способ качественного и количественного определения наркотических веществ группы опиатов в крови и моче трупа

Формула изобретения

1. Способ качественного и количественного определения наркотических веществ группы опиатов в крови и моче трупа методом иммуноферментного анализа (ИФА), характеризующийся тем, что используют планшет с иммобилизованным антигеном наркотического вещества, в лунки планшета вносят исследуемую среду, предварительно разведенную в Х раз фосфатно-солевым буфером с рН=6,5, добавляют антитела к морфину, связанные с ферментной меткой, инкубируют при температуре +18-20°С, учет результатов ИФА производят спектрофотометрически, отсутствие опиатов выявляют по значению оптической плотности (ОП) исследуемой разведенной среды (ОП_ис), равной оптической плотности отрицательного контрольного раствора (ОП _отр.кр), при этом допустимая погрешность может составлять не более 30% от значения ОП_отр.кр, наличие опиатов в диагностически значимой концентрации 300 нг/мл устанавливают по значению ОП_ис в диапазоне ОП_{положительныи кр}ОП _ис>0, в том случае, если ОП_ис=0, осуществляют конечное разведение (У) до тех пор, пока ОП_ис не станет отличной от 0, и проводят количественное определение наркотических веществ группы опиатов по формуле

где С - концентрация наркотического вещества в исследуемой среде, нг/мл;

300 - диагностически значимая концентрация наркотического вещества группы опиатов, нг/мл;

Х - исходное разведение, обеспечивающее разбавление исследуемой среды с диагностически значимой концентрацией морфина до концентрации морфина в положительном контрольном растворе;

Y - конечное разведение.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве положительного контрольного раствора морфина используют раствор с концентрацией 6 нг/мл, при этом разведение Х=50.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к судебной медицине и может быть использовано для качественного и количественного анализа наркотических веществ группы опиатов.

В последние десятилетия во всем мире отмечается значительное увеличение как употребления различных наркотических веществ, так и смертных случаев от передозировки ими.

По данным Российского центра судебно-медицинской экспертизы, в 2003 г. на территории России было зарегистрировано 57 тыс. (из них 150 в г.Москве) гнилостно измененных трупов с неустановленной причиной смерти. В связи с чем особенно актуальным в настоящее время является поиск новых методик качественного и количественного определения наркотических веществ в крови и моче с уже появившимися гнилостными изменениями.

Анализ известных методик определения наркотических веществ показал следующее:

Известен способ качественного определения малых доз вещества в образцах, представляющих собой собственно наркотическое вещество, включающий обработку эталонным реагентом и регистрацию изменения физико-химических параметров соединения (С.К.Еремин, Б.Н.Изотов, Н.В.Веселовская. Анализ наркотических средств. М.: Мысль, 1993 г., с.65-75.) Однако способ, во-первых, может быть использован только для веществ, представляющих собой наркотическое вещество, а не биологическую среду, а во-вторых, не обеспечивает высокой достоверности определения наркотических веществ, поскольку изменение оптической плотности производят визуально по изменению окраски.

Также известен способ определения малых доз наркотических веществ в исследуемой среде с потенцированием малой дозы путем многократного последовательного разведения и внешней обработки по гомеопатическому методу, идентификация малой дозы вещества производится с помощью иммунохимических методов анализа, основанными на реакции антиген-антитело (патент RU №2183325, 10.06.2002).

Указанный способ, однако, требует определенных навыков, оборудования в осуществлении внешнего воздействия на потенцированную малую дозу и пригоден для качественного выявления лишь малой дозы наркотического вещества без определения концентрации.

Существует способ качественного и количественного определения наркотических веществ в исследуемой среде (экстрактах из биоматериала) с использованием иммунохимического метода (поляризационный флуороиммуноанализ), включающий также воздействие эталонным реагентом и регистрацию изменений физико-химических параметров (Лисовская С.Б. Разработка поляризационного флуороиммуноанализа наркотических средств, производных опиатов, барбитуратов, 1,4-бензодиазепинов в органах и тканах: Автореферат дис... к.ф.н./ Московская медицинская академия имени И.М.Сеченова. - 2000. - 26 с.) (Лисовская С.Б., Смирнов А.В., Симонов Е.А., Изотов Б.Н., Буркин А.А. Иммунохимические методы определения опиатов в тканях и органах // Судебно-медицинская экспертиза. - 2000. - №6. - С.25-30).

Данный способ информативен, точен, но требует дорогостоящей аппаратуры и трудоемок в отношении подготовки проб исследуемых веществ - экстрагирование из биоматериала. Кроме того, по данным литературы, указанный способ не пригоден для определения наркотических веществ в гнилостно измененном трупном материале. При этом сам автор данного способа рекомендует избегать использования образцов трупного материала с бактериальным проростом.

Задачей настоящего изобретения является создание более простого в выполнении способа качественного и количественного определения наркотических веществ группы опиатов в крови и моче трупа, в том числе с уже появившимися гнилостными изменениями в моче и крови, а также повышение достоверности выявления указанной группы наркотических веществ.

Техническим результатом предлагаемого способа является быстрое и достоверное выявление наркотических веществ группы опиатов и определение их концентрации в гнилостно измененной моче и крови, в том числе и с уже появившимся бактериальным проростом. Данный способ позволяет определять наркотические вещества в крови и моче трупа с давностью смерти до 6 месяцев, а в некоторых случаях до 1 года.

Для осуществления способа используют раствор 1 (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4; например, 20-кратный фосфатно-солевой буфер с Твином 20, рН 7,4), раствор 2 (фосфатно-солевой буфер, рН 6,5; например 10-кратный фосфатно-солевой буфер с Твином 20, рН 6,5), раствор 3 (субстратная смесь, содержащая ортофенилендиамин (ОФД)), раствор 4 - специфические антиморфиновые антитела, меченные пероксидазой хрена, стандарт определяемого вещества (морфин в концентрации 6 нг/мл), и 96-луночный планшет с объемом лунки 200 мкл с иммобилизованным антигеном. Для проведения анализа необходимо иметь полуавтоматические микродозаторы, желательно многоканальные, с переменным объемом 20-200 мкл, встряхиватель для планшет (шейкер), планшетный ридер (необходимая длина волны 492 нм), дистиллированную воду, серную кислоту.

Конкретные условия проведения иммуноферментного анализа подбираются опытным путем. В предпочтительном варианте способ может быть осуществлен следующим образом.

Рационально использовать планшет целиком или по 24 лунки 96 - луночного планшета. Можно использовать любое количество лунок - все зависит от технических характеристик ридера и правильного расчета реактивов для иммуноферментного анализа (ИФА). При использовании всего планшета 10 мл раствора 1, предназначенного для отмывки и разведения антител, а также для приготовления стандартных рабочих растворов, доводят дистиллированной водой до конечного объема (200 мл). Раствор 2 предназначен для разведения исследуемого материала (5 мл раствора 2 доводят дистиллированной водой до 50 мл). Раствор 3 - субстратная смесь. К 2 мл субстратного буферного раствора (рН 5,1) добавляют 8 мл дистиллированной воды и 1 таблетку ОФД (70 мг), перемешивают и хранят в темном месте (готовят за 15-20 мин до начала использования). В качестве положительного контроля используют концентрацию морфина 6 нг/мл - стандарт №1. Дополнительно (для контроля точности получаемых результатов) используют раствор морфина с концентрацией 3 нг/мл (стандарт №2). Раствор 4 готовится добавлением 5 мл разведенного раствора 1 к 1 мл антител. Стоп-реагент - 25% серная кислота (концентрированную серную кислоту разводят 1:3 дистиллированной водой). Исследуемую пробу разбавляют раствором 2 (рН 6,5) из расчета, что диагностически значимой концентрацией морфина в образцах крови и мочи считается концентрация 300 нг/мл и выше. При разведении в Х раз концентрация морфина в исследуемом образце должна быть на уровне положительного контрольного раствора (стандарт №1). В данном случае целесообразно использовать разведение Х=50 для достижения концентрации положительного контроля - 6 нг/мл.

Процедура отмывки планшета включает в себя внесение во все лунки по 200 мкл раствора 1 и встряхивание на шейкере в течение 5 мин. При проведении ИФА обязательно в 2 лунки вносят по 100 мкл разведенного раствора 1 (контроль антител "нулевые лунки"), в 2 лунки вносят по 50 мкл раствора 1 (отрицательный контроль), в 2 лунки по 50 мкл стандартного раствора морфина в конечной концентрации 6 нг/мл (положительный контроль) и в 2 лунки по 50 мкл стандарта №2 морфина в конечной концентрации 3 нг/мл. Желательно в качестве дополнительного отрицательного контроля внести в 2 лунки по 50 мкл исследуемой среды (крови или мочи) с заведомо известным отсутствием опиатов. В остальные лунки вносят по 50 мкл образцов исследуемого материала. Для каждого образца использовать по 2 лунки. Далее во все лунки, кроме "нулевых", внести по 50 мкл раствора 4. Выдержать планшет при постоянном встряхивании при комнатной температуре (+18-20°С) 1 час. По истечении срока инкубации вытряхнуть раствор из ячеек и отмыть планшет 3 раза указанным выше способом. Во все лунки внести по 100 мкл раствора 3 и поместить планшет в темное место на 20 мин. Далее в каждую лунку добавить по 50 мкл "стоп-реагента" и провести учет результатов ИФА.

Учет результатов производится спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Отсутствие опиатов выявляют по значению оптической плотности (ОП) исследуемой разведенной среды (ОП_ис) равной оптической плотности отрицательного контрольного раствора (ОП_отр.кр) (при этом допустимая погрешность может составлять не более 30% от значения ОП _отр.кр), наличие опиатов в диагностически значимой концентрации 300 нг/мл устанавливают по значению ОП_ис в диапазоне ОП_{положительный кр}ОП _ис>0, в том случае если ОП_ис=0 осуществляют разведение до тех пор, пока ОП_ис не станет отличной от 0, затем проводят количественное определение наркотических веществ группы опиатов по формуле:

где С - концентрация наркотического вещества, нг/мл;

300 - диагностически значимая концентрация наркотического вещества группы опиатов, нг/мл;

Х - исходное разведение;

У - конечное разведение.

Пример 1

Исследовали кровь от трупа, предположительно употреблявшего наркотические средства. Кровь развели в 50 раз (980 мкл раствора 2+20 мкл крови). При измерении ОП в лунке, содержащей отрицательный контроль, получен результат 0.76; 0.77 (на каждый образец 2 лунки), ОП в лунке с положительным контролем (морфин 6 нг/мл)=0.04; 0.05; ОП в лунке, содержащей разведенный опытный образец, составила 0,00; 0,00. Провели разведение крови в 100 раз и вновь произвели измерение ОП указанных образцов. ОП опытного образца составила 0,00; 0,00. Далее процесс разведения и измерения ОП проводили до тех пор, пока ОП опытного образца не стала отличной от нуля. При разведении в 350 раз ОП опытного образца составила 0,03; 0,04, что ОП_{положительный кр}.

Произвели расчет концентрации опиатов в образце крови:

С=(300×350)/50=2100 нг/мл.

Концентрация веществ группы опиатов в присланном на исследование образце крови составила 2100 нг/мл.

Пример 2

Исследовали мочу от трупа, предположительно употреблявшего наркотические средства. Мочу развели в 50 раз (980 мкл раствора 2+20 мкл крови). При измерении ОП в лунке, содержащей отрицательный контроль, получен результат 0.76; 0.77 (на каждый образец 2 лунки), ОП в лунке с положительным контролем (морфин 6 нг/мл)=0.04; 0.05; ОП в лунке, содержащей разведенный опытный образец, составила 0,72; 0,74. По значению оптической плотности в опытном образце можно сделать заключение об отсутствии наркотических веществ группы опиатов в исследуемом образце.

Пример 3

Исследовали мочу от трупа, предположительно употреблявшего наркотические средства. Мочу развели в 50 раз (980 мкл раствора 2+20 мкл крови). При измерении ОП в лунке, содержащей отрицательный контроль, получен результат 0.49; 0.50 (на каждый образец 2 лунки), ОП в лунке с положительным контролем (морфин 6 нг/мл)=0.02; 0.03; ОП в лунке, содержащей разведенный опытный образец, составила 0,02; 0,03. Следовательно, ОП_ис=ОП_{положительного кр}. Из этого можно сделать заключение о наличии в моче наркотических веществ группы опиатов в концентрации приблизительно 300 нг/мл.

Способ прост в применении и позволяет с высокой достоверностью выявлять наркотические вещества в гнилостно измененной крови и моче.