предшественник leu-гирудина и способ получения leu-гирудина

Формула изобретения

1. Предшественник гирудина, содержащий сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей из сигнальных последовательностей поверхностного мембранного белка Serratia marcescens, белка oprF Pseudomonas fluorescens и фумаратредуктазы Shewanella putrifaciens, к С-концу которой присоединена последовательность Leu-гирудина.

2. Предшественник гирудина по п.1, в котором сигнальная последовательность выбрана из группы, состоящей из сигнальной последовательности поверхностного мембранного белка Serratia marcescens и фумаратредуктазы Shewanella putrifaciens.

3. Предшественник гирудина по одному из пунктов 1 или 2, применяемый для получения Leu-гирудина.

4. Способ получения Leu-гирудина, заключающийся в том, что создают экспрессионную плазмиду, содержащую ДНК-последовательность, кодирующую предшественник гирудина по п.1, экспрессионную плазмиду экспрессируют в подходящей клетке Е.coli и Leu-гирудин выделяют непосредственно из культуральной среды.

Описание изобретения к патенту

Полученный из пиявки препарат Рефлудан® показывает хорошие терапевтические свойства в клиническом испытании (The Lancet, Vol.353, p.429-438). Это позволяет сделать вывод, что в будущем следует ожидать потребности в большем количестве этого препарата. Биологически активным веществом этого препарата является описанный в Европейском патенте 0324712 [Leu¹, Thr² ]-63-десульфатогирудин, далее называемый сокращенно «Leu-гирудином».

В Европейском патенте 0448093 описан способ получения гирудина. Предпочтительный вариант способа согласно данному патенту включает в себя гирудин, N-концевой аминокислотой которого является аланин. При слиянии этого гирудина с сигнальной последовательностью -циклодекстрингликозил-трансферазы (CGТазы) и трансформации кодирующего этот слитый белок экспрессионного вектора, как описано в этом патенте, в секреторные мутанты E.coli можно получить Ala-гирудин с выходом неочищенного продукта более 2 г на литр. В Европейском патенте 0549915 описаны варианты Ala-гирудина с улучшенной стабильностью. При получении этих вариантов с использованием секреторной системы E.coli получают выходы нескольких граммов на литр. Таким образом, эти выходы являются явно более высокими, чем выходы, описанные Dodt et al. для варианта гирудина HV1 (FEBS LETTERS vol.202 373-377, 1986). В патенте США 5573929 описано несущественное в сравнении с этим повышение выхода при экспрессии, вместо полученных из pBR322 векторов Dodt et al., экспрессионной кассеты известным образом через вектор pUC. Bender et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, p.203-207, 1990) описывают секрецию описанного в Европейском патенте 0171024 Thr-гирудина с использованием Streptomyces lividans. Но также и здесь выходы, в сравнении с приведенными выходами в Европейских патентах 0448093 и 0549915, являются явно более низкими. Это относится также к экспрессии в E.coli В, которую наблюдали Р. de Taxis du Poet et al. для секреции варианта гирудина HV1 с использованием сигнальной последовательности Ompa E.coli. Эти авторы обнаружили выходы 300 мг/л гирудина в периплазме и приблизительно 40 мг/л в супернатанте клеток. Одновременно описанная в данной статье экспрессия в клеточных системах насекомых является низкой (400 мкг/л).

Достигаемые с использованием экспрессионных систем дрожжей Hansenula polymorpha или Pichia pastoris выходы больше всего приближаются к описанным в Европейских патентах 0448093 и 0549915 выходам, в противоположность выходам с использованием S. cerevisiae.

Rosenfeld et al. (Protein Expression and Purification 8, 476-482, 1996) описывают экспрессию и секрецию гирудина дрожжами Pichia pastoris. При этом достигались выходы приблизительно 1,5 г/л культурального бульона. Подобный порядок величин можно достичь с дрожжами Hansenula polymorpha (Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 377-385, 1995). Однако существенным недостатком таких систем экспрессии являются явно более продолжительные периоды времени ферментации в сравнении с системой E.coli. Было бы также предпочтительным получение Leu-гирудина, как и Ala-гирудина, через секрецию с использованием E.coli.

Однако это не удается сделать с описанной в Европейском патенте 0448093 системой. Поэтому в этом патенте предлагается удлинить последовательность Leu-гирудина трипептидом Ala-Thr-Arg, так что возникает пре-Leu-гирудин, который в конце концов превращают трипсином в нативное активное вещество Leu-гирудин. Если следовать этому предложению, то обнаруживаются явно более низкие выходы неочищенного продукта уже в эксперименте со встряхиваемыми колбами, чем выходы, описанные для Ala-гирудина. Таким образом, однозначное преимущество в сравнении с более поздними дрожжевыми системами экспрессии пока не является вполне очевидным.

Таким образом, лежащая в основе данного изобретения задача состояла в том, чтобы получить слитый белок, у которого комбинация из сигнальной последовательности и Leu-гирудина делает возможной прямой процессинг до Leu-гирудина и последующую секрецию нативного Leu-гирудина с высокими выходами посредством E.coli. Это является предпосылкой для развития способа, который как в ферментации, так и в последующей очистке вследствие улучшенной исходной концентрации гирудина благоприятно влияет на стоимость получения Рефлудана.

Неожиданно было обнаружено, что существуют сигнальные последовательности, которые делают возможной прямую секрецию Leu-гирудина посредством E.coli и что при этом наблюдается даже еще более эффективная секреция, чем описанная в Европейском патенте 0448093. В результате можно разработать способ, который без больших расходов позволит получать высокие количества Leu-гирудина. Этот способ является предметом данного изобретения.

Для нахождения предпочтительных сигнальных последовательностей используют способ основанного на ПЦР скрининга сигнальных последовательностей. Этот способ использует ДНК, кодирующую целевой белок, в качестве матрицы и определенный обратный ПЦР-праймер, а также вариабельный прямой праймер, которые делают возможным синтез ДНК-фрагмента, который кодирует сигнальную последовательность, связанную с представляющим интерес геном. Эта реакция протекает согласно представленной на чертеже схеме. Специалисту понятно, что число стадий реакции может варьировать в зависимости от длины синтезируемой сигнальной последовательности. Короткие сигнальные последовательности могут быть получены с одной стадией реакции, более длинные последовательности с двумя, тремя реакциями или с большим числом реакций. Кроме того, число реакций зависит также от прибора, применяемого для синтеза используемого в качестве праймера олигонуклеотида. Синтезированная таким образом слитая конструкция последовательность сигнального пептида-ген может затем нацеленным образом расщепляться узнающими сайты расщепления 1 и 2 ферментами и встраиваться в соответственно открытый экспрессирующий вектор. Эта система является системой общего значения в том случае, если в качестве целевого гена выбран гирудин. При этом N-концевая аминокислота гирудина может быть вариабельно выбрана. Хотя это приводит к некоторому влиянию на связывание гирудина с тромбином (изменению константы связывания), однако ингибирующее действие гирудина в отношении активности тромбина остается измеримым.

В патентном описании ЕР-В10448093 описана секреция гирудина в культуральный супернатант. Там концентрация гирудина может быть непосредственно измерена известным тестом ингибирования тромбина. Концентрация гирудина является прямой мерой для эффективности секреции и тем самым отщепления сигнальной последовательности. Однако в этом патенте описано, что, например, гирудин, начинающийся с аминокислоты лейцина, не может эффективно выделяться в супернатант посредством сигнальной последовательности CGТазы. При помощи описанного способа можно проводить поиск сигнальных последовательностей, которые позволяют делать это эффективно. Подобным образом, можно исследовать секрецию гирудинов, которые начинаются одной из остальных 19 аминокислот. Таким образом получают в каждом случае спектр сигнальных последовательностей, которые, в виде модели, позволяют эффективный процессинг карбоксиконцевой аминокислоты сигнального пептида и присоединенного к ней пептидного остатка. Тем самым можно осуществить предварительный выбор сигнальных пептидов для эффективной секреции любого белка в периплазму и повысить таким образом шанс развития предпочтительного способа получения для того или иного белка. Это также является предметом данного изобретения. Этот способ может быть ускорен или автоматизирован таким образом, что смесь для трансформации из реакционной смеси для лигирования и компетентные клетки в виде жидкой культуры встряхивают в селективной среде в течение ночи и на следующий день инокулируют аликвотой этих клеток среду, например, описанную в примере 11, которая содержит индуктор для проведения индукции, но большую часть культуры центрифугируют и осадок клеток замораживают. Если при экспрессии обнаруживают активность гирудина, то можно соответствующую экспрессионную плазмиду повторно изолировать из этих клеток, линеаризовать и гель-электрофорезом отделить от возможных продуктов аутолигирования. Затем линейную плазмидную ДНК опять лигируют и вновь трансформируют в штамм-хозяин. Можно выделить отдельные колонии и тестировать их на производительность экспрессии. При этом можно достичь того, что этот способ будет удовлетворять критериям допуска для применения в качестве лекарственного средства.

Следующее преимущество такого образа действия состоит в том, что различные варианты сигнального пептида, которые возникли в ходе эволюции посредством обмена аминокислотами между отдельными видами, могут быть легко исследованы в сравнении друг с другом в отношении их пригодности для эффективной секреции гирудина.

Этот способ является также предпочтительным в сравнении с применением компьютерных программ, например, описанных Nielsen et al. (Protein Engineering 10, 1-6, 1997), при помощи которых могут быть предсказаны сайты разрезания между сигнальной последовательностью и представляющим интерес белком. Однако оказалось, что полученные при этом предсказания не в каждом случае оказываются правильными, так что предпочтительные комбинации легко могут быть не замечены. К тому же, не существует связи между предсказанием правильного процессинга и фактически достигаемым выходом.

Предметом данного изобретения является предшественник гирудина, содержащий сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей из сигнальных последовательностей поверхностного мембранного белка Serratia marcescens, белка oprF Pseudomonas fluorescens, белка lamb В Escherichia coli (кодируемого геном рецептора лямбда (lamB)) и фумаратредуктазы Shewanella putrifaciens, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из сигнальной последовательности поверхностного мембранного белка Serratia marcescens и фумаратредуктазы Shewanella putrifaciens, к С-концу которой присоединена последовательность Leu-гирудина.

Следующим предметом данного изобретения является способ получения Leu-гирудина, в котором используют в качестве промежуточной стадии предшественник гирудина, описанный выше, при котором

(a) получают экспрессионную плазмиду, содержащую ДНК-последовательность, кодирующую предшественник гирудина;

(b) экспрессионную плазмиду согласно (а) экспрессируют в подходящей клетке E.coli;

(c) предшественник гирудина секретируется из Е.coli и одновременно процессируется и

(d) Leu-гирудин выделяют непосредственно из культуральной среды.

Предметом данного изобретения является также применение предшественника гирудина, описанного выше, для получения Leu-гирудина, предпочтительно в способе, таком как описанный выше способ.

Следующим предметом данного изобретения является способ получения подходящего сигнального пептида для секреторной экспрессии любого белка в E.coli, в котором

(a) гирудин или производное гирудина с антитромботическим действием, которые имеют определенную аминокислоту As_x на их N-конце, которые присоединяются на N-конце к одному из испытуемых сигнальных пептидов, экспрессируют в E.coli;

(b) уровень экспрессии определяют измерением активности гирудина в культуральном супернатанте;

(c) стадии (а) и (b) повторяют с различными сигнальными пептидами;

(d) подходящий сигнальный пептид выбирают сравнением уровней экспрессии, представленных полученными согласно стадии (b) активностями гирудина.

Предметом данного изобретения является также применение гирудина или производного гирудина с антитромботическим действием, которые имеют определенную аминокислоту As_х на их N-конце, для получения сигнального пептида, который делает возможной эффективную секрецию белка-предшественника, состоящего из сигнального пептида и любого другого белка с N-концевой аминокислотой As_х , при одновременном отщеплении сигнального пептида, из E.coli, в частности, в котором As_x представляет собой лейцин.

Следующим предметом данного изобретения является способ получения любого белка посредством секреторной экспрессии в Е.coli, в котором

(a) подходящий сигнальный пептид получают по способу получения подходящего сигнального пептида;

(b) конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую белок-предшественник, состоящий из подходящего сигнального пептида по (а) и любого белка, экспрессируют в E.coli; и

(c) любой белок выделяют из культурального супернатанта, в частности, в котором N-концевая аминокислота желаемого белка является лейцином и экспрессия осуществляется конструкцией нуклеиновой кислоты, в которой кодирующая сигнальный пептид последовательность кодирует сигнальный пептид, выбранный из группы, состоящей из сигнальных пептидов поверхностного мембранного белка Serratia marcescens, белка oprF Pseudomonas fluorescens, белка lamb В Escherichia coli и фумаратредуктазы Shewanella putrifaciens.

Например, должен быть описан синтез сигнальных последовательностей, которые делают возможными эффективные синтез и секрецию Leu-гирудина. Описан также синтез других сигнальных последовательностей, которые не приводят к цели или приводят к цели с худшими результатами в отношении выхода. При этом примеры должны объяснять идею данного изобретения посредством выбора сигнальных последовательностей с использованием Leu-гирудина, но не должны ограничивать данное изобретение только этим.

Описанные способы могут применяться для очистки Рефлудана; это описано, например, в примере 11.

Пример 1

Синтез слитого гена, кодирующего слитый белок, состоящий из Leu-гирудина и сигнальной последовательности поверхностного мембранного белка из Serratia marcescens

В качестве экспрессионной плазмиды применяют описанный в Европейском патенте 0468539 на фигуре 1 вектор pJF118, так как он в отношении его скелета идентичен с описанным в Европейском патенте 0448093 вектором рСМ7053.

В качестве матрицы применяют упомянутую в примере 1 Европейского патента 0448093 плазмиду рК152, которая несет последовательность гирудина, соответствующую Европейскому патенту 0171024.

Белок мембраны описан Braun, G. und Cole, S.T. (Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984).

Для синтеза желаемого ДНК-фрагмента получали три олигонуклеотидые последовательности.

Олигонуклеотид hirrev имеет последовательность:

5' TTTTTTTAAG CTTGGGCTGC AGGTC 3' [SEQ ID NO:1]

HindIII

Этот праймер гибридизуется с участком 227-210 п.н. представленного в таблице 1 гена гирудина.

Праймер smompaf1 имеет последовательность:

5'-TGGCACTGGC AGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AAGCCcttac gtatactgac tgca-3'

[SEQ ID NO:2]

Этот праймер гибридизуется с нуклеотидами 1-19 представленной в таблице 1 последовательности гирудина. Гибридируемая часть последовательности праймера представлена маленькими буквами. Остальная часть последовательности гибридизуется с участком 229 п.н.-263 п.н. опубликованной Braun, G. und Cole, S.T. (Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984).

Праймер smompaf2 имеет последовательность:

5'-ttttttgaat tcATGAAAAA GACAGCTATC GCATTAGCAG TGGCACTGGC AGGTTTC-3'

[SEQ ID NO:3]

От положения 13 п.н. эта последовательность праймера гибридизуется с опубликованной Braun и Cole последовательностью 201 п.н.-245 п.н. и, следовательно, перекрывается с последовательностью праймера smompaf2. Положение 1-12 этого праймера содержит сайт узнавания для рестриктазы EcoRI, а также смежно шесть Т-нуклеотидов, чтобы позволить узнавание этим ферментом.

В стандартной ПЦР (например, 94°С: 10'', 50°С: 30'', 72°С: 45'', 25 циклов) с ДНК плазмиды рК152 в качестве матрицы, которая несет описанную в таблице 1 последовательность, и праймерами hirrev и smompaf1 последовательность гирудина удлиняют частичной бактериальной сигнальной последовательностью. Затем продукт реакции превращают во второй ПЦР в качестве матрицы с праймерами hirrev и smompaf1 при тех же самых условиях. В качестве продукта реакции образуется ДНК-фрагмент, который кодирует слитый белок, который состоит из желаемой удлиненной сигнальной последовательностью последовательности гирудина. На 5'-конце находится сайт узнавания для рестриктазы EcoRI, а на 3'-конце сайт узнавания для фермента HindIII.

Продукт второй ПЦР превращают в реакционной смеси для двойного расщепления обеими рестриктазами и встраивают в виде фрагмента EcoRI-HindIII в открытый обоими ферментами ДНК-вектор в Т4-ДНК-лигазной реакции. Компетентные клетки штамма E.coli Mc1061 или секреторного мутанта WCM100 трансформируют смесью для лигирования и размножают под давлением отбора на ампициллинсодержащих чашках. Затем на следующее утро проводят экспрессию согласно примеру 6 в сравнении с экспрессией Ala-гирудина со штаммом E.coli WCM100/pCM7053. Оказалось, что полученная экспрессия является в приблизительно 1,5 раза лучшей, чем в сравнительном опыте.

Пример 2

Синтез слитого белка из Leu-гирудина и сигнальной последовательности oprF-генного продукта из Pseudomonas fluorescens

Конструирование происходит в соответствии с описанной в примере 1 схемой, за исключением того, что вместо праймеров smompaf1/f2 используют два новых праймера, которые обнаруживают в отношении их специфичности для гена гирудина и последовательности узнавания рестриктазой EcoRI такие же свойства, что и праймеры smompa, но кодируют желаемую сигнальную последовательность oprF-гена (De, E. et al.: FEMS Microbial. Lett. 127, 267-272, 1995).

Праймер pfuf1 имеет последовательность:

5' GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacgtatac tgactgca 3'0

[SEQ ID NO:4]

Праймер pfuf2 имеет последовательность:

5' ttttttgaat tcatgAAAAA CACCTTGGGC TTGGCCATTG GTTCTCTTAT TGCCGC 3'

[SEQ ID NO:5]

При этом праймер pfuf1 применяют, соответственно примеру 1, в ПЦР1, а праймер pfuf2 соответственно в ПЦР2. Экспрессию проводят в сравнении с экспрессией Ala-гирудина со штаммом Е.coli WCM100/pCM7053. Оказалось, что полученная экспрессия является в приблизительно 1,1 раза лучшей, чем в сравнительном опыте. После разделения при помощи гель-электрофореза в системе ПААГ-ДСН полосу гирудина выделяют и определяют N-концевую последовательность гирудина. Оказалось, что эта последовательность является полностью интактной и начинается с аминокислоты лейцина. Этот результат является неожиданным, так как программа идентификации предполагаемого сайта узнавания сигнальной пептидазой предсказывает удлинение гирудина валином.

Пример 3

Синтез слитого белка из Leu-гирудина и сигнальной последовательности lamB-генного продукта из E.coli

Конструирование происходит в соответствии с описанной в примере 1 схемой, за исключением того, что вместо праймеров smompaf1/f2 используют два новых праймера, которые обнаруживают в отношении их специфичности для гена гирудина и последовательности узнавания рестриктазой EcoRI такие же свойства, что и праймеры smompa, но кодируют желаемую сигнальную последовательность lamb-гена (Clement, J.M. and Hofnung, М.: Cell 21, 507-514, 1981).

Праймер lambbf1 имеет последовательность:

5' GTTGCCGTCG CAGCGGGCGT AATGTCTGCT CAGGCAATGG CTcttacgta tactgactgc a 3'

[SEQ ID NO:6]

Праймер lambbf2 имеет последовательность:

5' ttttttgaattcATGATGAT TACTCTGCGC AAACTTCCTC TGGCGGTTGC CGTCGCAGC 3'

[SEQ ID NO:7]

При этом праймер lambb1 применяют, соответственно примеру 1, в ПЦР1, а праймер lambb2 соответственно в ПЦР2. Экспрессию проводят в сравнении с экспрессией Ala-гирудина со штаммом Е.coil WCM100/pCM7053. Оказалось, что полученная экспрессия является такой же высокой, как и экспрессия в сравнительном опыте. После разделения при помощи гель-электрофореза в системе ПААГ-ДСН полосу гирудина выделяют и определяют N-концевую последовательность гирудина. Оказалось, что эта последовательность является полностью интактной и начинается с аминокислоты лейцина. Этот результат является неожиданным, так как программа идентификации предполагаемого сайта узнавания сигнальной пептидазы не предсказывает правильный процессинг гирудина.

Пример 4

Синтез слитого белка из Leu-гирудина и сигнальной последовательности предшественника субъединицы флавопротеина фумаратредуктазы из Shewanella putrifaciens

Конструирование происходит в соответствии с описанной в примере 1 схемой, за исключением того, что вместо праймеров smompa f1/f2 используют два новых праймера, которые обнаруживают в отношении их специфичности для гена гирудина и последовательности узнавания рестриктазой EcoRI такие же свойства, что и праймеры smompa, но кодируют желаемую сигнальную последовательность из Shewanella putrifaciens (Pealing S.L. et al.: Biochemistry 31, 12132-12140, 1992). Так как эта публикация описывает только последовательность белка, эта последовательность аминокислот переведена, согласно таблицам кодонов, в ДНК-последовательность, так что получили для

праймера spfccf1 следующую последовательность:

5'CTACCCTGAT GGGTACCGCT GGTCTGATGG GTACCGCTGT TGCTcttacg tatactgact gca 3' [SEQ ID NO : 8]

праймера spfccf2 следующую последовательность:

5'ttttttgaat tcATGAAAAA AATGAACCTG GCTGTTTGCA TCGCTACCCT GATGGGTACC 3' [SEQ ID NO : 9]

При этом праймер spfccf1 применяют, соответственно примеру 1, в ПЦР1, а праймер spfccf2 соответственно в ПЦР2. Экспрессию проводят в сравнении с экспрессией Ala-гирудина со штаммом E.coli WCM100/pCM7053. Оказалось, что полученная экспрессия является приблизительно в 1,5 раза более высокой, чем экспрессия в сравнительном опыте. После разделения при помощи гель-электрофореза в системе ПААГ-ДСН полосу гирудина выделяют и определяют N-концевую последовательность гирудина. Оказалось, что эта последовательность является полностью интактной и начинается с аминокислоты лейцина. Этот результат является неожиданным, так как программа идентификации предполагаемого сайта узнавания сигнальной пептидазой предсказывает процессинг в карбоксиположении относительно цистеина в положении 6 последовательности гирудина.

Пример 5

Синтез слитого белка из Leu-гирудина и сигнальной последовательности предшественника -лактамазы из pBR322

Конструирование происходит в соответствии с описанной в примере 1 схемой, за исключением того, что вместо праймеров smompaf1/f2 используют два новых праймера, которые обнаруживают в отношении их специфичности для гена гирудина и последовательности узнавания рестриктазой EcoRI такие же свойства, что и праймеры smompa, но кодируют желаемую сигнальную последовательность белка-предшественника -лактамазы (Sutcliffe J.G.: Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90 (1978)).

Праймер blatf1 имеет следующую последовательность:

5' CTGATCCCGT TCTTTGCAGC GTTCTGCCTG CCGGTTTTCG CGcttacgta tactgactgc a 3'

[SEQ ID NO:10]

Праймер blatf2 имеет следующую последовательность:

5' tttttgaat tcATGTCCAT CCAGCACTTC CGCGTCGCCC TGATCCCGTT CTTTGC 3'

[SEQ ID NO:11]

При этом праймер blatf1 применяют, соответственно примеру 1, в ПЦР1, а праймер blatf2 соответственно в ПЦР2. Экспрессию проводят в сравнении с экспрессией Ala-гирудина со штаммом Е.coli WCM100/pCM7053. Оказалось, что полученный выход экспрессии составляет только 50%-90% полученного в сравнительном опыте выхода. После разделения при помощи гель-электрофореза в системе ПААГ-ДСН полосу гирудина выделяют и определяют N-концевую последовательность гирудина. Оказалось, что эта последовательность является полностью интактной и начинается с аминокислоты лейцина. Этот результат был предсказан программой для идентификации предполагаемого сайта узнавания сигнального пептида.

Пример 6

Синтез слитого белка из Leu-гирудина и сигнальной последовательности предшественника щелочной фосфатазы из E.coli

Конструирование происходит в соответствии с описанной в примере 1 схемой, за исключением того, что вместо праймеров smompaf1/f2 используют два новых праймера, которые обнаруживают в отношении их специфичности для гена гирудина и их последовательности узнавания рестриктазой EcoRI такие же свойства, что и праймеры smompa, но кодируют желаемую сигнальную последовательность белка щелочной фосфатазы из Е.coli (Shuttleworth, H., Taylor, J. and Minton, N. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8689 (1986)).

Праймер linkphoaf1 имеет следующую последовательность:

5' GCTGCCGCTG CTGTTCACCC CGGTTACCAA AGCGcttacg tatactgact gca 3'

[SEQ ID NO:12]

Праймер linkphoaf2 имеет последовательность:

5' ttttttgAAT TCATGAAACA GTCGACCATC GCGCTGGCGC TGCTGCCGCT GCTGTTC 3'

[SEQ ID NO:13].

Оба праймера оптимизированы в соответствии с выбором кодонов для E.coli, т.е. они соответствуют не полностью природной последовательности исходного гена.

При этом праймер linkphoaf1 применяют, соответственно примеру 1, в ПЦР1, а праймер linkphoaf2 соответственно в ПЦР2. Экспрессию проводят в сравнении с экспрессией Ala-гирудина со штаммом E.coli WCM100/pCM7053. Оказалось, что полученный выход экспрессии составляет только ничтожную долю полученного в сравнительном опыте выхода. После разделения при помощи гель-электрофореза в системе ПААГ-ДСН полосу гирудина выделяют и определяют N-концевую последовательность гирудина. Оказалось, что эта последовательность является полностью интактной и начинается с аминокислоты лейцина. Этот результат был предсказан программой для идентификации предполагаемого сайта узнавания сигнальной пептидазой. Однако неожиданным является плохой выход.

Пример 7

Синтез слитого белка из Leu-гирудина и сигнальной последовательности предшественника щелочной фосфатазы из E.fergusonii

Конструирование происходит в соответствии с описанной в примере 1 схемой, за исключением того, что вместо праймеров smompaf1/f2 используют два новых праймера, которые обнаруживают в отношении их специфичности для гена гирудина и их последовательности узнавания рестриктазой EcoRI такие же свойства, что и праймеры smompa, но кодируют желаемую сигнальную последовательность белка щелочной фосфатазы из Е. fergusonii (Du Bose, R.F. and Hartl, D.L. Mol. Biol. Evol. 7, 547-577 (1990)).

Эта сигнальная последовательность отличается в пяти положениях от сигнальной последовательности щелочной фосфатазы E.coli.

Праймер fergusf1 имеет следующую последовательность:

5' GCTGAGCTGC CTGATCACCC CGGTGTCCCA GGCGcttacg tatactgact gca 3'

[SEQ ID NO:14]

Праймер fergusf2 имеет последовательность:

5' ttttttgaat tcATGAAACA GAGCGCGATC GCGCTGGCTC TGCTgAGCTG CCTGATC 3'

[SEQ ID NO:15]

Оба праймера оптимизированы в соответствии с выбором кодонов для Е.coli, т.е. они соответствуют не полностью природной последовательности исходного гена. При этом праймер fergusf1 применяют, соответственно примеру 1, в ПЦР1, а праймер fergusf2 соответственно в ПЦР2. Экспрессию проводят в сравнении с экспрессией Ala-гирудина со штаммом E.coli WCM100/pCM7053. Оказалось, что полученный выход экспрессии составляет только ничтожную долю полученного в сравнительном опыте выхода. Этот выход является еще приблизительно наполовину меньше, чем выход, который наблюдали для конструкции из сигнального пептида щелочной фосфатазы E.coli и Leu-гирудина.

Пример 8

Синтез слитого белка из Leu-гирудина и сигнальной последовательности предшественника циклодекстрин-глюканотрансферазы из Paenibacillus macerans

Конструирование происходит в соответствии с описанной в примере 1 схемой, за исключением того, что вместо праймеров smompaf1/f2 используют два новых праймера, которые обнаруживают в отношении их специфичности для гена гирудина и их последовательности узнавания рестриктазой EcoRI такие же свойства, что и праймеры smompa, но кодируют желаемую сигнальную последовательность гена циклодекстрин-глюканотрансферазы из Paenibacillus macerans (Nakano, Т., Fukuda, M., Monma, М., Kobayashi, S., Kainuma, К. and Yamane, K. J. Bacteriol. 166, 1118-1122 (1986)).

Праймер baccdgf1 имеет следующую последовательность:

5' CTTTCGCTGA GTATGGCGTT GGGGATTTCA CTGCCCGCAT GGGCActtac gtatactgac tgca 3'

[SEQ ID NO:16]

Праймер baccdgf2 имеет следующую последовательность:

5' ttttttgaat tcATGAAATC GCGGTACAAA CGTTTGACCT CCCTGGCGCT TTCGCTGAGT ATGGC 3'

[SEQ ID NO:17]

При этом праймер baccdgf1 применяют, соответственно примеру 1, в ПЦР1, а праймер baccdgf2 соответственно в ПЦР2. Экспрессию проводят в сравнении с экспрессией Ala-гирудина со штаммом E.coli WCM100/pCM7053. Оказалось, что полученный выход экспрессии составляет приблизительно ¹/₄ полученного в сравнительном опыте выхода. Этот синтетический гирудин ведет себя в тесте ингибирования тромбина, как Leu-гирудин. Это означает, что сигнальный пептид правильно процессировался. Это не соответствует ожидаемому из теоретического анализа, который указывал на удлиненный на 8 аминокислот или альтернативно укороченный на две аминокислоты N-конец.

Пример 9

Синтез слитого белка из Leu-гирудина и сигнальной последовательности белка-предшественника фимбриллина (fotA) E.coli PCFO20

Конструирование происходит в соответствии с описанной в примере 1 схемой, за исключением того, что вместо праймеров smompaf1/f2 используют два новых праймера, которые обнаруживают в отношении их специфичности для гена гирудина и их последовательности узнавания рестриктазой EcoRI такие же свойства, что и праймеры smompa, но кодируют желаемую сигнальную последовательность белка-предшественника фимбриллина Е.coli PCFO20 (Viboud, G.I., Jonson, G., Dean-Nystrom, E. and Svennerholm, A.M. Inaect. Immun. 64 (4), 1233-1239 (1996)).

Праймер pcf1-ala имеет следующую последовательность:

5' TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC GGGGTTGCAT TTGCTCTTAC GTATACTGAC TGCAC 3'

[SEQ ID NO:19]

Праймер p-pcf2 имеет последовательность:

5' TTTTGGGAAT TCATGAAAAA GACAATTATG TCTCTGGCTG TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC 3'

[SEQ ID NO:19]

При этом праймер pcf1-ala применяют, соответственно примеру 1, в ПЦР1, а праймер p-pcf2 соответственно в ПЦР2. Экспрессию проводят в сравнении с экспрессией Ala-гирудина со штаммом Е.coli WCM100/pCM7053. Оказалось, что полученный выход экспрессии составляет приблизительно 40% полученного в сравнительном опыте выхода.

Пример 10

Синтез слитого белка из Leu-гирудина и сигнальной последовательности поверхностного мембранного белка (fimD) S.typhimurium

Конструирование происходит в соответствии с описанной в примере 1 схемой, за исключением того, что вместо праймеров smompaf1/f2 используют два новых праймера, которые обнаруживают в отношении их специфичности для гена гирудина и их последовательности узнавания рестриктазой EcoRI такие же свойства, что и праймеры smompa, но кодируют желаемую сигнальную последовательность поверхностного мембранного белка S.typhimurium (Rioux, C.R., Friedrich, M.J. and Kadner, R.J.: J. Bacteriol. 172 (11), 6217-6222 (1990)).

Праймер styfimf1 имеет следующую последовательность:

5' CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC Ccttacgtat actgactgca 3'

[SEQ ID NO:20]

Праймер styfimf2 имеет последовательность:

5' ttttttgaat tcaTGTCATT TCATCACCGG GTATTTAAAC TGTCGGCGCT GAGTCTC 3'

[SEQ ID NO:21]

При этом праймер styfimf1 применяют, соответственно примеру 1, в ПЦР1, а праймер styfim2 соответственно в ПЦР2. Экспрессию проводят в сравнении с экспрессией Ala-гирудина со штаммом Е.coli WCM100/pCM7053. Оказалось, что полученный выход экспрессии составляет приблизительно 10% полученного в сравнительном опыте выхода.

Пример 11

Экспрессия в E.coli

Этот пример описывает экспрессию гирудина. Для этого в каждом случае 1-5 мл LB-среды, которая содержит 25 мг/л ампициллина и 0,5-2 мМ IPTG (изопропил--D-тиогалактопиранозида) инокулируют клетками трансформанта и встряхивают приблизительно 20 часов при 28°С в инкубационном встряхивателе при 220 об/мин. Затем после определения оптической плотности клеточную суспензию центрифугируют и определяют гирудин из прозрачного супернатанта.

Параллельно экспрессии рефлудана проводят экспрессию описанного в Европейском патенте 0448093 Ala-гирудина посредством плазмиды рСМ7053 в описанном в этом патенте секреторном мутанте WCM100. Благодаря этому возможно прямое сравнение уровня экспрессии.

Экспрессию в более крупном масштабе можно проводить в соответствии с патентом США 5616476. Рефлудан может быть затем очищен в соответствии с описанными в примерах 5 и 6 в этом патенте способами.

Пример 12

Определение концентрации гирудина

Определение концентрации гирудина проводят в соответствии со способом Griessbach et al. (Thrombosis Research 37, 347-350, 1985). Для этого определенные количества стандартов Рефлудана включают для получения калибровочной кривой в ряд измерений. Благодаря этому выход приводится непосредственно в мг/л.