способ определения концентрации антитромбина iii в плазме крови

Формула изобретения

Способ определения концентрации антитромбина III (AT III) в плазме крови, включающий взаимодействие AT III со специфическими к нему поликлональными антителами, отличающийся тем, что используют суспензию сферических частиц карбоксилированного полистирольного латекса, на поверхности которых иммобилизованы специфические поликлональные антитела к AT III, а в качестве балластного белка добавлен -казеин молока (AT III-латгест), при этом для определения используют последовательные дробные разведения плазмы, а концентрацию AT III в исходном образце рассчитывают по формуле

С=a·

где С - концентрация AT III в исследуемом образце плазмы крови (мкг/мл);

а - чувствительность AT III-латтеста;

- фактор разведения, определяемый как значение последнего разведения исследуемой плазмы, еще дающего агглютинацию.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемый способ относится к медицине, а именно к способам количественного определения в кровотоке антитромбина III (AT III), и может быть использован для диагностики патологических состояний системы свертывания крови - различного вида тромбофилий, диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдрома).

AT III является основным физиологическим антикоагулянтным фактором системы свертывания крови, блокирующим в присутствии гепарина тромбин, а также другие сериновые протеиназы, участвующие в свертывании крови. На долю AT III приходится более 80% всей противосвертывающей активности крови. Дефицит AT III приводит к развитию различного вида тромбофилий и возникает вследствие снижения его синтеза при тяжелых заболеваниях и повреждениях печени, а также в результате его интенсивного потребления в процессе свертывания крови, например, при ДВС-синдроме, развивающемся при сепсисе, шоке, ожоговой болезни, сочетанных травмах, акушерской патологии, злокачественных новообразованиях, инфекционных заболеваниях, а также при длительном лечении фибринолитиками, гепарином. Уровень содержания AT III в крови в норме составляет 235±25 мкг/мл, у больных он снижается на 25-50%.

В клинико-лабораторной практике применяют, в основном, непрямые (косвенные) способы определения содержания AT III в плазме крови, основанные на оценке его активности, определяемой по остаточной активности стандартного препарата тромбина после его инактивации AT III-гепариновым комплексом. Известен косвенный способ определения содержания AT III в плазме крови, в котором в качестве субстрата для тромбина используют фибриноген, об активности AT III судят по времени образования фибрина [Баркаган З.С., Макаров В.А., Лычов ВТ. Новые методы лабораторной диагностики диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдрома). Методические рекомендации, М., 1989, с.23]. Активность AT III выражают в процентах, за 100% принимают активность смеси плазмы здоровых доноров. У здоровых людей активность AT III, определяемая таким способом, колеблется в пределах 85-115%. Способ доступен и прост в выполнении, но не может считаться достаточно надежным: являясь косвенным, он не обеспечивает строгую специфичность определения, так как на время образования фибрина, кроме остаточной активности тромбина, могут влиять побочные факторы, например медикаментозные средства, циркулирующие в крови, что приводит к искажению результатов определения. Кроме того, недостаточная чувствительность способа не позволяет регистрировать возникновение дефицита AT III на ранних стадиях заболеваний.

Известен косвенный способ оценки активности AT III в плазме крови, основанный на применении строго специфичного тромбину низкомолекулярного хромогенного субстрата [J. Fareed et al. "Application of syntetic chromogenic peptid substrate in the evalution of coagulation enzymes and their inhibitors", 1979]. Обладая достаточной чувствительностью, этот способ, как косвенный, также может давать искаженный результат из-за влияния побочных факторов. Кроме того, применение этого способа ограничено необходимостью использования дорогостоящего специального оборудования и соответствующих наборов реактивов.

Прямые (непосредственные) способы количественного определения AT III в плазме крови обеспечивают высокую чувствительность, строгую специфичность и характеризуются высокой надежностью, однако, как правило, сложны в выполнении, требуют больших затрат труда и времени и специальной аппаратуры и реактивов. Известен иммуноферментный способ прямого количественного определения AT III в плазме крови, осуществляемый как многостадийная последовательность проведения иммунологических и ферментативных реакций [Т. Andersson et al. Thrombos. Res., 1996, v.82, p.109]. AT III взаимодействует со специфичными к нему антителами, иммобилизованными на поверхности лунок полистироловых планшетов. Количественное определение AT III проводят спектрометрическим анализом образующихся окрашенных продуктов ферментативного гидролиза. Несмотря на высокую чувствительность и специфичность, способ не используют в повседневной лабораторной практике, т.к. он сложен в выполнении и требует дорогостоящего оборудования и реактивов.

Известен способ лазерной нефелометрии, в котором образование иммунных комплексов AT III со специфическими к нему антителами протекает в растворе и сопровождается увеличением светорассеяния [К. Akiyata et al. Thrombos. Res., 1993, v.72, p.193]. Способ обеспечивает быстрое получение результата, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, однако требует использования крайне дорогостоящего импортного оборудования, поэтому недоступен для применения в повседневной медицинской практике.

Наиболее близким к предлагаемому способу определения содержания AT III в плазме крови является выбранный за прототип способ радиальной иммунодифузии. (Энциклопедия клинических лабораторных тестов./ Под ред. Н. Тица, пер. с англ. М., Из-во Лаб. Информ., 1997, с.1137]. Способ основан на взаимодействии AT III со специфичными к нему поликлональными антителами, помещенными в 1%-ный агаровый гель. Образцы плазмы крови заливают в пробитые в геле лунки, а затем проводят инкубацию во влажной камере в течение 20 часов. Содержание AT III определяют на основании измерения диаметра визуально наблюдаемых кольцевых зон преципитации. Способ обеспечивает высокую чувствительность, не требует сложного оборудования, однако для получения результата требуется не менее 18-20 часов, что ограничивает его использование в клинико-лабораторной практике и делает непригодным для экспресс-анализа. В основном этот способ используют в научно-исследовательских целях.

Задачей настоящего изобретения является сокращение времени определения содержания AT III в плазме крови при сохранении высокой чувствительности и при малых затратах труда без использования специальной дорогостоящей аппаратуры.

Поставленная задача решается с применением иммунолатексного диагностикума "AT III-латтеста", представляющего собой суспензию сферических частиц карбоксилированного полистирольного латекса, на поверхности которых иммоблизованы специфические поликлональные антитела к AT III, а в качестве балластного белка добавлен -казеин молока. Избирательное взаимодействие специфических антител с AT III приводит к наглядному склеиванию (агглютинации) латексных частиц.

"AT III-латтест" готовят следующим образом [Заявка №2002113997 от 29.05.2002 на изобретение "Иммунодиагностикум на основе полистирольного латекса"]. К 2%-ой суспензии сферических частиц (0 0,5 мкм) полистирольного карбоксилированного латекса с иммобилизованными на их поверхности специфическими поликлональными антителами к AT III человека в 0.1М глициновом буфере рН 8,2 (далее - буфер) прибавляют равный объем раствора -казеина в буфере (концентрация 10 мг/мл), приготовленного следующим образом: -казеин растворяют в рассчитанном количестве буфера, прогревают 30 минут при 37°С, раствор осветляют центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин. Смесь латексной суспензии с раствором -казеина тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут, после чего помещают в холодильник. Через 24 часа иммунодиагностикум готов. Чувствительность иммунодиагностикума определяют по стандартной методике [Иммунологические методы. Под ред. М.Фримеля, М., Мир, 1978] титрованием препарата AT III с известной исходной концентрацией. Конечная концентрация раствора AT III, еще вызывающая реакцию агглютинации латексных частиц, составляет 1 мкг/мл, что является чувствительностью иммунодиагностикума "AT III-латтеста". "AT III-латтест" может храниться без потери чувствительности при +4°С в течение двух лет.

Предлагаемый способ определения AT III в плазме крови состоит в следующем: исследуемый образец бестромбоцитарной нитратной плазмы крови предварительно разводят буфером, затем дозатором по 1 капле (10 мкл) каждого разведения проносят на стеклянную пластину, к каждой дозе добавляют равный объем (10 мкл) "AT III-латтеста" и тщательно перемешивают стеклянной палочкой; реакцию агглютинации учитывают визуально через 2-3 мин: при положительной реакции латексные частицы склеиваются между собой и в капле образуется зернистость, при отрицательной реакции склеивание частиц не происходит и капля состоит из однородной взвеси латексных частиц, напоминая молоко.

Концентрацию AT III в исходной плазме определяют по формуле:

C=a×,

где С - концентрация AT III в исследуемом образце плазмы крови (мкг/мл);

а - чувствительность "AT III-латтеста";

- фактор разведения, определяемый как значение последнего разведения исследуемой плазмы, еще дающего агглютинацию.

Например: при =1 мкг/мл и =240 С=1 мкг/мл ×240=240 мкг/мл.

Определение содержания AT III в образце плазмы предлагаемым способом занимает несколько минут, что позволяет использовать метод в экстренных случаях. Способ не требует применения специального дорогостоящего оборудования и реактивов, поэтому доступен для широкого использования в клинико-лабораторной практике, а при необходимости - в полевых условиях. Высокая чувствительность предлагаемого способа позволяет осуществлять своевременную диагностику патологических состояний системы свертывания крови, поскольку позволяет фиксировать небольшие изменения содержания AT III в кровотоке на ранних стадиях заболеваний.

Возможность практического осуществления предлагаемого способа определения содержания AT III в плазме крови человека и возможность достижения заявляемого технического результата иллюстрируются следующими примерами:

Пример 1. Определение содержания AT III в плазме крови здоровых доноров.

Для определения содержания AT III используют бестромбоцитарную цитратную плазму крови, приготовленную прибавлением к 9-ти частям крови 1 части 0,11М раствора лимоннокислого натрия с последующим центрифугированием в течение 20 мин при 2000 об/мин. Исследуемый образец разводят рабочим буфером с рН 8,2, содержащим на литр раствора 0,1М глицина, 0,15M NaCl и 0,02% азида натрия. Готовят образец для анализа, смешивая 0,1 мл бестромбоцитарной цитратной плазмы крови, приготовленной, как описано выше, с 15,9 мл рабочего буфера, т.е. разбавляют исходный образец в 160 раз. Затем делают последовательные дробные разведения: 1:176, 1:192, 1:208, 1:224, 1:240, 1:256 и т.д. Далее по 10 мкл каждого разведения переносят на стеклянную пластину и к каждой пробе добавляют по 10 мкл суспензии "AT III-латтеста", тщательно перемешивают каждый образец стеклянной палочкой и наблюдают за развитием реакции агглютинации в течение 2 минут, непрерывно покачивая пластину. В качестве контроля используют заведомо отрицательную пробу, в которой образец плазмы заменяют рабочим буфером. После окончания реакции определяют величину фактора разведения - последнего разведения, еще дающего агглютинацию, и рассчитывают по приведенной выше формуле концентрацию AT III в исследуемом образце.

Результаты определений содержания AT III в плазме 5-ти здоровых доноров приведены в таблице 1. Для сравнения в таблице представлены результаты определения AT III в тех же образцах, полученные косвенным способом с использованием коммерческого набора "Bechring AT III" для определения активности AT III на хромогенном субстрате, а также с результатами прямого количественного определения содержания AT III в плазме крови методом радиальной иммунодиффузии, взятым за прототип.

Таблица 1. Сравнение результатов определения AT III в плазме крови здоровых доноров различными способами
Образцы плазмы крови здоровых доноров	"AT III-латтест" Концентрация AT III, мкг/мл	"Bechring AT ЦГ (на хромогенном субстрате) Активность AT III,%	Радиальная иммунодиффузия Концентрация AT III, мкг/мл
Донор 1	256	112	240
Донор 2	224	96	230
Донор 3	208	92	200
Донор 4	256	117	255
Донор 5	240	99	235
Среднее значение	237±21	103±12	232±23
Время выполнения теста	2-3 мин	Более 1 часа	18 часов

Учитывая, что 100% активности AT III соответствуют содержанию 235 мкг/мл AT III в плазме крови, приведенные данные указывают на хорошую корреляцию результатов определения AT III предлагаемым способом и известными способами, применяемыми в клинико-лабораторной и научно-исследовательской практике. При этом время, затраченное на получение результата предлагаемым способом, несопоставимо меньше времени, необходимого для проведения анализа способами, применяемыми в настоящее время.

Пример 2. Определение содержания AT III в плазме крови больных, страдающих ДВС-синдромом.

Исследуют образцы плазмы больных, у которых ДВС-синдром развивался на фоне гнойного менингита (больные 1 и 2), при травматическом хирургическом вмешательстве (больной 3), при акушерско-гинекологической патологии (больные 4 и 5), на фоне длительной терапии фибринолитиками и гепарином (больные 6-8). Во всех случаях ДВС-синдром был верифицирован по известным клиническим и лабораторным критериям.

Определение AT III проводят в бестромбоцитарной цитратной плазме крови, приготовленной, как в примере 1. Исходное разведение плазмы 1:80, последующие - 1:88, 1:96, 1:104, 1:112, 1:120 и т.д. Ход определения аналогичен описанному в примере 1. Сравнительные результаты, полученные теми же способами, что и в примере 1, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Определение AT III в плазме крови больных, страдающих ДВС-синдромом.
Образцы плазмы крови больных, страдающих ДВС-синдромом	"AT III-латтест" Концентрация AT III, мкг/мл	"Bechring AT III"(на хромогенном субстрате) Активность AT III,%	Радиальная иммунодиффузия Концентрация AT III, мкг/мл
Больной 1	160	71	170
Больной 2	152	65	155
Больной 3	176	74	180
Больной 4	136	57	140
Больной 5	128	55	135
Больной 6	192	70	180
Больной 7	160	62	155
Больной 8	144	55	140
Здоровые доноры	238±21	103±12	232±23

Приведенные данные показывают, что определяемое предлагаемым способом содержание AT III в плазме крови больных значительно ниже нормы и хорошо коррелирует с количеством AT III, определенным известными способами. Таким образом, предлагаемый способ позволяет надежно диагностировать патологические состояния системы свертывания крови.

Приведенные данные показывают, что в отличии от известных, используемых в настоящее время способов предлагаемый способ определения антитромбина III в плазме крови сочетает высокую чувствительность и надежность с доступностью, простотой и быстротой выполнения. Для его осуществления не требуется специального оборудования, а используемый в методе "AT-III латтест" имеет длительный срок хранения и может быть использован без дополнительной подготовки. Таким образом, способ может быть использован в любой лаборатории, позволяет проводить определение в экспресс-режиме, а при необходимости - и в полевых условиях.