штамм бифидобактерий bifidobacterium longum b 379м-мб, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств

Формула изобретения

Штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum В 379М-МБ, ВКПМ Ac-1689, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания, неферментированных продуктов, фармпрепаратов, при приготовлении косметических и гигиенических средств.

Широкий ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий дает возможность разрабатывать новые моно и комплексные продукты функционального питания, лечебного питания и бакпрепараты, способные обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстанавливать его нормальную микрофлору, снижать заболеваемость различными кишечными инфекциями.

На настоящий момент разработан ряд бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания на основе отечественных штаммов бифидобактерий Bifidobacterium longum B379M, B.longum Я-2, В.longum Я-4 (патент SU 849779, RU 2216588, RU 2216589).

Качество продуктов функционального питания и бакпрепаратов обусловлено свойствами штамма-продуцента, его специфической активностью и производственно-ценными свойствами.

Известный штамм Bifidobacterium longum B 379 M, используемый для получения жидкого концентрата бифидобактерий, кисломолочных, лечебно-диетических продуктов и биологически активных добавок, является наиболее близким аналогом к заявленному штамму. Штамм выделен из кишечника здорового грудного ребенка, депонирован в ЦМПМ "ВНИИГенетика" под номером В-2000. Штамм фермент каталазу не образует, желатину не разжижает, в аэробных условиях на плотных питательных средах не растет. Ферментирует арабинозу, ксилозу, лактозу, рибозу, слабо и непостоянно целлобиозу, не разлагает маннит, сорбит, инозит, салицин. Характерной особенностью штамма является его способность сквашивать молоко к 18-20 ч культивирования с образованием сгустка нежной консистенции. Штамм - энергичный кислотообразователь.

Кислотообразующая активность: к 24 ч - 100-110°Т, к 72 ч - 150-180°Т (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде - до 120°Т и 240°Т соответственно.

Известный штамм недостаточно устойчив к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при прохождении бифидобактерий штамма в желудочно-кишечном тракте, что указывает на недостаточную его колонизирующую активность при прохождении пищеварительного тракта.

Задачей предлагаемого изобретения является выявление штамма Bifidobacterium longum В379М-МБ, обладающего высокой кислотообразующей способностью, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, выраженной антагонистической и антиоксидантной активностью, биологической активностью, высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение продуктов функционального питания, продуктов на его основе и бактериальных препаратов с высокими пробиотическими и лечебно-профилактическими свойствами.

Штамм В.longum B379M-МБ получен из коллекционного штамма В.longum В379М путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 16 ч культивирования не менее lg 9, а также с выраженной антибиотической и антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 25,9 ед/мг белка.

В результате проведенной селекции получен штамм В.longum В379М-МБ, который депонирован и хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1689 и характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки.

Клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифурикацией или утолщением на 1-2 концах, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка образует колонии в виде комет.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный анаэроб, оптимальная температура 37,5-38°С, рН 7,2-7,4. Ферментирует лактозу с образованием уксусной и L(+)-изомера молочной кислоты. Ферментирует арабинозу, ксилозу, рибозу. Маннозу, маннит, инулин, целлобиозу, сорбит и салицин не ферментирует.

Сбраживает молоко с образованием к 16-18 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины отсутствуют. Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 16 ч - 100°Т, к 20 ч - 160°Т, к 24 ч - 180°Т. Максимальный титр бифидобактерий в сгустке достигает к 16 ч культивирования и составляет 8,3 lg КОЕ/см³; максимальный титр бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов через 24 ч культивирования составляет 1-3 lg 9.

Штамм растет на общепринятых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 8-9 микробного числа за 16-18 ч культивирования (таблица 1).

Таблица 1

Сравнительные данные накопления микробной массы (КОЕ/мл lg 8) и активность кислотообразования (в градусах Тернера) штамма Bifidobacterium longum B 379 M и В.longum В379М-МБ за 16-18 ч культивирования

Питательная среда	B.longum B 379 M	В.longum В379М-МБ
	КОЕ	°T	КОЕ	°Т
гидролизатно-молочная	1,2	120	2,1	125
молоко стерилизованное	3,8	80	4,6	88
тиогликолевая	8,2	140	8,3	170
печеночная(Блаурокка)	5,1	100	6,2	110

Из таблицы следует, что заявленный штамм обладает высокой активностью кислотообразования, активно размножается с накоплением производственной биомассы.

Антагонистические свойства, устойчивость к антибиотикам:

Штамм устойчив к антибиотикам: канамицину, линкомицину, амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, стрептомицину, тетрациклину, гентамицину, а также к сульфадимезину (см. таблицу 2).

Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при 37-38°С.

Таблица 2

Антибиотическая устойчивость штамма B.longum B379M-МБ

Антибиотики, единицы измерения активности, Мкг/см 3	Доза	Титруемая кислотность молока после культивирования со штаммом, °Т
Амикоцин сульфат	10	69-71
Ампициллин	250	69-71
Бензилпенициллин, ЕД/см3	10000	68-72
Канамицин сульфат	20	129-131
Линкомицин	25	58-62
Стрептомицин	10	49-51
Сульфадемизин	50	47-49
Тетрациклин	10	43-45
Олеандомицин	12,5	59-61
Офлоксацин	20	48-52
Экстенциллин, ЕД/см3	24000	48-52

Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм В.longum В379М-МБ устойчив к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков: к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, стрептомицину, экстенциллину. олеандомицину, офлаксоцину, сульфадимезину.

Штамм обладает выраженной антагонистической активностью к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Е.coli, S. aureus, Candida albikans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis, которые наиболее часто являются причиной пищевых отравлений, возникающих при потреблении кисломолочных продуктов.

У штамма выраженная антиоксидантная активность: супероксиддисмутазная активность штамма - 25,9 ед/мг белка микробной массы.

Условия хранения заявляемого штамма.

Свежеприготовленный В.longum В379М-МБ на питательной среде с массовой долей сухих веществ 14-16% с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатозу, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при 6-8°С без потери титра активности в течение года.

Основным производственно-полезным признаком штамма В.longum В379М - МБ, отличающим его от штамма В.longum B 379 M, является то, что выращенная в стационарных условиях в стерильном обезжиренном молоке культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД-активность штамма B.longum В379М-МБ составляет 25,9±1,4 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе.

Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях как in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.

Заявляемый штамм может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве различных форм бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных продуктов, неферментированных пищевых продуктов, в приготовлении косметических и гигиенических средств. При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, приготовляемых на его основе. Употребление в пищу продуктов, использующих заявленный штамм, способствует колонизации слизистой кишечника, вытеснению патогенной и условно патогенной микрофлоры, коррегированию кишечного дисбактериоза и способствует восстановлению бифидофлоры.

Установлено, что штамм В.longum В379М-МБ не является бактериогенным и не обладает бактериоциноустойчивостью к штаммам бифидобактерий вида В.bifidum, что позволяет использовать его при совместном культивировании в заквасках, в составе комплексного бакпрепарата или консорциума бифидобактерий.

Использование заявленного штамма в производстве кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, например кремов, салфеток, лосьонов, тампонов, питательных масок, женских прокладок, мыла, косметического молока и т.п., обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств.

Пример 1. Использование штамма В.longum В379М-МБ в составе заквасок для приготовления кисломолочных продуктов.

1-й пассаж - Лиофилизированный штамм бифидобактерий в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы титруют методом десятикратных разведений до 10^-9 и выращивают при 37,5-38°С до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы вносят в емкость с питательной средой и выращивают до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы штамма вносят в емкость с питательной средой и выращивают до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸ /мл.

2-й пассаж - Выросшую культуру объемом не более 10% вносят в среду выращивания и культивируют до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж (продукт) - Полученную биомассу в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают. Полученный продукт содержит в 1 мл не менее 10⁸ живых бифидобактерий.

Пример 2. Использование штамма В.longum В379М-МБ в составе биологически активной добавки.

1-й пассаж - Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸ /мл.

3-й пассаж - Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.

Получение биологически активной добавки - Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10 ⁸/мл, титром бифидобактрий. В концентрат можно вносить различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживляемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического действия. Можно получить сухую биологическую активную добавку, для этого к биомассе 3-его пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁷/мл, который можно использовать в качестве биологической добавки, внося ее в пищевом сырье непосредственно перед употреблением.

Пример 3. Использование штамма В.longum В379М-МБ для получения бифидосодержащего препарата.

1-й пассаж - Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸ /мл.

3-й пассаж - Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.

Получение бифидосодержащего препарата - Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10 ⁸/мл, титром бифидобактрий. К биомассе 3-его пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸/мл, который можно использовать в качестве бифидосодержащего препарата.

Пример 4. Использование штамма В.longum В379М-МБ для получения кваса или сока.

1-й пассаж - Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸ /мл.

3-й пассаж (получение продукта) - Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета, чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 10⁸. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения.

Пример 5. Использование штамма В.longum В379М-МБ для получения косметического средства.

1-й пассаж - Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж (получение косметического средства) - Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в биореактор с тиогликолевой средой и инкубируют при 37,5-38°С при слабом перемешивании до достижения титра бифидобактерий 10⁹ клеток/мл. Впоследствии полученную суспензию клеток разрушают нагреванием в автоклаве. Полученную взвесь биологически активных компонентов охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема.