способ определения in vitro остеоинтегративных свойств пластических материалов для имплантатов

Формула изобретения

Способ определения in vitro остеоинтегративных свойств пластических материалов для имплантатов, заключающийся в определении биологической совместимости материала с костной тканью с помощью культивирования тест-объекта, который помещают на поверхность испытуемого материала, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют мезенхимальные стволовые клетки, при этом сначала определяют цитотоксичность образцов по жизнеспособности клеток, затем определяют эффективность прикрепления клеток к поверхности образцов путем заселения клеток на поверхность образца, последующей промывки образца культуральной средой через 120 мин и стандартного подсчета оставшихся на образце клеток, после отбора образцов определяют их влияние на эффективность пролиферации мезенхимальных стволовых клеток по количеству выращенных на поверхности образца клеток на 7 и 14 сутки, затем осуществляют индукцию остеогенной дифференцировки и оценивают ее по наличию минерализации, а также с помощью окраски на щелочную фосфатазу.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к челюстно-лицевой хирургии, ортопедии и травматологии. Предназначено для предварительного скрининга пластических материалов в клеточной культуре с целью определения их остеоинтегративных свойств.

Разработка методов повышения остеоинтегративных свойств имплантатов, изготавливаемых из различных пластических нерезорбируемых материалов, относится к важным проблемам к челюстно-лицевой хирургии, связанным с восстановлением целостности костной ткани.

Известны пластические материалы, используемые для закрытия костных дефектов и скрепления костных отломков, например, гидроксиапатит, этакрил-м, сверхвысокомолекулярный полиэтилен, полиамид-12, изотропные композиции углеродопластов. Такие материалы различаются по характеру взаимодействия с костной тканью: одни из них несколько стимулируют костеобразование на поверхности пластмассы, другие его тормозят, третьи не оказывают на него существенного влияния. В результате остеоинтегративные свойства имплантатов в значительной мере определяют активность процесса заживления костной раны.

Известен способ определения пригодности материала к имплантации, включающий введение исследуемого материала в жидкую среду и последующую оценку его стойкости, у исследуемого материала до и после введения в жидкость измеряют величины компонент электродного импенданса, по изменению которых судят о структурных превращениях на поверхности материала (авт. св. СССР №1675761). Метод не пригоден для определения качества возможности использования пластмассы для изготовления имплантата.

Известны способы определения остеоинтегративных свойств материалов для имплантатов небиологической природы, в качестве которых использовали титан и его сплавы с различными покрытиями (патент РФ №2159094). Опыты проводились на самцах мышей линии Balb/c, находящихся в стандартных условиях и на диете. Мышей предварительно выдерживали в течение 2-3 недель в карантине, больные и нестандартные животные выбраковывались. Каждому животному после дачи эфирного наркоза подкожно вводили по 4 диска. Для определения остеокондуктивных свойств на диск предварительно наносили столбик костного мозга, выделенного из бедренной кости путем вымывания 1-2 мл среды Д-МЕМ с 5%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Остеоиндуктивность исследовали без нанесения на диски костного мозга. Через 1 месяц животных забивали, определяли физическими методами силу сцепления дисков с окружающей тканью. Предварительную оценку размеров очагов костеобразования осуществляли с помощью бинокулярного микроскопа МБС-2, после чего делали гистологический, цитологический и цитохимический анализ для определения качественного состава костных и других клеток на поверхности имплантанта и реакции на него окружающей ткани. Результаты обрабатывали методом непараметрической статистики.

Известен способ определения остеоинтегративных свойств материалов в зубных имплантатах, заключающийся в определении поверхности перехода имплантата, помещенного 4 собакам. По истечении 15, 30, 60 и 120 дней после помещения имплантата в челюстную кость животных проводили гистологическую оценку тканей, окружающих имплантат. Определяли также рост костной ткани через отверстия имплантата по направлению к внутреннему костному столбику. При микроскопическом исследовании образцов, полученных от собак, выведенных из эксперимента на 60-й день, определяли поверхность перехода кость /металл/ Lum.L.B.,Beime O.R. Viability of the retained bone core in the core-vent dental implant. J. Oral Implantol., 1987, 13, №3, 402-408/.

Известны способы определения остеоинтегративных свойств материалов для костных имплантатов и трасплантатов биологической и небиологической природы, заключающиеся в непосредственном вживлении испытуемых материалов в кость экспериментальных животных. /Diert E., Fischer-Brandies E., Bagambisa F. REM-Untersuchungen an den Grenzschichtstrukturen Hydroxylapatik. Knochen. Dtsch. Zahnarztl. Z., 1988, 43, №1, 22-25/.

Недостатками известных способов являются: крайне затрудненное определение количественной оценки костной интеграции (отношение площади участков прямого контакта костных культур с поверхностью имплантанта к общей площади имплантата); для достоверного суждения требуются значительно большие группы животных; необходимы более длительные эксперименты; нет прямой зависимости от техники выполнения операции на животном.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому объекту является способ определения in vitro остеоинтегративных свойств пластических материалов для инплантантов, заключающийся в определении биологической совместимости материала с костной тканью с помощью культивирования тест-объекта, который помещают на поверхность испытуемого материала (пат. РФ №2182018). В качестве тест-объекта в данном способе используют лишенный надкостницы фрагмент теменной или лобной кости крысенка-сосунка в возрасте до 1 недели.

Недостатком данного способа является низкая эффективность способа применительно к пластическим материалам.

Цель данного изобретения - информативность способа определения остеоинтегративных свойств имплантата, получение качественных и количественных показателей поведения мезенхимальных стволовых клеток на исследуемом имплантате, что позволит оперативно прогнозировать перспективность дальнейших испытаний на животных, выбор оптимального пластического материала для создания нерезорбируемого имплантата.

Поставленная цель достигается за счет использования способа определения in vitro остеоинтегративных свойств пластических материалов для инплантатов, заключающегося в определении биологической совместимости материала с костной тканью с помощью культивирования тест-объекта, который помещают на поверхность испытуемого материала. В качестве тест-объекта используют мезенхимальные стволовые клетки, при этом вначале определяют цитотоксичность образцов по жизнеспособности клеток, затем определяют эффективность прикрепления клеток к поверхности образцов путем заселения клеток на поверхность образца, последующей промывки образца культуральной средой через 120 минут и стандартного подсчета оставшихся на образце клеток, после этого определяют влияние образцов на эффективность пролиферации мезенхимальных стволовых клеток по количеству выращенных на поверхности образца клеток на 7 и 14 сутки и их стандартному подсчету, затем осуществляют индукцию остеогенной дифференцировки и оценивают ее по наличию минерализации, а также с помощью окраски на щелочную фосфатазу.

Примеры, иллюстрирующие изобретение:

Исследуемые образцы: 1 - полиамид-12 с углеволокном, 2 - полиамид-12 с углеволокном и гидроксиапатитом, 3 - полиамид-12 с углеволокном, гидроксиапатитом и поливинилпирролидон, 4 - полиметилметакрилат с гидроксиапатитом, 5 - сверхвысокомолекулярный полиэтилен и гидроксиапатит, 6 - сверхвысокомолекулярный полиэтилен и гидроксиапатит, модифицированный полиакриловой кислотой.

1. Выделение и культивирование клеток.

Выделенные из костного мозга крысы клетки прикреплялись к поверхности культурального флакона в течение 2-3 часов. Через 24 часа количество прикрепленных клеток существенно не менялось. Через 7 суток культивирования были выявлены зоны отдельно расположенных клеток, имеющих фибробластоподобную морфологию. Через 28 суток культивирования клетки в этих зонах достигали плотного монослоя и имели гомогенную морфологию. Клетки легко пересевались и обладали хорошими пролиферативными показателями.

Клетки для тест-объекта культивировали на среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в пластиковых одноразовых флаконах и в 24 или 96-луночных планшетах при 37°С в условиях насыщающей влажности в атмосфере с 5% CO₂.

Количество клеток на образцах оценивали методом фотометрии и с помощью прямого подсчета в камере Горяева после снятия раствором трипсина.

2. Оценка цитотоксичности образцов.

Для фотометрической оценки пролиферации и гибели клеток в культуре использовали МТТ-тест. МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромид) восстанавливается в митохондриях живых клеток под действием сукцинатдегидрогеназы до водонерастворимого темноокрашенного формазона. Формазон может быть эллюирован из клеток с помощью органических сольвентов (изопропанол, ДМСО, ДМФА и т.д.) Определено, что оптическая плотность эллюатов при длине волны 570 нм (максимум поглащения формазона) пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в образце.

В эксперименте по выявлению цитотоксичности образцов клетки высевали в 24-луночные платы с плотностью 50 тыс кл./лун. Через 24 часа, когда клетки распластывались, в лунки вносили образцы на 72 часа. Затем клетки инкубировали в присутствии МТТ (0,25 мг/мл, Serva, Германия) в течение 3-х часов. Формазон эллюировали с помощью DMSO в течение 30 мин при 37°С и проводили измерение оптической плотности эллюата на плашечном фотометре «ЭФОС 9305» при длине волны 570 нм. Для просчета эллюат из одной лунки 24-луночной платы переносили на 3 лунки 96-луночного планшета в объеме 100 мкл для получения статистически более достоверных результатов. Результаты трех независимых экспериментов (по три повтора на каждую точку) представлены на фиг. 1 в виде гистограммы относительных оптических плотностей эллюата для каждого образца. Контролем служили лунки с клетками без образцов. Полученные результаты позволяют заключить, что все образцы не оказывают цитотоксического действия.

3. Оценка эффективности прикрепления клеток к поверхности образцов.

Эффективность прикрепления клеток к поверхности образцов оценивалась по количеству прикрепленных клеток на поверхности образца. Использовалась следующая схема эксперимента по оценке эффективности прикрепления клеток к поверхности образцов: образцы помещали в 24-луночные платы, в лунки вносили по 2 мл суспензии клеток в конечной концентрации 50 тыс/мл. После культивирования в течение 24 часов производился подсчет количества клеток, прикрепившихся к поверхности образцов.

В результате предварительного эксперимента было подобрано оптимальное время прикрепления клеток к подложке (культуральному пластику) - 120 минут. За это время клетки тест-объекта полностью прикреплялись к поверхности и начинали распластываться. Далее эксперимент проводился по следующей схеме: образцы помещали в 24-луночные платы, на их поверхность наносили по 100 мкл суспензии клеток из расчета 50 тыс на образец. Через 120 мин образцы промывали культуральной средой, освобождаясь от неприкрепившихся клеток, и переносили в новые платы со свежей средой. Через 24 часа количество клеток на образцах оценивали с помощью МТТ-теста и стандартного подсчета в камере Горяева после снятия клеток с образцов раствором трипсина.

На фиг.2 представлены результаты стандартного подсчета клеток в трех независимых экспериментах по МТТ-тесту. Из гистограмм следует, что эффективность прикрепления клеток тестируемых культур к поверхности образца №6 значительно ниже по сравнению с другими образцами (не превышает 60% относительно контроля, за который взят материал, из которого изготовлены чашки и планшеты для выращивания клеток.

Также был произведен стандартный подсчет в камере Горяева количества клеток, снятых с каждого образца.

Оба использованных метода оценки эффективности прикрепрения клеток к образцам (МТТ-тест и подсчет количества клеток в камере Горяева) дают одинаковые результаты.

Во всех образцах, за исключением образца №6, клетки располагались равномерно по всей поверхности, а в №6 - формировали тяжи.

4. Оценка влияния образцов на эффективность пролиферации мезенхимальных стволовых клеток.

Эффективность пролиферации мезенхимальных стволовых клеток на образцах оценивалась по количеству клеток на поверхности образца. Количество мезенхимальных стволовых клеток, выращенных на тестируемых образцах, оценивалось двумя способами: прямым подсчетом в камере Горяева и с помощью МТТ-теста. Количество мезенхимальных стволовых клеток оценивалось на 7-е и 14-е сутки культивирования на поверхности тестируемых образцов. Для этого образцы помещали в 24-луночные платы, на их поверхность наносили по 100 мкл суспензии клеток из расчета 1 тыс на образец. Через 2 часа образцы промывали культуральной средой и переносили в новые платы со свежей средой. На 7-е и 14-е сутки производили подсчет клеток (с помощью МТТ-теста и в камере Горяева). Для получения суспензии клеток образцы обрабатывали последовательно растворами Версена и трипсина при 37°С. Параллельно, количество мезенхимальных стволовых клеток оценивали с помощью МТТ-теста. Для этого на 7-е и 14-ые сутки в лунки с образцами вносили МТТ (0,25 мг/мл). Через 3 часа формазан эллюировали с помощью DMSO течение 30 мин при 37°С и проводили измерение оптической плотности эллюата на плашечном фотометре «ЭФОС 9305» при длине волны 570 нм. Для просчета эллюат из одной лунки 24-луночной платы переносили на 3 лунки 96-луночного планшета в объеме 100 мкл для получения статистически более достоверных результатов.

На фиг. 3 приведены результаты трех независимых экспериментов по подсчету количества мезенхимальных стволовых клеток в камере Горяева на 7-е и 14-е сутки культивирования на поверхности тестируемых образцов. Контролем служили лунки с клетками без образцов.

Выявлено различие в эффективности пролиферации мезенхимальных стволовых клеток на конкретных образцах. Самые высокие показатели прироста мезенхимальных стволовых клеток наблюдалось на образцах №№1, 2, 5, а самый низкий - на образце №6.

На фиг.4 представлены результаты трех независимых экспериментов по оценке эффективности пролиферации мезенхимальных стволовых клеток по МТТ-тесту на 7 и 14 сутки культивирования. Контролем служили лунки с клетками без образца. Наиболее интенсивный рост клеток наблюдается на образцах №№1, 2, 5, 8, на образце №6 показатели прироста пролиферации мезенхимальных стволовых клеток были значительно ниже.

Основываясь на полученных данных, рекомендуем исключить образец №6 из дальнейшей работы.

5. Индукция остеогенной дифференцировки.

Для индукции остеогенной дифференцировки использовали основной фактор роста фибробластов в концентрации 20 нг/мл и дексаметазон в концентрации 10^-8 М.

6. Оценка дифферинцировки с помощью окраски на щелочную фосфатазу и по наличию минерализации.

Цитохимическое выявление щелочной фосфатазы проводили с использованием нафтол-АБ-фосфата и прочного синего PP.

Первые признаки остеогенной дифференцировки (позитивное окрашивание на щелочную фосфатазу) обнаружились на 21 сутки после внесения индуктора. В ходе дальнейшего культивирования эти признаки усиливались.

Осаждение минерала в матриксе регистрировали с помощью метода Косса. Клетки обрабатывали раствором 1%-водного азотнокислого серебра в течение 20 мин, промывали водой и фиксировали 2,5% раствором тиосульфата натрия. На 28 сутки отмечалось значительное окрашивание на щелочную фосфатазу и появление зон положительной импрегнации серебром по методу Косса. В это время отмечалось появление остеогенных узелков, представляющих собой трехмерные клеточные агрегаты, вокруг которых активность щелочной фосфатазы и интенсивность окрашивания по методу Косса были максимальными. В ходе дальнейшего культивирования эти признаки усиливались.

7. Экспериментальное определение остеоинтегративных свойств изучаемых пластических материалов, заселенных мезенхимальными стволовыми клетками с индуцированной остеогенной дифференцировкой, морфологическими методами.

Исследования проводили на 2 группах кроликов: экспериментальной и контрольной. В экспериментальной группе использовали отобранные образцы пластмассы, заселенные мезенхимальными стволовыми клетками с остеогенной дифференцировкой, индуцированной в течение 2 недель. В контрольной группе клеток на образцах не было. Под гексеналовым наркозом у половозрелых кроликов породы шиншилла массой около 3 кг выстригали шерсть в области края и ветви нижней челюсти справа. С соблюдением правил асептики делали разрез кожи, тупым путем обнажали ее угол и ветвь. В области угла челюсти с помощью фрезы при малых оборотах с постоянным охлаждением физиологическим раствором создавали дефект размером 5×10 мм. Дефект закрывали имплантатом, который фиксировали к кости с помощью титановых шурупов через заранее приготовленные отверстия. Мягкие ткани укладывали на место, кожу ушивали шелком. Для профилактики послеоперационных осложнений кроликам вводили антибиотики под кожу в течение 3 дней. Рана заживала первичным натяжением. Животных выводили из эксперимента через 1,3 и 6 месяцев после операции. Фрагменты нижней челюсти с имплантатами фиксировали в нейтрализованном 4% формальдегиде и изучали методом СЭМ. Для исследования рельефа минерализации в зоне нанесения повреждения фиксированные образцы помещали в холодный 5% раствор гипохлорита натрия для деорганификации. После тщательной отмывки в проточной воде их обезвоживали в растворах ацетона восходящей концентрации и высушивали. Все высушенные образцы приклеивали на столики токопроводящим клеем, напыляли медью в атмосфере аргона. Исследование проводили на микроскопе Philips SEM и ускоряющем напряжении 15 кВ.

Исследование показало, что в экспериментальной группе признаки интеграции имплантатов с костными структурами челюсти выражены лучше, чем в контроле: на поверхности заселенных клетками имплантатов формируется большее количество костных трабекул, чем на поверхности имплантатов без клеток. При этом на поверхности трабекул определяются дифференцированные остеобласты, а в костных лагунах остеоциты. Большинство таких трабикул непосредственно связаны с костными структурами подлежащей нижней челюсти.