аналоги жирных кислот для лечения воспалительных и аутоиммунных расстройств

Формула изобретения

1. Применение аналогов жирных кислот общей формулы (I):

R₁-[X_i-CH₂]_n-COOR ₂ (I)

где R₁ представляет собой С ₁-С₂₄алкен с одной или более чем одной двойной связью и/или одной или более чем одной тройной связью, или С₁-С₂₄алкин, или С₁-С ₂₄алкил либо С₁-С₂₄алкил, замещенный по одному или нескольким положениям одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁-С₄алкокси, С₁-С ₄алкилтио, С₂-С₅ацилокси или С₁-С₄алкил;

R₂ представляет собой водород или С₁-С₄алкил;

n представляет собой целое число от 1 до 12;

i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR₂;

X_i независимо друг от друга выбраны из группы, включающей в себя О, S, SO, SO₂, Se и СН₂ , и при условии, что по меньшей мере один из Х_i не является CH₂, при условии, что если R₁ представляет собой алкин, то одна из углерод-углеродных тройных связей расположена между (-1)-углеродом и (-2)-углеродом, или между (-2)-углеродом и (-3)-углеродом, или между (-3)-углеродом и (-4)-углеродом, и при условии, что если R₁ представляет собой алкен, то одна из углерод-углеродных двойных связей расположена между (-1)-углеродом и (-2)-углеродом, или между (-2)-углеродом и (-3)-углеродом,

либо их соли, пролекарства или комплекса в качестве фармацевтического средства для предупреждения и/или лечения воспалительных расстройств.

2. Применение по п.1, где соединение представляет собой тетрадецилтиоуксусную кислоту.

3. Применение по п.1, где соединение представляет собой тетрадецилселеноуксусную кислоту.

4. Применение по п.1, где соединение представляет собой алкен и содержит только одну двойную связь.

5. Применение по п.1, где соединение представляет собой алкин и содержит только одну тройную связь.

6. Применение по п.1, где воспалительное расстройство выбрано из группы, включающей в себя иммуноопосредованные расстройства, такие как ревматоидный артрит, системный васкулит, системная красная волчанка, системный склероз, дерматомиозит, полимиозит, различные аутоиммунные эндокринные расстройства (например, тиреоидит и адреналит), различные иммуноопосредованные неврологические расстройства (например, рассеянный склероз и тяжелая псевдопаралитическая миастения), различные сердечно-сосудистые расстройства (например, миокардит, застойная сердечная недостаточность, артериосклероз, и стабильная и нестабильная стенокардия, и гранулематоз Вегенера), воспалительные заболевания кишечника и колит Крона, нефрит, различные воспалительные кожные расстройства (например, псориаз, атопический дерматит и пищевая аллергия) и острое и хроническое отторжение аллотрансплантата после трансплантации органов.

7. Способ увеличения эндогенной выработки интерлейкина-10 (ИЛ-10) в клетках или тканях млекопитающего, отличающийся тем, что включает стадию введения млекопитающему, нуждающемуся в этом, эффективного количества аналогов жирных кислот общей формулы (I):

R₁ -[X_i-CH₂]_n-COOR₂ (I)

где R₁ представляет собой С₁-С ₂₄алкен с одной или более чем одной двойной связью и/или одной или более чем одной тройной связью, или С₁ -С₂₄алкин, или С₁-С₂₄алкил либо С₁-С₂₄алкил, замещенный по одному или нескольким положениям одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁ -С₄алкокси, С₁-С₄алкилтио, С ₂-С₅ацилокси или С₁-С₄ алкил;

R₂ представляет собой водород или С ₁-С₄алкил;

n представляет собой целое число от 1 до 12;

i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR₂;

X _i независимо друг от друга выбраны из группы, включающей в себя О, S, SO, SO₂, Se и СН₂, и при условии, что по меньшей мере один из Х_i не является CH ₂, при условии, что если R₁ представляет собой алкин, то одна из углерод-углеродных тройных связей расположена между (-1)-углеродом и (-2)-углеродом, или между (-2)-углеродом и (-3)-углеродом, или между (-3)-углеродом и (-4)-углеродом, и при условии, что если R₁ представляет собой алкен, то одна из углерод-углеродных двойных связей расположена между (-1)-углеродом и (-2)-углеродом, или между (-2)-углеродом и (-3)-углеродом,

либо их соли, пролекарства или комплекса.

8. Способ подавления эндогенной выработки интерлейкина-2 (ИЛ-2) в клетках или тканях млекопитающего, отличающийся тем, что включает стадию введения млекопитающему, нуждающемуся в этом, эффективного количества аналогов жирных кислот общей формулы (I):

R₁ -[x_i-CH₂]_n-COOR₂ (I)

где R₁ представляет собой С₁-С ₂₄алкен с одной или более чем одной двойной связью и/или одной или более чем одной тройной связью, или С₁ -С₂₄алкин, или С₁-С₂₄алкил либо С₁-С₂₄алкил, замещенный по одному или нескольким положениям одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁ -С₄алкокси, С₁-С₄алкилтио, C ₂-С₅ацилокси или С₁-С₄ алкил;

R₂ представляет собой водород или С ₁-С₄алкил;

n представляет собой целое число от 1 до 12;

i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR₂;

X _i независимо друг от друга выбраны из группы, включающей в себя О, S, SO, SO₂, Se и СН₂, и при условии, что по меньшей мере один из Х_i не является СН ₂, при условии, что если R₁ представляет собой алкин, то одна из углерод-углеродных тройных связей расположена между (-1)-углеродом и (-2)-углеродом, или между (-2)-углеродом и (-3)-углеродом, или между (-3)-углеродом и (-4)-углеродом, и при условии, что если R₁ представляет собой алкен, то одна из углерод-углеродных двойных связей расположена между (-1)-углеродом и (-2)-углеродом, или между (-2)-углеродом и (-3)-углеродом,

либо их соли, пролекарства или комплекса.

9. Способ по п.7 или 8, где указанные клетки или ткани млекопитающего находятся в млекопитающем.

10. Способ по п.7 или 8, где соединение представляет собой тетрадецилтиоуксусную кислоту.

11. Способ по п.7 или 8, где соединение представляет собой тетрадецилселеноуксусную кислоту.

12. Способ по п.7 или 8, где у указанного млекопитающего развито или имеется предрасположенность к развитию аутоиммунного и/или воспалительного расстройства.

13. Способ по п.7 или 8, где указанное расстройство выбрано из группы, включающей в себя иммуноопосредованные расстройства, такие, как ревматоидный артрит, системный васкулит, системная красная волчанка, системный склероз, дерматомиозит, полимиозит, различные аутоиммунные эндокринные расстройства (например, тиреоидит и адреналит), различные иммуноопосредованные неврологические расстройства (например, рассеянный склероз и тяжелая псевдопаралитическая миастения), различные сердечно-сосудистые расстройства (например, миокардит, застойная сердечная недостаточность, артериосклероз, и стабильная и нестабильная стенокардия, и гранулематоз Вегенера), воспалительные заболевания кишечника и колит Крона, нефрит, различные воспалительные кожные расстройства (например, псориаз, атопический дерматит и пищевая аллергия) и острое и хроническое отторжение аллотрансплантата после трансплантации органов.

14. Способ по п.7 или 8, при котором соединение вводят млекопитающему, которое характеризуется избыточной выработкой и/или повышенными уровнями ИЛ-1 и фактора некроза опухоли (ФНО).

15. Способ по п.7 или 8, при котором соединение вводят млекопитающему, которое характеризуется недостаточной выработкой ИЛ-10.

16. Применение аналогов жирных кислот общей формулы (I):

R₁-[x_i-CH₂]_n -COOR₂ (I)

- где R₁ представляет собой С₁-С₂₄алкен с одной или более чем одной двойной связью и/или одной или более чем одной тройной связью, или С₁-С₂₄алкин, или С₁ -С₂₄алкил либо С₁-С₂₄алкил, замещенный по одному или нескольким положениях одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁-С₄алкокси, С₁-С₄алкилтио, С₂-С₅ ацилокси или С₁-С₄алкил;

R₂ представляет собой водород или С₁-С₄алкил;

n представляет собой целое число от 1 до 12;

i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR ₂;

X_i независимо друг от друга выбраны из группы, включающей в себя О, S, SO, SO₂, Se и СН ₂, и при условии, что по меньшей мере один из Х _i не является СН₂, при условии, что если R ₁ представляет собой алкин, то одна из углерод-углеродных тройных связей расположена между (-1)-углеродом и (-2)-углеродом, или между (-2)-углеродом и (-3)-углеродом, или между (-3)-углеродом и (-4)-углеродом, и при условии, что если R₁ представляет собой алкен, то одна из углерод-углеродных двойных связей расположена между (-1)-углеродом и (-2)-углеродом, или между (-2)-углеродом и (-3)-углеродом,

либо их соли, пролекарства или комплекса в качестве фармацевтического средства для ингибирования пролиферации стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).

17. Применение по п. 16, где клетки стимулируют веществом, выбранным из группы, включающей в себя фитогемагглютинин (ФГА), липополисахариды (ЛПС) и ФНО.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к аналогам жирных кислот, которые могут быть использованы для лечения и/или предупреждения воспалительных расстройств. Кроме того, изобретение также относится к способам увеличения эндогенной выработки интерлейкина-10 (ИЛ-10) и подавления выработки интерлейкина-2 в клетках или тканях млекопитающего. Изобретение также относится к способу ингибирования пролиферации стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови.

Предшествующий уровень техники

Интерлейкины, интерфероны, колониестимулирующие факторы и фактор некроза опухоли (ФНО) являются примерами группы разнообразных многофункциональных белков, называемых цитокинами. Цитокины представляют собой класс секретируемых растворимых белков, обычно присутствующих в очень низкой концентрации во множестве клеток. Лимфоидные, воспалительные гемопоэтические и другие клетки, такие как клетки соединительной ткани (например, фибробласты, остеобласты), секретируют множество цитокинов, которые регулируют иммунный, воспалительный, репаративный ответы и ответ острой фазы посредством контроля клеточной пролиферации, дифференциации и функций эффекторов. Воздействия цитокинов опосредованы связыванием с рецепторами, обладающими высоким сродством, в специфических типах клеток.

Важным цитокином является ИЛ-10, 35-40 кДа пептид, вырабатываемый хелперными Т-клетками, В-клетками, моноцитами, макрофагами и другими типами клеток. In vitro ИЛ-10 продемонстрировал иммунодепрессивные свойства, что подтверждается его способностью подавлять выработку цитокинов, включая ИЛ-1 и ФНО.

ИЛ-10 также ингибирует активацию других воспалительных цитокинов, и поэтому обладает сильной противовоспалительной активностью.

Новый интерес представляет введение ИЛ-10 при лечении некоторых состояний, которые характеризуются избыточной выработкой ИЛ-1 и ФНО. Такие заболевания или состояния включают в себя расшатывание эндопротезов суставов, воспаление, диабет, рак, реакции «трансплантат против хозяина», вирусные, грибковые и бактериальные инфекции, липополисахаридный эндотоксиновый бактериально-токсический шок, заболевания сниженной функции костного мозга, тромбоцитопению, остеопороз, спондилоартропатии, болезнь Педжета, воспалительное заболевание кишечника, артрит, остеоартрит, аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, системная красная волчанка и коллагенозы.

Например, было показано, что очищенный ИЛ-10 in vitro подавляет некоторые типы вирусных инфекций. В патенте США №5,665,345 описан способ ингибирования репликации вируса иммунодефицита человека, ретровирусов и саркомы Калоши в клетках человека путем введения ИЛ-10.

ИЛ-10 также был предложен для применения в лечении некоторых видов рака. В патенте США №5,570,190 описано введение экзогенного ИЛ-10 для лечения млекопитающих, страдающих от острого миелогенного лейкоза и острого лимфолейкоза. Сообщается, что ИЛ-10 вводят либо в очищенной, либо в рекомбинантной форме, и, как полагают, он ингибирует пролиферацию бластных клеток при остром лейкозе.

Аналогично, было показано, что ИЛ-10 ингибирует метастазирование в костный мозг у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом.

Указанные выше традиционные подходы к лечению состояний, которые характеризуются избыточной выработкой ИЛ-1 и ФНО, ограничены внутривенным введением экзогенного очищенного или рекомбинантного ИЛ-10. Поскольку ИЛ-10 является белком, его трудно ввести внутривенно млекопитающему, вследствие того, что белки часто выщелачиваются из раствора и налипают на пластмассу или стекло, используемые в наборах для внутривенного введения. Также белки часто являются несовместимыми и осаждаются при смешивании с физиологическими растворами, такими как декстроза или солевой раствор. Кроме того, пероральный и местный пути введения непригодны для ИЛ-10. Пероральный путь является непригодным, поскольку белок разрушается в желудочно-кишечном тракте.

Ни один из вышеуказанных подходов не предлагает увеличивать эндогенную выработку ИЛ-10 у млекопитающих для профилактики и лечения заболеваний или состояний.

Кроме того, известно, что ИЛ-10 является мощным дезактиватором макрофагов и Т-клеток, и недостаточная выработка вовлечена в различные аутоиммунные и воспалительные расстройства.

Настоящее исследование показывает, что ТТА увеличивает выработку ИЛ-10, стимулированную как липополисахаридами (ЛПС), так и фитогемагглютинином (ФГА), и подавляет выработку ИЛ-2, стимулированную ФГА, в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) от здоровых доноров крови. Это может иметь несколько значений. Во-первых, эти данные свидетельствуют о заметном противовоспалительном суммарном воздействии ТТА как посредством увеличения высвобождения противовоспалительного цитокина ИЛ-10, так и посредством подавления высвобождения воспалительного цитокина ИЛ-2. Во-вторых, данные, полученные авторами изобретения, свидетельствуют о том, что ТТА может регулировать активацию как моноцитов (то есть, стимуляцию ЛПС), так и лимфоцитов (то есть, стимуляцию ФГА). Наконец, действие ТТА на активированные РВМС от здоровых доноров крови in vitro может отображать положение в различных группах пациентов, которые характеризуются повышенной воспалительной активацией in vivo. Фактически, ex vivo активированные РВМС от здоровых контрольных групп могут представлять собой подходящие клетки-мишени для терапевтического воздействия in vivo при различных воспалительных расстройствах.

Подробное описание изобретения

В настоящей заявке на патент описано, что предпочтительное соединение по изобретению, то есть тиозамещенная жирная кислота, тетрадецилтиоуксусная кислота (ТТА), регулирует высвобождение воспалительных (то есть, ИЛ-2, ИЛ-1 и ФНО) и противовоспалительных (то есть, ИЛ-10) цитокинов в культивируемой линии клеток РВМС.

Более конкретно, в настоящем изобретении описано, что ТТА заметно подавляет высвобождение ИЛ-2, стимулированное ФГА, а также увеличивает высвобождение ИЛ-10, стимулированное ФГА.

Эти два воздействия дают в сумме сильное противовоспалительное воздействие, и, таким образом, ожидается, что соединения по настоящему изобретению будут интересными соединениями для лечения и/или предупреждения расстройств, связанных с воспалением.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению аналогов жирных кислот общей формулы (I):

R₁-[x_i -CH₂]_n-COOR₂ (I)

- где R₁ представляет собой:

- С₁ -С₂₄алкен с одной или более чем одной двойной связью и/или одной или более чем одной тройной связью, или

- С ₁-С₂₄алкин, или

- С₁-С ₂₄алкил либо С₁-С₂₄алкил, замещенный по одному или нескольким положениях одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁-С₄алкокси, С₁-С ₄алкилтио, С₂-С₅ацилокси или С₁-С₄алкил, и

- где R₂ представляет собой водород или С₁-С₄алкил, и

- где n представляет собой целое число от 1 до 12, и

- где i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR₂, и

- где X_i независимо друг от друга выбраны из группы, включающей в себя О, S, SO, SO₂, Se и СН₂, и

- при условии, что по меньшей мере один из Х_i не является СН₂ ,

- при условии, что если R₁ представляет собой алкин, то одна из углеродуглеродных тройных связей расположена между (-1)-углеродом и (-2)-углеродом, или между (-2)-углеродом и (-3)-углеродом, или между (-3)-углеродом и (-4)-углеродом, и

- при условии, что если R₁ представляет собой алкен, то одна из углеродуглеродных двойных связей расположена между (-1)-углеродом и (-2)-углеродом, или между (-2)-углеродом и (-3)-углеродом,

либо их соли, пролекарства или комплекса для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или предупреждения воспалительных расстройств.

Более конкретно, изобретение относится к способам увеличения эндогенной выработки интерлейкина-10 (ИЛ-10) и подавления выработки интерлейкина-2 в клетках или тканях млекопитающего.

Изобретение также относится к способу ингибирования пролиферации стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови.

Предпочтительные сейчас воплощения настоящего изобретения относятся к соединениям тетрадецилтиоуксусной кислоте (ТТА) и тетрадецилселеноуксусной кислоты (TSA).

Надписи к графическим материалам

Фиг.1. Воздействие различных концентраций ТТА на пролиферацию РВМС.

Фиг.2. Воздействие различных концентраций ТТА на высвобождение ИЛ-10 (А), ИЛ-2 (Б), ФНО (В) и ИЛ-1 (Г) в супернатантах РВМС.

Фиг.3. Воздействие ФНО (10 нг/мл) одного или в сочетании с различными концентрациями ТТА на высвобождение ИЛ-10 (А) и ИЛ-1 (Б) в супернатантах РВМС.

Фиг.4. Воздействие ИЛ-2 (10 нг/мл) и анти-ИЛ-10 (5 мкг/мл) на ТТА-опосредованное ингибирование пролиферации РВМС, стимулированной ФГА.

Фиг.5. Воздействие ТТА на тяжесть экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у крыс.

Введение соединений по настоящему изобретению

В качестве фармацевтического лекарственного средства соединения по настоящему изобретению можно вводить непосредственно млекопитающему любым подходящим способом, в том числе парентерально, интраназально, перорально или посредством абсорбции через кожу. Их можно вводить местно или системно. Конкретный путь введения каждого агента будет зависеть, например, от истории болезни млекопитающего.

Кроме того, соединения по настоящему изобретению соответствующим образом вводят в сочетании с другими способами лечения для борьбы или предупреждения воспалительных и аутоиммунных расстройств.

Изобретение можно более полно понять при обращении к следующим примерам. Их не следует, однако, истолковывать как ограничение объема изобретения.

Экспериментальный раздел

Пример 1. Получение и характеристика соединений

Синтез аналогов жирных кислот, замещенных по положению 3

Соединения, используемые согласно настоящему изобретению, где заместитель Х_i=3 представляет собой атом серы или атом селена, можно получить согласно следующей общей методике:

Х представляет собой атом серы:

Тио-замещенное соединение, используемое согласно настоящему изобретению, можно получить при помощи общей методики, указанной ниже:

Соединение, содержащее серу, а именно, тетрадецилтиоуксусную кислоту (ТТА), (СН₃-(СН₂)₁₃-S-СН ₂-СООН), получали, как показано в ЕР-345.038.

Х представляет собой атом селена:

Селено-замещенное соединение, используемое согласно настоящему изобретению, можно получить при помощи следующей общей методики:

1. Алкил-Гал+KSeCNАлкил-SeCN...

2. Алкил-SeCN+ВН₄ ^-Алкил-Se ^-

3. Алкил-Se^-+O₂Алкил-Se-Se-Алкил

Это соединение тщательно очищали посредством кристаллизации из этанола или метанола.

5. Алкил-Se^-+Гал-СН₂-СООНАлкил-Se-CH ₂-СООН

Конечное соединение, например, когда алкил представляет собой тетрадецил, (СН₃-(СН ₂)₁₃-Se-СН₂-СООН (тетрадецилселеноуксусную кислоту (TSA)), можно очищать посредством кристаллизации из диэтилового эфира и гексана.

Другие соединения по настоящему изобретению можно синтезировать, как показано в патентных заявках заявителя PCT/NO 99/00135 и NO 20001123.

Пример 2

Пролиферация лимфоцитов

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) от доноров (n=5) получали из гепаринизированной крови путем градиентного центрифугирования с использованием Isopaque-Ficoll (Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Осло, Норвегия) в течение 1 часа после забора крови. РВМС ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 2 мМ L-глутамина и 25 мМ буфера HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота) (Gibco BRL, Paisley, Соединенное Королевство Великобритании и Северной Ирландии) с добавлением 10% нагретой инактивированной смешанной сыворотки человека АВ⁺ (питательная среда). Уровень эндотоксинов в питательной среде, реагентов и стимуляторов составил менее 10 пг/мл (Количественный хромогенный тест с лизатом амебоцитов краба рода Limulus, BioWhittaker, Inc., Walkerswille, MD).

Процент полинуклеарных клеток (PMNC) (10⁶ клеток/мл) инкубировали в 96-луночных титрационных микропланшетах с плоским дном (200 мкл/лунка; Costar, Cambridge, MA) только в среде или с добавлением одного фитогемагглютинина (ФГА; Murex Diagnostics Ltd, Dartford, Соединенное Королевство Великобритании и Северной Ирландии; конечная концентрация 1:100) или с добавлением к нему различных концентраций ТТА. Бычий сывороточный альбумин (БСА, Calbiochem, La Jolla, CA) использовали в качестве отрицательного контроля для ТТА (носитель). В некоторых экспериментах к культурам клеток перед стимуляцией также добавляли нейтрализующий моноклональный античеловеческий интерлейкин (ИЛ)-10 (конечная концентрация 5 мкг/мл; Endogen, Cambridge, MA) или рекомбинантный человеческий ИЛ-2 (конечная концентрация 10 нг/мл; R&D Systems, Minneapolis, MN). Через 48 часов клетки обрабатывали 1 мкКи ³H-тимидина (Amersham International plc., Little Chalfont, Соединенное Королевство Великобритании и Северной Ирландии) и через 16 часов культуры собирали на стеклянные фильтровальные пластины, используя автоматический многоячейковый харвестер (Skatron, Lier, Норвегия). Включение ³H-тимидина определяли посредством жидкостной сцинтилляции, подсчитывая число импульсов в минуту (cpm).

Результаты

Несмотря на то, что введение только ТТА не оказывало воздействия на пролиферацию лимфоцитов, ТТА заметно подавляла стимулированную ФГА пролиферацию РВМС дозо-зависимым образом (˜60% снижение; фиг.1). Такое подавляющее воздействие наблюдали у всех пяти доноров крови. В отличие от этого при введении только носителя (БСА) не проявлялось никакого воздействия на стимулированную ФГА пролиферацию РВМС (фиг.1).

Пример 3

Высвобождение цитокинов в супернатантах РВМС

РВМС (10⁶ клеток/мл) инкубировали в 96-луночных титрационных микропланшетах с плоским дном (200 мкл/ячейка; Costar) только в среде (смотри выше) или с ФГА (конечная концентрация 1:100), липополисахаридом (ЛПС) из E.coli O26:B6 (конечная концентрация 10 нг/мл; Sigma, St. Louis, МО) или фактором некроза опухоли (ФНО) (конечная концентрация 10 нг/мл; R&D Systems) с добавлением или без добавления различных концентраций ТТА. БСА использовали в качестве отрицательного контроля для ТТА (носитель). Супернатанты без клеток собирали через 20 часов и хранили при -80°С.

Иммуноферментные анализы с аффинной хроматографией (ИФА)

Концентрацию цитокинов в супернатантах РВМС анализировали посредством ИФА в соответствии с описанием изготовителя (ИЛ-1 and ИЛ-10: CLB, Амстердам, Нидерланды; ИЛ-2: R&D Systems).

Статистический анализ

Для определения воздействия ТТА (или БСА) на различные параметры использовали Т-критерий для парных выборок. Значения Р (двусторонние) считали значимыми при величине менее 0,05.

Результаты

Воздействие ТТА на уровни цитокинов в супернатантах РВМС

Как показано на фиг.2, добавление только ТТА не оказывало воздействия на выработку ни одного из цитокинов ИЛ-2, ИЛ-1, ИЛ-10 и ФНО.

Однако некоторые значимые данные были получены при добавлении ТТА к культурам клеток в сочетании с ФГА или ЛПС.

Во-первых, ТТА заметно подавляла стимулированное ФГА высвобождение ИЛ-2 дозо-зависимым образом (˜75% снижение) (фиг.2).

Во-вторых, в отличие от этого подавляющего воздействия, ТТА дозо-зависимым образом заметно увеличивала как стимулированное ЛПС (˜3-кратное повышение), так, в особенности, и стимулированное ФГА (˜11-кратное повышение) высвобождение противовоспалительного цитокина ИЛ-10 (фиг.2).

В-третьих, в отличие от этих сильных воздействий на уровни ИЛ-2 и ИЛ-10, ТТА не оказывала или оказывала лишь ограниченное воздействие на стимулированное ЛПС высвобождение ФНО и ИЛ-1 (фиг.2). Никаких воздействий носителя (БСА) на стимулированное либо ФГА, либо ЛПС высвобождение цитокинов не наблюдалосьь (фиг.2).

В заключение, ТТА оказывает некоторые воздействия на стимулированное ЛПС и, в особенности, на стимулированное ФГА высвобождение цитокинов в РВМС с сопутствующими противовоспалительными суммарными воздействиями.

Воздействие ТТА на стимулированное ФНО высвобождение цитокинов в супернатантах РВМС

Жирные кислоты, как сообщалось, регулируют различные ФНО-опосредованные воздействия. ФНО может вызывать выработку других цитокинов, таких как ИЛ-10 и ИЛ-1 (11, 12), и, поэтому, авторы изобретения изучили, может ли ТТА регулировать вызванное ФНО высвобождение этих цитокинов из РВМС 5 здоровых доноров крови. Примечательно, что в то время как ТТА не оказывала воздействия на стимулированное ЛПС высвобождение ФНО (фиг.2), ТТА заметно увеличивала стимулированное ФНО высвобождение как ИЛ-1 (˜5-кратное увеличение), так, в особенности, и ИЛ-10 (˜11-кратное увеличение) (фиг.3). Эти данные свидетельствуют о том, что ТТА может значительно увеличивать стимулированное ФНО высвобождение цитокинов из РВМС особенно с увеличивающимся воздействием на высвобождение ИЛ-10.

Пример 4

Воздействие ИЛ-2 и анти-ИЛ-10 на ТТА-опосредованное ингибирование пролиферации лимфоцитов

Известно, что ИЛ-2 и ИЛ-10 увеличивают и ингибируют пролиферацию лимфоцитов соответственно. Поэтому, авторы изобретения изучили связь антипролиферативного воздействия ТТА на стимулированную ФГА пролиферацию РВМС с ТТА-опосредованным воздействием на эти цитокины (смотри выше). Однако добавление анти-ИЛ-10 к культурам клеток не оказывало воздействия, а добавление ИЛ-2 оказывало лишь ограниченное нейтрализующее воздействие на ТТА-опосредованное ингибирование пролиферации лимфоцитов (фиг.4). Таким образом, по-видимому, антипролиферативные и противовоспалительные воздействия ТТА по меньшей мере частично представляют собой различные биологические механизмы.

Выводы

Как показано в экспериментальном разделе, ТТА оказывает некоторые воздействия на высвобождение цитокинов из активированных РВМС с заметным увеличением уровней ИЛ-10, сопровождаемым снижением уровней ИЛ-2. Это способствует противовоспалительным суммарным воздействиям, и, таким образом, ожидается, что соединения по настоящему изобретению могут быть использованы для регулирования воспалительных процессов и, таким образом, могут быть использованы в качестве лекарственных средств для лечения и/или предупреждения воспалительных расстройств.

Кроме того, авторы изобретения показали, что ТТА усиливает стимулирующие цитокины воздействия ФНО на эти клетки особенно с увеличивающимся воздействием на уровни ИЛ-10.

Наконец, ТТА также значительно подавляла пролиферацию РВМС, и это антипролиферативное воздействие не приводило к повышенному апоптозу, и, по-видимому, по меньшей мере частично отличалось от противовоспалительных воздействий ТТА.

Данные, полученные авторами изобретения, свидетельствуют о сильных противовоспалительных и антипролиферативных воздействиях ТТА в активированных РВМС у людей.

Существует несколько расстройств, при которых повышенные уровни ИЛ-10 и пониженные уровни ИЛ-2 могут представлять терапевтическое значение. Они включают в себя широкий диапазон иммуноопосредованных расстройств, таких как ревматоидный артрит, системный васкулит, системная красная волчанка, системный склероз, дерматомиозит, полимиозит, различные аутоиммунные эндокринные расстройства (например, тиреоидит и адреналит), различные иммуноопосредованные неврологические расстройства (например, рассеянный склероз и тяжелая псевдопаралитическая миастения), различные сердечно-сосудистые расстройства (например, миокардит, застойная сердечная недостаточность, артериосклероз, и стабильная и нестабильная стенокардия, и гранулематоз Вегенера), воспалительные заболевания кишечника и колит Крона, нефрит, различные воспалительные кожные расстройства (например, псориаз, атопический дерматит и пищевая аллергия) и острое и хроническое отторжение аллотрансплантата после трансплантации органов.

Известно, что ИЛ-10 является мощным дезактиватором макрофагов и Т-клеток, и недостаточная выработка ИЛ-10 приводила к различным аутоиммунным и воспалительным расстройствам. Таким образом, ожидают, что соединение по настоящему изобретению можно использовать для предупреждения и/или лечения аутоиммунных и воспалительных расстройств.

Все аутоиммунные модели ревматоидного артрита, тиреоидита, коллаген-индуцированного артрита и экспериментального аллергического энцефаломиелита свидетельствуют об отрицательной регуляторной роли для ИЛ-10 при ограничении воспаления и иммунопатологии. Более того, у мышей с заданным разрывом в гене ИЛ-10 самопроизвольно развивается генерализованный энтероколит. У людей колит Крона и псориаз могут даже поддаваться лечению системно вводимым ИЛ-10. Наконец, недавно также было обнаружено, что ИЛ-10 обладает защитными воздействиями на развитие атеросклероза и вирусного миокардита у мышей. Таким образом, лечебные воздействия, которые увеличивают уровни ИЛ-10, могут представлять большой интерес в лечении вышеупомянутых и других аутоиммунных и воспалительных расстройств, и предполагается, что соединения по настоящему изобретению обладают такими свойствами.

Кроме того, авторы изобретения показали, что ТТА заметно увеличивала вызванный ФНО уровень ИЛ-10, и такие противовоспалительные свойства при терапевтическом использовании могут потенциально представлять собой защиту от вредного воздействия ФНО.

Авторы изобретения показали также, что введение ТТА снижало тяжесть экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у крыс.