способ приготовления готовой лекарственной формы инсулина короткого действия

Формула изобретения

Способ приготовления готовой лекарственной формы инсулина короткого действия, включающий получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина, ингибирование реакции закислением, хроматографическую очистку полученного эфира инсулина человека, снятие защитных групп трифторуксусной кислотой и очистку полученного сырого инсулина человека, его последующее растворение в разбавленной кислоте и смешение с растворами консерванта, изотонического агента и веществами с буферной емкостью, отличающийся тем, что получение эфира инсулина человека проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, осуществляют дополнительное ингибирование реакции добавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза перед закислением, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим осаждением фракций эфирной производной в присутствии ионов цинка, снятием защитных групп и получением кристаллов сырого инсулина человека, который очищают повторным проведением ВЭЖХ, причем оба процесса очистки проводят с использованием в качестве неподвижной фазы сорбент DIASOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 15 мкм и размером пор от 100 до 150 Å, а в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин HCL буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% и рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 15 до 25% при рН 2,5, а растворение очищенного инсулина человека в разбавленной кислоте проводят поэтапно, причем сначала получают мелкодисперсную суспензию кристаллов инсулина в воде, а потом к ней добавляют разбавленную кислоту.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в производстве высококачественных готовых лекарственных форм инсулинов короткого действия.

Известен способ получения готовой лекарственной формы (ГЛФ) свиного инсулина водно-спиртовой экстракцией поджелудочной железы животных, очисткой полученного экстракта от балластных белков, растворением очищенной субстанции инсулина порциями в разбавленной кислоте, последующим смешиванием с растворами метилпарабена и натрия хлорида (Schtichtkrull J. et al., Insulin Rapitard and Insulin Actrapid. Acta Med Scand 177:103-113).

Такой способ позволяет получить фармацевтический препарат инсулина, в котором содержатся примеси проинсулина, глюкагона, самостатина, панкреатического полипептида и других белков (до 45%-55%). Но уже через 3 месяца после начала инсулинотерапии в сыворотке крови больных с помощью радиоиммунных методов исследований выявляются антитела к перечисленным выше примесям, что вызывает ряд нежелательных аллергических реакций, липодистрофию, инсулинорезистентность, развитие ранних осложнений. Кроме того, для такого способа характерны значительные потери инсулина при приготовлении его лекарственной формы.

Известен также "Способ получения полусинтетического инсулина человека" (патент США №4400465 от 1983 года), в котором эфир инсулина человека получают в две стадии: на первой стадии с помощью карбоксипептидазы А от свиного инсулина отщепляют аланин в позиции В30, а на второй трипсин пришивает эфир треонина. Реакция проводится при молярном избытке производной треонина по отношению к дезаланининсулину от 5:1 до 1000:1, в присутствии трипсина или трипсиноподобного фермента. Полученный эфир инсулина очищают хроматографией низкого давления, снимают защитные группы и осаждают человеческий инсулин, который затем для получения ГЛФ короткого действия растворяют в разбавленной кислоте и смешивают с необходимыми добавками. Но, как известно, такое двухстадийное получение эфирной производной инсулина приводит к увеличению количества примесей в реакционной смеси и к снижению выхода эфира инсулина человека по сравнению с реакцией транспептидации (патент США №4343898, стр.9, 1982 год), а значит, не позволяет получить хороший выход продукта фармацевтической чистоты с улучшенными характеристиками.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ, описанный в патенте США №4601852 А, опубликованном в 1986 году, в котором рассматривается способ приготовления препаратов инсулина, при котором получают эфир инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина. Молярный избыток эфира треонина по отношению к инсулину заявляется 10:100 кратным. Весовое соотношение свиного инсулина и трипсина равняется 1:1-100. Затем ингибируют реакцию закислением реакционной среды, выделяют эфир инсулина человека, проводят его хроматографическую очистку низкого давления (гель-фильтрацией), выделяют очищенный эфир инсулина концентрированием и осаждением, снимают защитные группы известным способом (например, трифторуксуной кислотой) и выделяют сырой инсулин человека, который растворяют в разбавленной кислоте, смешивают с растворами консерванта, изотонического агента и веществами с буферной емкостью. В качестве консерванта может использоваться м-крезол или фенол, как изотонический и буферные агенты одно- или двухзамещенные соли фосфорной кислоты. Этот способ позволяет увеличить выход эфира инсулина человека, который определяет выход инсулина человека в процессе производства, до 60% (а при определенных условиях даже до 90%) и существенно снизить количество вредных примесей (до 7%).

Но недостатками этого способа все еще остаются недостаточная фармацевтическая чистота препарата и значительные потери инсулина в процессе производства.

Задачей изобретения является создание эффективного способа приготовления готовой лекарственной формы инсулина короткого действия фармацевтической чистоты с улучшенными характеристиками, который гарантирует снижение потерь инсулина в процессе производства.

Поставленная задача решается тем, что в способе приготовления готовой лекарственной формы инсулина короткого действия, включающем получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина, ингибирование реакции закислением, хроматографическую очистку полученного эфира инсулина человека, снятие защитных групп трифторуксусной кислотой и очистку полученного сырого инсулина человека, его последующее растворение в разбавленной кислоте и смешивание с растворами консерванта, изотонического агента и веществами с буферной емкостью, согласно изобретению получение эфира инсулина человека проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза перед закислением, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим осаждением фракций эфирной производной в присутствии ионов цинка, снятием защитных групп и получением кристаллов сырого инсулина человека, который очищают повторным проведением ВЭЖХ, причем оба процесса очистки проводят с использованием в качестве неподвижной фазы сорбента обращено-фазового типа, например DAISOGEL ODS (C18), с размером частиц от 15 мкм и размером пор от 100 до 150 , а в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин HCl буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20% до 35% при рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 15% до 25% при рН 2,5, и растворение очищенного инсулина в разбавленной кислоте проводят поэтапно, причем сначала получают мелкодисперсную суспензию кристаллов инсулина в воде, а потом к ней добавляют разбавленную кислоту.

Сопутствующими родственными примесями свиного инсулина являются свиной проинсулин и продукты модификации и деградации свиного инсулина.

Водно-органическая среда представляет собой воду со смесью апротонных (например, диметилацетамид) и протонных (например, 1,2 этандиол, 1,4 бутандиол, 1,5 пентадиол) растворителей.

Трипсин в представленном техническом решении может быть свиным или бычьим.

В реакции транспептидации может использоваться ди-трет-бутиловый эфир треонина или его соль.

Дополнительное ингибирование реакции транспептидации разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза позволяет непосредственно наносить разбавленную смесь на колонку системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), что устраняет необходимость выполнения ряда технологических операций, которые описаны в прототипе: то есть осаждения реакционной смеси, отделения осадка центрифугированием, растворения осадка.

Кроме того, использование системы ВЭЖХ позволяет эффективно очистить эфир инсулина человека от свиного инсулина, который не прореагировал, и от примесей - спутников реакции транспептидации.

Заключительная очистка на первой стадии получения кристаллов инсулина человека, которые получаются после снятия защитных групп известным способом трифторуксусной кислотой и прямой кристаллизации, также проводится на колонке системы высокоэффективной жидкостной хроматографии и позволяет достичь еще лучших результатов.

В качестве неподвижной фазы заявитель использует сорбент обращенно-фазового типа, например DAISOGEL ODS (C18), с размером частиц от 15 мкм и размером пор от 100 до 150 , а в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин HCl буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат с концентрацией пропанола-2 от 20% до 35% при рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с концентрацией пропанола-2 от 15% до 25% при рН 2,5.

Условия реакции транспептидации, в частности заявляемое фермент-субстратное соотношение, равное 1:300-1000, позволяют увеличить степень конверсии свиного инсулина или выход эфира инсулина человека, который характеризует выход конечного продукта, до 98% и уменьшить количество трудноудаляемых примесей до 1,5%. На повышение степени устранения примесей направлена и дополнительная очистка полученных кристаллов инсулина человека - до 0,9%.

На второй стадии приготовления ГЛФ инсулина человека короткого действия кристаллы инсулина человека сначала суспендируют в воде и для получения мелкодисперсной суспензии перемешивают, а потом добавляют к суспензии 1М HCl. Приготовление мелкодисперсной суспензии на первом этапе, то есть обеспечение такого состояния, когда каждая отдельная мелкая частичка инсулина оказывается со всех сторон окруженной водой, создает условия для их быстрого растворения в разбавленной кислоте на втором этапе. Таким образом, время контакта кристаллов инсулина с кислотой уменьшается, что в соответствии с исследованиями авторов приводит к уменьшению количества образующегося А21-дезамида инсулина, и, следовательно, к увеличению чистоты препарата.

Как консервант используют м-крезол, как изотонический и буферные агенты - глицерин и одно- или двухзамещенные соли фосфорной кислоты.

Решение поставленной задачи иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1

6 г сырого свиного инсулина суспендировали в 24 мл воды, добавили 3,0 мл уксусной кислоты, 180 мл 0,7 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,4 бутандиола, 19 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при температуре 23°С. Реакцию ингибировали разбавлением водой в 2 раза по отношению к объему реакционной смеси и рН смеси довели до 2,5 10% HCl. Разбавленную реакционную смесь профильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм для нанесения на колонку системы ВЭЖХ. В качестве неподвижной фазы использовали сорбент обращенно-фазового типа DAISOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 15 мкм и размером пор от 100 до 150 . Для подвижной фазы использовали 0,06 М-глицин HCl буфер, который содержал 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20% до 35% при рН 2,5. Фракцию эфирной производной осадили в присутствии ионов цинка при рН от 6,8 до 7,0, отцентрифугировали, полученный осадок промыли водой и высушили в вакуумном сушильном шкафу. 5,0 г полученного эфира инсулина человека растворили в 60 мл трифторуксусной кислоты, выдержали 40 минут при температуре 25°С, трифторуксусную кислоту отогнали на роторном испарителе при температуре не выше 30°С, полученный сырой инсулин человека растворили в воде и провели прямую цитратную кристаллизацию при рН 5,8.

Кристаллическую суспензию отфильтровали, кристаллы промыли водой, растворили в 0,25 М уксусной кислоте и нанесли на колонку системы ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы использовали 0,05 М ацетатный буфер, который содержал от 15% до 25% пропанола-2 при рН 2,5. Фракцию инсулина человека кристаллизовали при рН 5,8, суспензию кристаллов отфильтровали, промыли водой и лиофильно высушили. Методом иммуноферментного анализа было установлено, что остаток свиного проинсулина в полученном инсулине человека составлял менее 1 мкг/г. Что касается остальных родственных примесей, то с помощью аналитической системы ВЭЖХ было установлено их содержание - 0,85%.

Полученный инсулин человека поместили в 560 мл воды, а затем перемешали до получения мелкодисперсной суспензии, добавили такое количество 1М HCl, чтобы рН раствора было не ниже 3,1. Затем приготовили буферный раствор из 5,88 г натрия фосфорнокислого однозамещенного двухводного в 2,32 л воды, добавили еще 44,8 г глицерина и 7,36 г м-крезола, перемешали в течение 30 минут и рН смеси довели до 7,8. Затем раствор инсулина человека смешали с буферным раствором и довели рН до 7,3. Объем раствора довели водой для инъекций до 2,8 л, провели его стерилизующую фильтрацию с последующим разливом в асептических условиях во флаконы и картриджи, укупоркой и маркировкой. Исследование готовой лекарственной формы инсулина короткого действия с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что фармацевтический препарат имеет активность 39,8 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,25%, родственных сопутствующих примесей 0,75%, А21-дезамида инсулина 0,3%.

Пример 2

Условия получения кристаллов инсулина человека и проведения других операций по приготовлению готовой лекарственной формы инсулина короткого действия, как в примере 1, за исключением того, что на первой стадии процесса добавили 30 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, и реакцию проводили в течение 10 часов при температуре 23°С. Анализ по данным ВЭЖХ выявил, что количество сопутствующих родственных примесей в конечном продукте первой стадии процесса составляло 4,2%. Исследования готовой лекарственной формы инсулина короткого действия по примеру 2 с помощью ВЭЖХ показали, что ее активность составляла 38,2 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,7%, родственных сопутствующих примесей 3,9%, А21 -дезамида инсулина 1,5%.

Пример 3

Условия получения готовой лекарственной формы инсулина короткого действия, как в примере 1, за исключением того, что на первой стадии процесса добавили 4,8 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, а реакционную смесь перемешивали в течение 20 часов при температуре 20°С. Анализ промежуточного продукта по данным ВЭЖХ выявил, что количество сопутствующих родственных примесей в нем составляло 10%, что привело к уменьшению выхода ГЛФ по сравнению с примером 1. Исследования готовой лекарственной формы инсулина короткого действия по примеру 3 показали, что ее активность составляла 38,5 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,8%, родственных сопутствующих примесей 1,5%, А21-дезамида инсулина 1,0%.

Пример 4

Условия получения ГЛФ инсулина короткого действия, как в примере 1, за исключением того, что для очистки эфира инсулина человека и кристаллов инсулина человека использовали сорбент DAISOGEL ODS (С 18) с размером частиц 15 мкм и размером пор 200 . Исследования ГЛФ инсулина короткого действия показали, что его активность составляла 39,3 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,5%, родственных сопутствующих примесей 1,8%, А21-дезамида инсулина 0,9%.

Пример 5

Условия получения ГЛФ инсулина короткого действия, как в примере 4, за исключением того, что использовали сорбент DAISOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 40 до 60 мкм и размером пор 120 . Исследования ГЛФ инсулина короткого действия показали, что его активность составляла 39,0 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,6%, родственных сопутствующих примесей 4,1%, А21-дезамида инсулина 1,6%.

Пример 6

Условия получения ГЛФ инсулина короткого действия, как в примере 1, но в качестве подвижной фазы при очистке эфира инсулина человека использовали 0,1 М глицин-HCl буфер, который содержал 0,1 М аммоний сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 30% до 45% при рН 2,5. Характеристики ГЛФ инсулина короткого действия были следующими: активность составляла 39,5 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 1,2%, родственных сопутствующих примесей 2,9%, А21-дезамида инсулина 1,5%.

Пример 7

Условия получения ГЛФ инсулина короткого действия, как в примере 1, но в качестве подвижной фазы при очистке полученных кристаллов инсулина человека использовали 0,1 М ацетатный буфер, который содержал пропанол-2 с концентрацией от 10% до 20% при рН 2,5. Характеристики ГЛФ инсулина короткого действия были следующими: активность составляла 38,0 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,7%, родственных сопутствующих примесей 3,1%, А21-дезамида инсулина 1,7%.

Пример 8

Условия выполнения операций первой и второй стадии приготовления ГЛФ инсулина короткого действия, как в примере 1, за исключением того, что кристаллы инсулина непосредственно растворяли в разбавленной кислоте. Исследования готовой лекарственной формы инсулина короткого действия по примеру 8 показали, что ее активность составляла 39,3 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,5%, родственных сопутствующих примесей 0,9%, А21-дезамида инсулина 2,1%.

Таким образом, анализ выполненных примеров показывает, что несоблюдение диапазонов заявляемого фермент-субстратного соотношения и отклонение от заявляемых параметров при очистке эфира инсулина и кристаллов инсулина человека с помощью ВЭЖХ (примеры 2, 3 и 4-7 соответственно) приводят к повышению содержания высокомолекулярных соединений и родственных сопутствующих примесей в ГЛФ инсулина короткого действия, то есть к ухудшению качества препарата. Пример 8 четко выявляет зависимость содержания А21-дезамида инсулина, то есть одного из параметров чистоты препарата, от способа получения раствора инсулина в разбавленной кислоте. В то же время соблюдение пределов заявляемого фермент-субстратного соотношения, параметров очистки с помощью ВЭЖХ и способа получения раствора инсулина в разбавленной кислоте (пример 1) позволяет получить ГЛФ инсулина короткого действия высокой чистоты при минимальных потерях инсулина в процессе производства.