% раствора верографина в объеме 2 мл, на который наслаивают 4 мл смеси равных объемов крови и раствора Версена. Центрифугирование проводят в течение 20-30 минут при 1600 об/мин. Лимфоциты, сконцентрировавшиеся в верхних слоях верографина, собирают шприцом и трижды отмывают от примесей центрифугированием.

Для определения розеткообразующих лимфоцитов готовят эритроцитарные маркеры. Для определения количества антигенсвязывающих лимфоцитов крови крупного рогатого скота Бажин М.А. с соавторами предлагают использовать в качестве маркера эритроциты быка, на поверхности которых адсорбирован соответствующий антиген туберкулеза или брецеллеза.

Для постановки реакции розеткообразования соединяют равные объемы лимфоцитов крови и соответствующих эритроцитарных маркеров.

Для взаимодействия с соответствующими эритроцитарными маркерами В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов компоненты реакции инкубируют при 37°С в течение 10 минут. Для взаимодействия с эритроцитарными маркерами Т-лимфоцитов компоненты реакции инкубируют сначала при 30°С в течение 30 минут, а затем при 10°С в течение 1080-1200 минут. По окончании инкубирования из суспензии клеток, фиксированных глютаровым альдегидом, делают мазки и окрашивают по Романовскому-Гимза.

Известный метод оценки иммунного статуса не обладает достаточной чувствительностью для определения количества лимфоцитов крови и лимфоидных органов норок.

Задачей предлагаемого способа является повышение эффективности оценки иммунного статуса норок путем повышения чувствительности реакции розеткообразования. Способ осуществляется следующим образом: выделяют лимфоциты из минимального объема периферической крови, 0,5-1 мл, в режиме центрифугирования 1600 об/мин в течение 40-45 минут; исследуют иммунокомпетентные клетки не только в периферической крови, но и в селезенке и лимфоузлах; используют стандартный специфический антиген алеутской болезни (АБ, вирусный плазмоцитоз) в эффективной дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка; инкубируют компоненты реакции для определения В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов при 37,5-40,0°С в течение 60-120 минут; инкубацию компонентов реакции для определения количества Т-лимфоцитов осуществляют вначале при 37,5-40,0°С в течение 60-120 минут, затем при 10°С в течение 1500-2100 минут; учет результатов реакции проводят не только в мазках, но и в камере Горяева.

Совокупность всех признаков предлагаемого способа позволяет повысить эффективность оценки иммунного статуса норок на 25-27%.

Отличительными признаками предложенного способа являются:

- исследование иммунокомпетентных клеток не только периферической крови, но и селезенки и лимфатических узлов;

- центрифугирование в течение 40-45 минут;

- использование стандартного антигена вируса АБ штамма "П-1" (ФНПВЗЦ "ВЕТЗВЕРОЦЕНТР", Москва) в эффективной дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка;

- продолжительность инкубации компонентов реакции розеткообразования для определения В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов в течение 60-120 минут при 37,5-40,0°С;

- продолжительность инкубации компонентов реакции розеткообразования для определения количества Т-лимфоцитов в течение 1500-2100 минут при 10°С.

Пример 1.

Для достижения поставленной цели отбирали пробы периферической крови, селезенки и лимфатических узлов от 40 норок половозрелого возраста темно-коричневого окраса (стандарт). По результатам диагностического исследования крови норок на вирусный плазмоцитоз с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на нитроцеллюлозных стрипах с антигеном АБ всех животных разделили на две группы. 20 норок первой группы на основании отрицательного результата ИФА считали здоровыми, 20 норок второй группы с положительными результатами ИФА считали инфицированными вирусным плазмоцитозом.

При выделении лимфоцитов из периферической крови норок с помощью дифференциального центрифугирования форменных элементов в градиенте плотности 17% верографина при 1600 об/мин в течение 20-30 минут отмечали недостаточный выход лимфоцитов и наличие в полученной суспензии большого числа неотделившихся форменных элементов крови. Поэтому для большего выхода лимфоцитов и отделения их от форменных элементов крови подбирали необходимую продолжительность дифференциального центрифугирования (Таблица 1).

Из таблицы видно, что более высокий выход лимфоцитов из периферической крови норок и максимально возможное отделение от форменных элементов получали в режиме дифференциального центрифугирования 1600 об/мин в течение 40-45 минут.

Следующим подготовительным этапом реакции розеткообразования являлось приготовление эритроцитарных маркеров. Особенностью приготовления эритроцитарного маркера для определения количества антигенсвязывающих лимфоцитов норок являлось использование стандартного диагностического антигена АБ штамма "П-1". Его применение позволило оценивать иммунный статус норок в норме и при вирусном плазмоцитозе. Полученные критерии оценки иммунного статуса использовались в качестве дополнительного теста при диагностике данной инфекции. Экспериментальным путем была подобрана эффективная доза стандартного диагностического антигена АБ (Таблица 2).

Таблица 1
Зависимость выхода лимфоцитов из периферической крови от продолжительности ее центрифугирования в градиенте плотности
Скорость центрифугирования, (об/мин)	Время центрифугирования, (минуты)	Выход лимфоцитов, (%)	Концентрация форменных элементов крови в выделенной суспензии лимфоцитов, (тыс/мкл)
1600	20	55,3±0,81	20,2±0,81
	25	61,8±0,83	15,3±0,75
	30	66,2±0,53	10,5±0,88
	35	70,9±0,42	5,8±0,72
	40	75,3±0,34	3,2±0,57
	45	77,4±0,21	2,3±0,78
	50	Лимфоциты вместе с эритроцитами оседают на дно пробирки	-
	55		-
			-
			-
			-
			-

Таблица 2
Количество выявленных антигенсвязывающих лимфоцитов норок в зависимости от дозы антигена в эритроцитарном маркере
Доза антигена АБ (мл, в 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка)	Количество антигенсвязывающих лимфоцитов, (%)
	Кровь		Селезенка		Лимфоузлы
	Норки здоровые	Норки больные плазмоцитозом	Норки здоровые	Норки больные плазмоцитозом	Норки здоровые	Норки больные плазмоцитозом
0,005	1,2+0,23	5,3±0,34	1,3±0,21	8,3±0,22	1,1±0,31	7,3±0,12
0,010	2,3+0,16	10,5+0,16	3,8±0,16	10,4±0,24	2,8±0,22	10,8±0,25
0,020	3,9±0,26	17,8±0,24	4,4+0,14	13,3±0,10	4,4+0,09	13,5±0,22
0,030	5,0+0,28	20,8±0,90	5,7±0,30	15,5±0,84	5,4±0,51	15,4±0,24
0,040	4,5±0,16	18,4±0,14	4,1+0,15	14,2±0,12	4,3±0,25	13,5±0,21
0,050	3,5±0,18	15,1±0,13	3,4±0,07	11,8±0,14	3,8+0,14	11,8±0,05
0,070	2,8±0,11	10,3±0,22	2,6±0,22	9,5±0,15	3,4±0,21	7,5±0,05
0,100	1,1±0,22	5,4±0,21	1,8±0,16	7,4±0,09	2,5±0,13	5,1±0,13
	1,4±0,14	2,3±0,23	1,2+0,22	3,4±0,05	1,5±0,03	2,4±0,02
0,150
		элементы	Гемолиза
0,200

По данным таблицы использование антигена АБ в дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка позволило выявить более высокий процент антигенсвязывающих лимфоцитов периферической крови, селезенки и лимфатических узлов норок.

Пример 2.

Для постановки реакции розеткообразования В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов использовали пробы периферической крови, селезенки и лимфатических узлов животных опытных и контрольных групп согласно описанию в примере 1.

Соединяли равные объемы лимфоцитов и эритроцитарных маркеров с последующим инкубированием. Для достижения поставленной задачи был проведен подбор различных временных интервалов инкубации компонентов реакции при температуре, равной температуре тела исследуемого животного (у плотоядных в пределах 37,5-40,0°С).

Из данных таблицы видно, что более высокий процент розеткообразующих В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов периферической крови, селезенки и лимфатических узлов норок выявили при инкубации компонентов реакции длительностью 60-120 минут.

Пример 3.

Для определения количества Т-лимфоцитов в периферической крови, селезенки и лимфоузлах норок использовали группы животных согласно описанию в примере 1.

Для выявления более высокого процента Т-лимфоцитов подбирали различные временные интервалы инкубации компонентов реакции (Таблица 4). По данным таблицы более высокий процент розеткообразующих Т-лимфоцитов выявляли при инкубации компонентов реакции длительностью 1500-2100 минут.

Использование предлагаемого способа исследования иммунокомпетентных клеток периферической крови здоровых и больных вирусным плазмоцитозом норок выявляет более высокий процент всех популяций розеткообразующих лимфоцитов в сравнении с известным методом, описанным Бажиным М.А., что свидетельствует об эффективности предлагаемого способа (Р<0,001). В группе здоровых норок при использовании предлагаемого способа в сравнении с известным процент выявляемости в периферической крови Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов выше на 18%, 30%, 24%, 35%, соответственно, в группе животных, больных вирусным плазмоцитозом - на 23%, 28%, 25%, 32%, соответственно.

Исследование иммунного статуса больных норок предлагаемым способом выявило в периферической крови достоверное уменьшение количества Т-лимфоцитов (Р<0,001) и достоверное увеличение количества В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров и антигенсвязывающих лимфоцитов в сравнении с количественными показателями соответствующих популяций лимфоцитов у здоровых животных (Р<0,001). Полученные результаты свидетельствуют об иммунологической перестройке организма при АБ норок. Увеличение в крови антигенсвязывающих лимфоцитов служит критерием оценки иммунного статуса зверей, являясь дополнительным тестом при диагностике данной инфекции.

Анализ количественных показателей иммунокомпетентных клеток селезенки здоровых и больных вирусным плазмоцитозом норок свидетельствует о достоверно большем проценте розеткообразующих лимфоцитов, полученном при использовании рекомендуемого нами способа в сравнении с известным (Р<0,001). В группе здоровых норок процент выявляемости Т-лимфоцитов селезенки выше на 26% при использовании предлагаемого способа в сравнении с известным, В-лимфоцитов - на 27%, лимфоцитов-киллеров - на 30%, антигенсвязывающих лимфоцитов - на 30%, в группе норок больных вирусным плазмоцитозом эти показатели составили 27%, 34%, 29%, 32% соответственно.

Сопоставление количественных величин иммунокомпетентных клеток селезенки здоровых и больных вирусным плазмоцитозом норок, исследованных предлагаемым способом, показывает достоверное уменьшение количества Т-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров (Р<0,001) и достоверное увеличение количества В-лимфоцитов, антигенсвязывающих лимфоцитов (Р<0,001) при данной инфекции, что свидетельствует об изменении иммунного статуса животного. Увеличение количества антигенсвязывающих лимфоцитов в селезенке норок больных вирусным плазмоцитозом, вследствии сенсибилизации организма данным возбудителем, служит дополнительным тестом при диагностике данной инфекции.

Изучение количественных показателей Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов лимфатических узлах норок показало достоверно больший процент выявляемости розеткообразующих клеток (Р<0,001). При использовании предлагаемого способа постановки реакции розеткообразования, в сравнении с известным, в группе здоровых животных на 28%, 26%, 29%, 32%, соответственно, в группе норок, больных плазмоцитозом - на 14%, 31%, 28%, 34%, соответственно.

В группе норок, больных вирусным плазмоцитозом, иммунологическое исследование лимфоузлов предлагаемым способом показало уменьшение количества Т-лимфоцитов (Р<0,001), увеличение количества В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов (Р<0,001) в сравнении со здоровыми животными. Изменение количества иммунокомпетентных клеток в лимфатических узлах инфицированных вирусным плазмоцитозом норок свидетельствует о развитии иммунного ответа на антиген АБ. Увеличение количества антигенсвязывающих лимфоцитов в лимфатических узлах служит критерием оценки иммунного ответа норок и является дополнительным тестом при диагностике вирусного плазмоцитоза.

Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет повысить эффективность оценки иммунного статуса норок на 25-27% и может использоваться в качестве дополнительного теста для диагностики алеутской болезни.