способ получения комбинированного препарата инсулина человека

Формула изобретения

Способ получения комбинированного препарата инсулина человека, включающий получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина, ингибирование реакции закислением, хроматографическую очистку полученного эфира инсулина, снятие защитных групп трифторуксусной кислотой и очистку полученного сырого инсулина человека, приготовление части комбинированного препарата короткого действия путем растворения 15, 25 или 50% полученного инсулина в разбавленной кислоте и смешивания с растворами консерванта, изотонического агента и веществами с буферной емкостью, приготовление части комбинированного препарата пролонгированного действия путем растворения оставшегося инсулина также в разбавленной кислоте с последующей добавкой кислых растворов ионов цинка и протаминсульфата, смешиванием с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживанием раствора до образования кристаллов и соединением полученных частей комбинированного препарата инсулина, отличающийся тем, что реакцию транспептидации проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, перед закислением реакционной среды осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим осаждением фракций эфирной производной в присутствии ионов цинка, снятием защитных групп и получением кристаллов сырого инсулина, которые очищают повторным проведением ВЭЖХ, причем оба процесса очистки проводят с использованием в качестве неподвижной фазы сорбент DIASOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 Å, а в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин HCL буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% и рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5, и при приготовлении обеих частей комбинированного препарата растворение кристаллов инсулина в разбавленной кислоте проводят поэтапно, причем сначала получают мелкодисперсную суспензию кристаллов инсулина в воде, а потом к ней добавляют разбавленную кислоту, причем при приготовлении части комбинированного препарата пролонгированного действия смесь, полученную после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в производстве высокоочищенных комбинированных препаратов инсулина человека.

Известен способ получения комбинированного препарата инсулина путем получения субстанции инсулина из поджелудочной железы животных, очистки полученного экстракта от балластных белков, приготовления кристаллической и аморфной частей комбинированного препарата и их смешивания (1951, Hallas-Moller 1956).

Полученный таким образом комбинированный препарат инсулина содержит большое количество вредных для здоровья человека примесей, которые вызывают нежелательные аллергические реакции и осложнения. Для этого способа также характерны значительные потери инсулина при приготовлении его лекарственной формы и нестабильность физического состояния, потому что аморфная часть препарата конгломерируется в процессе хранения, что значительно ухудшает качество препарата.

Известен также "Способ получения полусинтетического инсулина человека" (патент США №4400465 от 1983 года), в котором эфир инсулина человека получают в две стадии: на первой стадии с помощью карбоксипептидазы А от свиного инсулина отщепляют аланин в позиции В30, а на второй трипсин пришивает эфир треонина. Реакция проводится при молярном избытке производной треонина по отношению к дезаланининсулину от 5:1 до 1000:1, в присутствии трипсина или трипсиноподобного фермента. Полученный эфир инсулина очищают хроматографией низкого давления, снимают защитные группы и осаждают человеческий инсулин, 15, 25 или 50% которого затем растворяют в разбавленной кислоте и смешивают с растворами консерванта, изотонического агента и веществами с буферной емкостью для получения части комбинированного препарата короткого действия, а для получения части комбинированного препарата пролонгированного действия оставшийся инсулин человека также растворяют в разбавленной кислоте, смешивают с необходимыми добавками, выдерживают раствор до образования кристаллов и соединяют обе части комбинированного препарата инсулина. Но, как известно, такое двухстадийное получение эфирной производной инсулина приводит к увеличению количества примесей в реакционной смеси и к снижению выхода инсулина.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ, описанный в патенте США №4601852 А, опубликованном в 1986 году, в котором рассматривается способ приготовления препаратов инсулина, при котором получают эфир инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина. Молярный избыток эфира треонина по отношению к инсулину заявляется 10:100-кратным. Весовое соотношение свиного инсулина и трипсина равняется 1:1-100. Затем ингибируют реакцию закислением реакционной среды, выделяют эфир инсулина человека, проводят его хроматографическую очистку низкого давления (гель-фильтрацией), выделяют очищенный эфир инсулина концентрированием и осаждением, снимают защитные группы известным способом (например, трифторуксуной кислотой) и выделяют сырой инсулин человека, который растворяют в разбавленной кислоте для получения части комбинированного препарата короткого действия, а для получения части комбинированного препарата пролонгированного действия к раствору полученного инсулина добавляют кислые растворы ионов цинка и протаминсульфата, смешивают с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина и выдерживают полученную смесь до образования суспензии кристаллов. Этот способ позволяет увеличить выход эфира инсулина человека, который определяет выход инсулина человека в процессе производства, до 60% (а при определенных условиях даже до 90%) и существенно снизить количество вредных примесей (до 7%).

Задачей изобретения является создание эффективного способа получения комбинированного препарата инсулина с низким содержанием примесей, который гарантирует увеличение выхода инсулина в процессе производства.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения комбинированного препарата инсулина человека, включающем получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина, ингибирование реакции закислением, хроматографическую очистку полученного эфира инсулина, снятие защитных групп трифторуксусной кислотой и очистку полученного сырого инсулина человека, приготовление части комбинированного препарата короткого действия путем растворения 15, 25 или 50% полученного инсулина в разбавленной кислоте и смешивания с растворами консерванта, изотонического агента и веществами с буферной емкостью, приготовление части комбинированного препарата пролонгированного действия путем растворения оставшегося инсулина также в разбавленной кислоте с последующей добавкой кислых растворов ионов цинка и протаминсульфата, смешиванием с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживанием раствора до образования кристаллов и соединением полученных частей комбинированного препарата инсулина, согласно изобретению реакцию транспептидации проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, перед закислением реакционной среды осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим осаждением фракций эфирной производной в присутствии ионов цинка, снятием защитных групп и получением кристаллов сырого инсулина, который очищают повторным проведением ВЭЖХ, причем оба процесса очистки проводят с использованием в качестве неподвижной фазы сорбента обращенно-фазового типа, например DAISOGEL ODS (C18), с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 , и в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин HCl буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% при рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5, и при приготовлении обеих частей комбинированного препарата растворение кристаллов инсулина в разбавленной кислоте проводят поэтапно, причем сначала получают мелкодисперсную суспензию кристаллов инсулина в воде, а потом к ней добавляют разбавленную кислоту, причем при приготовлении части комбинированного препарата пролонгированного действия смесь, полученную после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 часов.

Сопутствующими родственными примесями свиного инсулина являются свиной проинсулин и продукты модификации и деградации свиного инсулина.

Водно-органическая среда представляет собой воду со смесью апротонных (например, диметилацетамид) и протонных (например, 1,2 этандиол, 1,4 бутандиол, 1,5 пентадиол) растворителей.

Трипсин в представленном техническом решении может быть свиным или бычьим.

В реакции транспептидации может использоваться ди-трет-бутиловый эфир треонина или его соль.

Дополнительное ингибирование реакции транспептидации разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза перед закислением позволяет непосредственно наносить разбавленную смесь на колонку системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), что устраняет необходимость выполнения ряда технологических операций, которые описаны в прототипе: то есть осаждения реакционной смеси, отделения осадка центрифугированием, растворения осадка, и позволяет эффективно очистить эфир инсулина человека от свиного инсулина, который не прореагировал, и от примесей-спутников реакции транспептидации.

Повторное использование ВЭЖХ для очистки полученных кристаллов инсулина человека также проводится на колонке системы высокоэффективной жидкостной хроматографии и позволяет достичь еще лучших результатов.

В качестве неподвижной фазы заявитель использует сорбент обращенно-фазового типа, например DAISOGEL ODS (С 18), с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 , а в качестве подвижной фазы при очистке эфира инсулина использует 0,06 М-глицин НС1 буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат с концентрацией пропанола-2 от 20 до 35% при рН 2,5, а при очистке полученных кристаллов инсулина - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5.

Условия реакции транспептидации, в частности, заявляемое фермент-субстратное соотношение, равное 1:300-1000, позволяет увеличить степень конверсии свиного инсулина или выход эфира инсулина человека, который характеризует выход конечного продукта, до 98% и уменьшить количество трудноудаляемых примесей до 1,5%. На повышение степени устранения примесей направлена и дополнительная очистка полученных кристаллов инсулина человека - до 0,9%.

Для приготовления частей комбинированного препарата как короткого, так и пролонгированного действия используются кристаллы инсулина, очищенные ВЭЖХ. На приготовление части комбинированного препарата короткого действия затрачивается 15, 25 или 50% всех кристаллов, а части комбинированного препарата пролонгированного действия - оставшиеся кристаллы. В обоих случаях кристаллы инсулина человека сначала суспендируют в воде и перемешивают до получения мелкодисперсной суспензии, а потом добавляют к ней 1 М HCl. Приготовление мелкодисперсной суспензии на первом этапе, то есть обеспечение такого состояния, когда каждая отдельная мелкая частичка инсулина оказывается со всех сторон окруженной водой, создает условия для их быстрого растворения в разбавленной кислоте на втором этапе. Таким образом, время контакта кристаллов инсулина с кислотой уменьшается, что, в соответствии с исследованиями авторов, приводит к уменьшению количества образующегося А21-дезамида инсулина и, следовательно, к увеличению чистоты препарата. Так получают часть комбинированного препарата инсулина короткого действия. Для получения части комбинированного препарата инсулина пролонгированного действия к разбавленной в слабой кислоте части кристаллов добавляют кислые растворы ионов цинка и протаминсульфата, смешивают с забуференными растворами, которые содержат м-крезол, фенол и глицерин. Полученный раствор выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 часов. Такой режим выращивания кристаллов позволяет получить кристаллическую суспензию с более однородными по размеру кристаллами тетрагональной формы длиной от 1 до 25 мкм, что обеспечивает более равномерное освобождение инсулина в организме человека (в Европейской фармакопее 2002 г., 4-е издание, стр.1374, длина кристаллов допускается от 1 до 60 мкм).

Комбинированные препараты в соответствии с данным способом могут выпускаться с разными пропорциями растворимой и кристаллической частей инсулина, например, 15/85, 25/75, 50/50. Такие препараты сохраняют свои химические и физические свойства, независимо от соотношения растворимой и кристаллической частей, и обеспечивают упрощение процедуры введения препарата и увеличение точности дозировки.

Решение поставленной задачи иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

6 г сырого свиного инсулина суспендировали в 24 мл воды, добавили 3,0 мл уксусной кислоты, 180 мл 0,7 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,4 бутандиола, 19 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при температуре 23°С. Реакцию ингибировали разбавлением водой в 2 раза по отношению к объему реакционной смеси и рН смеси довели до 2,5 10% HCl. Разбавленную реакционную смесь профильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм для нанесения на колонку системы ВЭЖХ. В качестве неподвижной фазы использовали сорбент обращенно-фазового типа DAISOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 . Для подвижной фазы использовали 0,06 М глицин-HCl буфер, который содержал 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% при рН 2,5. Фракции эфирной производной осадили в присутствии ионов цинка при рН от 6,8 до 7,0, отцентрифугировали, полученный осадок промыли водой и высушили в вакуумном сушильном шкафу. 5,0 г полученного эфира инсулина человека растворили в 60 мл трифторуксусной кислоты, выдержали 40 минут при температуре 25°С, трифторуксусную кислоту отогнали на роторном испарителе при температуре не выше 30°С, полученный сырой инсулин человека растворили в воде и провели прямую цитратную кристаллизацию при рН 5,8.

Кристаллическую суспензию отфильтровали, кристаллы промыли водой, растворили в 0,25 М уксусной кислоте и нанесли на колонку системы ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы использовали 0,05 М ацетатный буфер, который содержал пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5. Фракцию инсулина человека кристаллизовали при рН 5,8, суспензию кристаллов профильтровали, промыли водой и лиофильно высушили. Выход инсулина человека составил 4,5 г. Методом иммуноферментного анализа было установлено, что содержание свиного проинсулина в полученном инсулине человека было менее 1 мкг/г. Что касается остальных родственных примесей, то с помощью аналитической системы ВЭЖХ было установлено их содержание - 0,85%.

Приготовление кристаллической части комбинированного препарата пролонгированного действия, которая составляет 85% от общего количества инсулина.

Кристаллы инсулина человека в количестве 2,295 г поместили в 170 мл воды, а затем перемешали до получения мелкодисперсной суспензии, добавили такое количество 1 М HCl, чтобы рН раствора было не ниже 3,1. 0,189 г протаминсульфата растворили в 31 мл воды, добавляя 1 М HCl до такого же рН. 0,0135 г цинка хлорида добавили в раствор протаминсульфата. Потом смешали все приготовленные кислые растворы. Дальше приготовили буферный раствор из 3,125 г натрия фосфорнокислого однозамещенного двухводного в 1,235 л воды, добавили 23,8 г глицерина, 2,23 м-крезола и 0,895 г фенола, перемешали в течение 30 минут и рН смеси довели до 7,8. Потом буферный раствор подвергли стерилизующей фильтрации и профильтровали туда смесь кислых растворов протаминсульфата, цинка хлорида и инсулина. Полученную смесь выдерживали, перемешивая, при температуре 20°С в течение 21 часа для получения кристаллической суспензии.

Приготовление растворимой части комбинированного препарата короткого действия, которая составляет 15%.

Кристаллы инсулина человека в количестве 0,405 г поместили в 52,5 мл воды, а затем хорошо перемешали до получения мелкодисперсной суспензии. Добавили такое количество 1 М HCl, чтобы рН раствора было не ниже 3,1. Потом приготовили буферный раствор из 0,55 г натрия фосфорнокислого однозамещенного двухводного в 210 мл воды, добавили 4,2 г глицерина, 0,39 г м-крезола и 0,157 г фенола, перемешали в течение 30 минут и рН смеси довели до 7,4. Раствор инсулина смешали с буферным раствором и провели стерилизующую фильтрацию в емкость с кристаллической суспензией, перемешали в течение часа и разлили в асептических условиях во флаконы. Исследования комбинированного препарата инсулина с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что препарат имел общую активность 39,9 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений составляло 0,3%, сопутствующих родственных примесей 0,9%, А21-дезамида инсулина 0,4%, активность супернатанта составляла 6,5 МЕ/мл. Кристаллы, исследованные под микроскопом при 400-кратном увеличении, имели тетрагональную форму и длину от 3 до 21 мкм.

Пример 2.

Условия получения комбинированного препарата инсулина человека, как в примере 1, за исключением того, что соотношение растворимой и кристаллической частей составляло 25/75. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 2 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21-дезамида инсулина и размеры кристаллов были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. При этом активность супернатанта составляла 10,3 МЕ/мл.

Пример 3.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что соотношение растворимой и кристаллической частей составляло 50/50. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 3 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21-дезамида инсулина и размеры кристаллов были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. При этом активность супернатанта составляла 21 МЕ/мл.

Пример 4.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что на первой стадии процесса добавили 30 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, а реакцию проводили в течение 10 часов при температуре 23°С. Выход инсулина составил 3,76 г. Исследования комбинированного препарата инсулина с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 39,2 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,7%, сопутствующих родственных примесей 4,1%, А21-дезамида инсулина 2,0%, а активность супернатанта 6,4 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-23 мкм.

Пример 5.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что на первой стадии процесса добавили 4,8 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, а реакцию проводили в течение 20 часов при температуре 20°С. Выход инсулина составил 3,395 г. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 5 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 38,5 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,8%, сопутствующих родственных примесей 1,8%, А21-дезамида инсулина 0,8%, а активность супернатанта 6,8 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-25 мкм.

Пример 6.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что в качестве неподвижной фазы использовали сорбент DAISOGEL ODS (С 18) размером частиц 15 мкм и размером пор 200 . Иммуноферментный анализ полученных кристаллов инсулина человека показал содержание свиного проинсулина менее 1 мкм/г. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 6 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 39,3 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,7%, сопутствующих родственных примесей 1,8%, А21-дезамида инсулина 0,9%, а активность супернатанта 7,0 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 1-25 мкм.

Пример 7.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что в качестве неподвижной фазы использовали сорбент DAISOGEL ODS (С 18) размером частиц от 40 до 60 мкм и размером пор 120 . Иммуноферментный анализ полученных кристаллов инсулина человека показал содержание свиного проинсулина 2,1 мкм/г. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 7 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 39,3 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,6%, сопутствующих родственных примесей 4,1%, А21-дезамида инсулина 1,9%, а активность супернатанта 5,9 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-27 мкм.

Пример 8.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что в качестве подвижной фазы при очистке эфира инсулина человека использовали 0,1 М глицин-HCl буфер, который содержал 0,1 М аммоний сульфат и пропанол-2 с концентрацией 20-35% при pH 2,5. Иммуноферментный анализ полученных кристаллов инсулина человека показал содержание свиного проинсулина менее 1 мкм/г. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 8 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 39,6 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,5%, сопутствующих родственных примесей 2,1%, А21-дезамида инсулина 1,7%, а активность супернатанта 5,9 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-28 мкм.

Пример 9.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что в качестве подвижной фазы при очистке полученных кристаллов инсулина человека использовали 0,1 М ацетатный буфер, который содержал пропанол-2 с концентрацией 20 - 35% при рН 2,5. Иммуноферментный анализ полученных кристаллов инсулина человека показал содержание свиного проинсулина 2,2 мкм/г. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 9 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 39,4 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,7%, сопутствующих родственных примесей 3,1%, А21-дезамида инсулина 0,9%, а активность супернатанта 5,9 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-26 мкм.

Пример 10.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали при температуре 14°С. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 10 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21-дезамида инсулина и активность супернатанта были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. Однако при этом 95% кристаллов имели длину от 1 до 55 мкм.

Пример 11.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали при температуре 25°С. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 11 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21 -дезамида инсулина были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. При этом длина кристаллов составляла от 1 до 50 мкм и активность супернатанта 8,3 МЕ/мл, что свидетельствовало о неполном процессе кристаллизации.

Пример 12.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали в течение 17 часов. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 12 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21-дезамида инсулина и активность супернатанта были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. Количество кристаллов длиной от 1 до 25 мкм составляло только 55%.

Пример 13.

Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали в течение 25 часов. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 13 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21-дезамида инсулина и активность супернатанта были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. Количество кристаллов длиной от 1 до 25 мкм составляло 95%. Такой же результат получается при выдерживании раствора 22 часа, то есть здесь процесс просто необоснованно затягивается.

Итак, анализ примеров конкретного выполнения (примеры 1-3) свидетельствует о том, что заявляемым способом могут быть получены комбинированные препараты инсулина с различным соотношением кристаллической и растворимой частей. Использование данного способа позволяет увеличить выход инсулина человека, уменьшить количество примесей, то есть увеличить чистоту препарата. В то же время анализ примеров 4 и 5 показывает, что выход за пределы заявляемого фермент-субстратного соотношения приводит к увеличению количества примесей в препарате и к снижению выхода инсулина; отклонение от заявляемых параметров очистки эфира инсулина человека и полученных кристаллов инсулина человека - примеры 6-9 - также приводит к снижению чистоты препарата, а несоблюдение заявляемого режима выращивания кристаллов (примеры 10-13) не позволяет получить более однородные по длине кристаллы, и следовательно, обеспечить более равномерное освобождение инсулина в организме человека, то есть получить препараты инсулина более высокого качества.