питательная среда для культивирования бактерий haemophilus influenzae типа b

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b, содержащая KH₂PO₄, К ₂HPO₄, NaCl, MgCl₂, CaCl ₂, НАД, гемин, тиамин, пантотенат кальция, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит глюкозу, аминопептид и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:

КН2PO4	2,720 г
К2HPO 4	3,480 г
NaCl	5,8 г
MgCl2	0,2 г
CaCl2	0,022 г
Глюкоза	5,000 г
НАД	0,004 г
Гемин	0,01 г
Пантотенат кальция	0,004 г
Тиамин	0,004 мл
Аминопептид	300 мл
Дистиллированная вода	до 1 л

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к общей и медицинской микробиологии, а именно к получению питательной среды для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b.

Haemophilus influenzae типа b (Hib) часто является причиной острого менингита, эпиглоттита, артрита, остеомиелита, пневмонии, целлюлита, пиелонефрита и перикардита у детей. Воздушно-капельный механизм передачи, трудности этиотропной терапии, связанные с резистентностью Hib-бактерий, позволяют считать единственным эффективным средством борьбы с этой инфекцией и защиты от нее детей специфическую вакцинопрофилактику.

Вакцины против Hib производят на основе капсульного полисахарида (полирибозил-рибитолфосфата - ПРФ). ПРФ является антигеном и способен индуцировать иммунный ответ по Т-независимому типу. Для обеспечения полноценного ответа у детей младшего возраста ПРФ конъюгирует с белком-носителем, что придает полисахариду свойств Т-зависимого антигена.

В настоящее время в большинстве стран, получивших подтверждение эпидемиологической значимости инфекционных заболеваний, вызванных Hib и включивших вакцинацию против Hib-инфекции в календарь прививок, специфическая вакцинопрофилактика позволила ликвидировать тяжелые генерализованные формы гемофильных заболеваний, а носительство выявляется лишь у непривитых (Демина А.А. Эпидемиология инвазивных заболеваний, обусловленных Haemophilus influenzae типа b. Международный медицинский журнал. 1998, 4:315-322).

В России оценка эпидемиологической значимости указанных заболеваний до сих пор не проводилась, и отечественная вакцина против Hib-заболеваний отсутствует.

Для разработки отечественных высокочувствительных диагностических тестов, и тем более для создания вакцины, необходимы препараты чистого капсульного полисахарида Н.influenzae типа b.

Традиционно для выращивания Haemophilus influenzae типа b используют полноценные питательные среды - сердечно-мозговой бульон и среду с казаминовыми кислотами (Difco, США). Ориентировочная стоимость 1 л сердечно-мозгового бульона (без учета стоимости факторов роста и витаминов) составляет 183 руб., среды с казаминовыми кислотами - 190 руб. по ценам 2003 г.

При выращивании Hib на полноценных питательных средах в культуральном супернатанте после прекращения синтеза и отделения в среду культивирования капсульного полисахарида содержится около 50% белков. Процесс выделения капсульного полисахарида включает его осаждение из культурального супернатанта цетавлоном с последующей экстракцией из осадка растворами солей с возрастающей ионной силой. Вместе с полисахаридом осаждаются гидрофильные белки и нуклеиновые кислоты. Увеличение концентрации раствора соли, с одной стороны, приводит к получению полисахарида большей молекулярной массы, с другой - повышает содержание белка в препарате (Anderson P., Smih D.H. Isolation of Capsular Polysaccharide from Culture Supernatant of Haemophillus influenzae Type b, Inf and immun. 1977, Feb: 472-477).

Избыточное содержание в полноценных питательных средах питательных веществ и/или наличие в них каких-то специфических ингибиторов приводит к снижению синтеза капсульного полисахарида Hib.

Известна синтетическая питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b, содержащая аминокислоты и пептиды, витамины и факторы роста, минеральные соли, буферы, ПАВ, стабилизирующие коллоиды и другие компоненты (Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2001, №3).

Ориентировочная стоимость синтетической питательной среды составляет около 180 руб. за 1 л. Из 31 компонента, входящего в ее состав 12 - аминокислоты. Приготовление синтетической питательной среды трудоемко, т.к. состоит из 22 этапов, связанных с разными требованиями к способам стерилизации различных компонентов.

Техническим результатом заявленной питательной среды является простота процесса приготовления, удешевление ее стоимости, а также получение при культивировании на ней Haemophilus influenzae типа b чистого капсульного полисахарида, не содержащего примеси белков питательной среды.

Для достижения указанного результата питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b, содержащая КН₂РО₄, К₂ НРО₄, NaCl, MgCl₂ CaCl₂, глюкозу, НАД, гемин, тиамин, пантотенат кальция, согласно изобретению, дополнительно содержит аминопептид при следующем соотношении компонентов на 1 л:

NaCl	5,8 г
MgCl 2	0,2 г
CaCl2	0,022 г
КН2 PO4	2,720 г
К2HPO 4	3,480 г
глюкоза	5,000 г
гемин	0,01 г
НАД	0,004 г
пантотенат кальция	0,004 г
тиамин	0,004 мл
аминопептид	300 мл

Сущность изобретения иллюстрируется на следующем примере.

Пример. Для получения полусинтетической питательной среды для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b предварительно готовят растворы, которые на последнем этапе смешивают:

1) раствор солей

NaCl - 58 г

MgCl_2· 6Н₂О - 9,22 г

CaCl_2·2Н₂ О - 0,294 г

Доводят до 1 л дистиллированной водой до рН 7.0

2) 1 М калий-фосфатный буфер.

КН₂ PO₄ - 136 г

К₂HPO₄ - 174 г

Доводят до 1 л дистиллированной водой.

3) Раствор гемина в фосфатном буфере.

50 г гемина растворяют в 12,5 мл 0,5 М раствора К₂HPO₄, добавляют 86 мл дистиллированной воды и 1,6 мл раствора 1М КН₂PO _4.

4) Раствор НАД и витаминов.

Тиамина хлорид 5% - 4 мл

Пантотенат кальция - 0,2 г

НАД - 0,2 г

Доводят дистиллированной водой до 20 мл.

5) Раствор глюкозы

Глюкоза - 25 г

Доводят дистиллированной водой до 100 мл

6) Растворы солей (1), калий-фосфатного буфера (2), гемина в фосфатном буфере (3) и глюкозы (5) стерилизуют автоклавированием.

7) Раствор НАД и витаминов стерилизуют фильтрованием.

8) Смешивают стерильные растворы:

100 мл раствора солей (1), 20 мл 1 М калий-фосфатного буфера (2), 20 мл раствора гемина (3), 4 мл разведенного в 10 раз раствора НАД с витаминами (4), 20 мл 25% раствора глюкозы (5) и добавляют 300 мл раствора аминопептида.

Доводят объем дистиллированной водой до 1 л. РН готовой среды 7.0-7.7.

В результате получают питательную среду с содержанием следующих компонентов на 1 л:

NaCl	5,8 г
MgCl 2	0,2 г
CaCl2	0,022 г
КН2 PO4	2,720 г
К2HPO 4	3,480 г
глюкоза	5,000
гемин	0,01
НАД	0,004
пантотенат кальция	0,004
тиамин	0,004 мл
аминопептид	300 мл

Полученная полусинтетическая питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae типа b отличается от известной питательной среды простотой приготовления, невысокой стоимостью и отсутствием компонентов, мешающих получению чистого препарата капсульного полисахарида. Заявленная питательная среда состоит из 11 компонентов, ее приготовление включает 8 этапов, ориентировочная стоимость 1 л такой питательной среды составляет 20 рублей.