стероидные соединения, способ селективной модификации, фармацевтическая композиция

Формула изобретения

1. Стероидное соединение формулы (I)

где пунктирные связи представляют собой необязательные двойные связи;

R₆ представляет собой Н, =СН ₂ или –СН₃ или –СН₂-СН₃ ;

R₇ представляет собой Н, С_1-4-алкил, С_2-5-алкенил или С_2-5-алкинил;

R ₁₁ представляет собой Н, C_1-4-алкил, С_2-4 -алкенил, С_2-4-алкинил или С_1-4-алкилиден;

Е представляет собой образованное вместе с атомами углерода 16 и 17 стероидной структуры пяти- семичленное кольцо, причем указанное кольцо представляет собой в цисположении по отношению к стероидной структуре, необязательно содержащее от одной до двух внутрициклических связей;

или его пролекарство.

2. Стероидное соединение по п.1, отличающееся тем, что R₆ представляет собой Н, R₇ представляет собой С_1-3-алкил, кольцо Е представляет собой пяти- или шестичленное кольцо, не содержащее двойных связей и содержащее гидроксигруппу в положении 22 S стереоконфигурации.

3. Стероидное соединение по п.1 или 2, отличающееся тем, что соединение имеет формулу 2

и название (7, 16,17, 22S)-7-пропил-16,24-цикло-19,21-динорхола-1,3,5(10)-триен-3,17,22-триол.

4. Стероидное соединение по любому из пп.1-3 для применения в терапии.

5. Способ селективной модификации активности эстрогеновых рецепторов путем взаимодействия соединения согласно любому из пп.1-3 с эстрогеновыми рецепторами.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что способ применяется с нетерапевтическими целями.

7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что способ представляет собой селективную модификацию активности эстрогеновых рецепторов путем взаимодействия соединения согласно любому из пп.1-3 с эстрогеновыми рецепторами .

8. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что способ представляет собой селективную модификацию активности эстрогеновых рецепторов путем взаимодействия соединения согласно любому из пп.1-3 с эстрогеновыми рецепторами .

9. Стероидное соединение по любому из пп.1-3 для получения лекарственного препарата для селективной терапии, связанной с эстрогеновыми рецепторами.

10. Стероидное соединение по п.9, отличающееся тем, что селективной терапией, связанной с эстрогеновыми рецепторами, является профилактика или лечение предменопаузных или постменопаузных состояний, вызывающих жалобы.

11. Стероидное соединение по п.9, отличающееся тем, что селективная терапия, связанная с эстрогеновыми рецепторами, представляет собой контрацепцию.

12. Фармацевтическая композиция, обладающая антиэстрогенной активностью, содержащая стероидное соединение по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к стероидным соединениям с дополнительным кольцом Е, связанным с кольцом D стероидной структуры, обладающим эстрогенной активностью.

Существует постоянный интерес к новым соединениям, обладающим сродством к эстрогеновым рецепторам. Это происходит в результате открытия двух различных подтипов рецепторов, обозначенных ER и ER (см. Mosselman et al., FEBS Letters 392 (1996) 49-53, а также ЕР-А-0798378). Соединения, которые селективны по отношению к данным подтипам рецептора, могут обеспечить более селективное лечебное воздействие, связанное эстрогеновыми рецепторами. Преимущества, например, могут быть получены в результате различного распределения подтипов рецептора в тканях человека. Это дает возможность проводить лечение с меньшим количеством побочных эффектов, связанных с эстрогеном. Примерами терапевтического применения эстрогена, которое может быть улучшено при применении селективных соединений, являются контрацепция, лечение проявлений менопаузы, остеопороза и лечение эстрогензависимых опухолей.

В ЕР 0869132 описаны эстрогенные стероидные соединения, имеющие формулу (1):

где:

пунктирные связи представляют собой необязательные двойные связи;

R₆ представляет собой Н, =СН ₂ или –СН₃ или -СН₂-СН₃ ;

R₇ представляет собой Н, C_1-4-алкил, С_2-5-алкенил или С_2-5-алкинил, где алкильная, алкенильная или алкинильная группа может быть замещена 1-3 атомами галогена, независимо выбранными из группы атомов фтора и хлора;

R₁₁ представляет собой Н, C_1-4-алкил, С_2-4-алкенил, С_2-4-алкинил или C_1-4 -алкилиден, где алкильная, алкенильная, алкинильная или алкилиденовая группа может быть замещена 1-3 атомами галогена, независимо выбранными из группы атомов фтора и хлора;

Е представляет собой вместе с атомами углерода 16 и 17 стероидной структуры четырех- - семичленное кольцо, причем указанное кольцо является в цис-положении по отношению к стероидной структуре, необязательно содержит от одной до двух внутрициклических связей и замещено R_E, который имеет ряд значений.

Далее в ЕР 0869132 раскрывается, что любая алкильная, алкенильная, алкинильная и алкилиденовая группа стероидного соединения, представленного формулой (1), может быть разветвтленной или неразветвленной. Если R₆ или R₁₁ присоединены к стероидной структуре через одинарную связь, замещенный атом углерода стероидной структуры либо связан с атомом водорода, либо образует двойную углерод-углеродную связь. Соединения могут включать различные центры хиральности и могут существовать в виде энантиомеров и диастереомеров. Гидроксильные группы могут быть защищены такими заместителями, как ацил или алкил, образуя пролекарства соединения, представленного формулой 1.

В настоящее время установлено, что стероидное соединение, представленное формулой 1 с символами и обозначениями, имеющими указанные выше значения, характеризующееся тем, что R_E представляет собой -гидроксигруппу или его пролекарство, неожиданно, обладает соответственно большей селективностью к эстрогеновому рецептору в сочетании с большей эффективностью эстрогена . Подобное соединение, здесь и далее относящееся с соединению согласно настоящему изобретению, обычно не только очень слабо активно в отношении эстрогенового рецептора , но по существу представляет собой в целом антагонист эстрогенового рецептора , который проявляет очень высокую селективность по отношению к эстрогеновому рецептору и, более того, дает возможность проведения селективной терапии на основании блокады эстрогенового рецептора . Соединения согласно данному изобретению включают вышеуказанные энантиомеры и диастереомеры, входящие в объем изобретения, и каждый из отдельных (R)- и (S)-энантиомеров, по существу являющийся свободным, т.е. содержащий менее чем 5%, предпочтительно менее чем 2% и особенно менее чем 1% другого энантиомера, и смеси подобных энантиомеров в любых пропорциях, включая рацемические смеси, состоящие в основном из равных количеств двух энантиомеров.

Предпочтительное воплощение изобретения представляет собой стероидное соединение, указанное выше, и, кроме того, характеризующееся тем, что R₆ представляет собой Н, R₇ представляет собой разветвленный или неразветвленный C_1-3-алкил, кольцо Е представляет собой пяти- или шестичленное кольцо, не содержащее двойных связей и содержащее гидроксигруппу в положении 22 S-стереоконфигурации, иными словами указанная конфигурация представляет собой по отношению к стероидной структуре согласно обозначениям, принятым в стереохимии стероидных соединений.

Наиболее предпочтительным является соединение, представленное формулой 2, которое представляет собой (7,16,17,22S) -7-пропил-16, 24-цикло-19, 21-динорхола-1,3,5(10)-триен-3,17,22-триол, имеющее кодовый шифр Оrg 41621:

Соединения согласно настоящему изобретению поэтому дают возможность проведения более направленной, другими словами селективной модификации активности эстрогеновых рецепторов или в организме.

Пролекарство определяют как соединение, преобразовывающееся в организме реципиента в соединение, представленное формулой 1, где R_E представляет собой -гидроксильную группу. Следует отметить, что гидроксигруппы в положении 3, 17 и в кольце Е, например, могут быть преобразованы в эфиры (алкил*окси) или сложные эфиры, такие как ацил*окси, фосфат, сульфат, сульфонат или ароматический карбоксилат, при этом длина углеродной цепи групп, отмеченных звездочкой (*), не считается жестко ограниченной. Ацильную группу получают из линейного или разветвленного алкана*, а ароматический карбоксилат обычно будет содержать фенил, пиридинил или пиримидил. Длина алкильных и ацильных групп выбирается в зависимости от желаемых свойств пролекарств, при этом более длинноцепочечные пролекарства, содержащие, например, лаурильную или капроильную цепи, являются более подходящими для препаратов замедленного высвобождения и депонирования препаратов. Известно, что подобные заместители гидролизуются самопроизвольно или гидролизуются ферментативно до свободных гидроксильных групп, замещающих стеродиную структуру соединения. Подобные пролекарства будут сопоставимы по биологической активности с теми соединениями, в которые они преобразуются в организме реципиентов. Активное соединение, в которое преобразуется пролекарство, называют родительским, исходным соединением. Начало действия и продолжительность действия также как и распределение пролекарства в организме может отличаться от подобных свойств исходного соединения.

Как в целях медикаментозного лечения, так и для физиологических, медицинских и фармакологических экспериментов подобные селективные соединения, представленные здесь, являются крайне необходимыми. Одним аспектом изобретения является то, что соединение согласно изобретению может применяться для лечения с помощью введения соединения реципиенту, являющемуся человеком или животным, предпочтительно млекопитающим. Различное распределения рецепторов и в различных тканях организма обеспечивает мишени для более селективного вмешательства в функционирование различных тканей. Известно, что типы рецепторов зависимы, так, эстрогеновые рецепторы предпочтительно экспрессируются в вагинальной ткани и ткани печени, в то время как эстрогеновые рецепторы предпочтительно экспрессируются в ткани предстательной железы, эпителиально-клеточном слое мочевого пузыря крыс, эндотелиальных, гладкомышечных клетках сосудов и определенных областях мозга, таких как базальный передний мозг, кора головного мозга (неокортекс) и гиппокамп. Тканями, в которых представлены оба типа рецепторов, являются, например, ткани гипофиза, гипоталамуса, тимуса, матки, яичника и костная ткань.

Профиль аффинности к эстрогеновым рецепторам соединений согласно настоящему изобретению делает их пригодными в качестве улучшенных эстрогеновых соединений или антиэстрогеновых соединений со сниженными побочными эффектами, связанными с эстрогенами. Таким образом, изобретение представляет способ селективной модификации активности эстрогеновых рецепторов путем осуществления контакта, взаимодействия соединения согласно изобретению с эстрогеновыми рецепторами. Подобный способ может являться лечением человека или животного, но также он может быть немедицинским способом. Последний способ может представлять собой экспериментальный способ, такой как оценка селективности соединений или лабораторный способ in vitro получения информации относительно эстрогеновых рецепторов или соединений, взаимодействующих с ними. Предпочтительно, данные соединения могут применяться для селективной в отношении эстрогеновых рецепторов и контрацепции, экспериментальной или медицинской терапии, например, для лечения или профилактики нарушений, связанных с эстрогеновыми рецепторами, проявлений менопаузы, остеопороза, сердечно-сосудистых расстройств, модулирования гипофизарной гормональной регуляции, доброкачественной гипертрофии предстательной железы, контроля эстрогензависимой опухоли, злокачественной опухоли ободочной кишки, эндометриоза или расстройств центральной нервной системы. Важной общей характеристикой данных селективных методов и способов лечения является то, что они включают осуществление взаимодействия соединения согласно изобретению с эстрогеновыми рецепторами.

Изобретение также относится к применению соединения согласно изобретению для получения лекарственного препарата для селективной терапии, связанной с эстрогеновыми рецепторами, и лекарственного препарата для лечения расстройств, связанных с эстрогеновым рецептором , включающего введение пациенту соединения согласно изобретению (в приемлемой фармацевтической дозированной форме). Принимая во внимание антагонистический эффект соединения согласно изобретению в отношении эстрогенового рецептора , изобретение также обеспечивает получение лекарственного препарата для лечения расстройств, связанных с эстрогеновым рецептором , включающего введение пациенту соединения согласно изобретению (в приемлемой фармацевтической дозированной форме).

Кроме того, изобретение относится к применению соединения согласно изобретению для получения лекарственного препарата, обладающего контрацептивной активностью. Таким образом, изобретение также относится к медицинскому показанию контрацепции, т.е. способу контрацепции, включающему введение пациенту, являющемуся женщиной, или животному женского рода прогестогена и эстрогена в соответствии с обычной схемой в данной области, при этом эстроген представляет собой соединение согласно данному изобретению (в приемлемой фармацевтической дозированной форме).

Наконец, изобретение относится к применению соединения согласно изобретению для получения лекарственного препарата, обладающего селективной эстрогенной активностью, подобный лекарственный препарат в основном применим в области HRT (гормоно-заместительная терапия), характеризующегося смягчением осложнений менопаузы, в частности противоостеопорозной активностью.

Дозированные количества настоящих соединений будут в пределах обычного порядка для соединений, относящихся к эстрогену, например порядка от 0,01 до 100 мг на прием.

С этой целью могут быть получены разовые дозы, содержащие соединение согласно изобретению в количестве такого же порядка, как вышеуказанные терапевтические дозы. Поэтому настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение согласно изобретению в смеси с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.

Соединения согласно изобретению могут быть получены с помощью различных способов, известных в области органической химии вообще и особенно в области химии стероидов. См., например: Fried J. и Edwards J. A., "Organic Reactions в Steroid Chemistry", Volumes I и II, Van Nostrand Reinhold Company, New York, 1972; и С. Djerassi, "Steroid Reactions ", Holden-Day, Inc., San Francisco, 1963.

Для синтеза соединения согласно изобретению синтезировали стероидные соединения с дополнительным 16,17-анелированным кольцом. Данные способы описаны в ЕР 0869132. Для соединений согласно настоящему изобретению дополнительная гидроксильная функциональная группа должна быть введена в анелированное кольцо. С этой целью является удобным проведение реакции анелирования таким образом, чтобы в результате процедуры синтеза получались расположенные соответствующим образом двойные связи, например, с помощью хорошо известной реакции обмена олефинов, для чего применяют металлические катализаторы, полученные, например, из рутения, молибдена или вольфрама, для замыкания 16, 17-бисненасыщенного фрагмента в ненасыщенное анелированное 5- или 6-членное кольцо. Синтезированное подобным образом олефиновое кольцо сначала стереоспецифически эпоксидируют. Данная реакция, в общем, может быть проведена с помощью таких агентов, как перкислоты (предпочтительно в буферированной среде), или каталитических систем, применяя комплексы металлов в присутствии окисляющих агентов (таких как перекись водорода или трет-бутилгидропероксид). В данном случае обычно хорошие результаты дает применение пербензойной кислоты с буферным раствором бикарбоната натрия. Эпоксиды могут быть почти селективно восстановительно раскрыты по определенному положению с помощью гидридных реагентов до желаемых бета-спиртов. Гидроксигруппы также могут быть легко синтезированы с помощью методики гидроборирования/окисления. В случае получения -гидроксисоединений применение реакции Mitsunobu легко приводит к предназначенным -спиртам. Гидроксисоединения могут быть преобразованы в пролекарства, такие как алкильные эфиры, ацильные сложные эфиры, карбонаты, сульфонаты или фосфаты, с помощью реакции с подходящим алкилгалогенидом или хлорангидридом кислоты, при желании.

Фармацевтическая композиция, содержащая одно или несколько соединений согласно изобретению, может быть получена с помощью комбинирования с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами или без указанного комбинирования, как описано в стандартной ссылке Gennaro et al., Remmington's Pharmaceutical Sciences, (18th ed.. Mack publishing Company, 1990, см. особенно Part 8: Pharmaceutical Preparations и Their Manufacture). Смесь одного или нескольких соединений согласно изобретению и одного или нескольких фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ может быть спрессована в твердые стандартные дозированные формы, такие как пилюли или таблетки, или может быть введена в капсулы или суппозитории. Посредством фармацевтически приемлемых жидкостей соединения также могут применяться в качестве инъекционного препарата в виде раствора, суспензии, эмульсии или спрея, например назального спрея. Соединения согласно изобретению также могут быть включены в имплантат, спираль, пластырь, гель и любой другой препарат для длительного (замедленного) высвобождения. Для получения стандартных дозированных форм, например таблеток, предполагается применение общепринятых добавок, таких как наполнители или носители, красители, полимерные связующие вещества и подобные. В основном может применяться любая фармацевтически приемлемая добавка, которая не влияет на функцию активных соединений. Подходящие носители, вместе с которыми могут вводиться композиции, включают лактозу, крахмал, производные целлюлозы и подобные или их смеси, применяемые в приемлемых количествах.

ПРИМЕРЫ

Пути синтеза, применяемые в примерах, проиллюстрированы на схемах I и II. Номера, применяемые для обозначения соединений, охарактеризованы с помощью структурных формул на данных схемах.

Соединение 2

К раствору 5,65 мл винилтрибутилолова в 50 мл безводного ТГФ мл добавляли при -50°С по капле 12 мл 1,6 М BuLi в гексане. После перемешивания в течение дополнительного 0,5 ч добавляли раствор 6,2 г 16-аллил, 7-этилэстрон-3-O-метилового эфира (1) в 20 мл безводного ТГФ при -50°С. После перемешивания в течение дополнительного 1/2 ч смесь выливали в насыщ. NH ₄Cl и экстрагировали этилацетатом. Концентрирование органической фазы с последующей хроматографией на силикагеле дало 4,2 г 2 в виде масла,

R_f 0,47 (толуол/этилацетат 95/5), для 1 R_f 0,65. ЯМР (CDCl₃) 5,80 (м, 1, СН-аллил), 6,07 (м, 1, СН-винил), 0,98 (с, СН ₃), 0,93 (т, 3, этил), 3,78 (с, 3, СН₃).

Соединение 3

К раствору 4,2 г 2 в 80 мл метиленхлорида добавляли 0,32 г дихлорида бензилидентрисциклогексилфосфинрутения (катализатор обмена Grubbs). После перемешивания в течение 1 ч добавляли дополнительную порцию 0,3 г катализатора. После завершения реакции (2 ч) смесь концентрировали, и остаток очищали с помощью колоночной хроматографии с получением 3,5 г 3, R_f 0,29 (гептан/этилацетат 8/2, для 2 R_f 0,55).

ЯМР (CDCl₃) 5,72 (м, СН=), 6,02 (м, 1, С=), 0,99 (с, 3, СН₃), 0,89 (т, 3, СН₃), 3,77 (ОСН₃), 0,92 (м, 3, СН₃).

Соединение 4

Смесь 0,5 г стероидного соединения 3 и 0,5 г NаНСО₃ в 12 мл метиленхлорида обрабатывали с помощью 0,34 г мета-Cl-пербензойной кислоты. После перемешивания в течение нескольких часов при комнатной температуре реакционную смесь разбавляли водой и обрабатывали с помощью раствора тиосульфата натрия для разрушения оставшегося пероксида. Органическое вещество экстрагировали этилацетатом и окончательно очищали с помощью хроматографии с получением 110 мг желаемого -эпоксида 4; R_f 0,50 (толуол-ацетон 9/1).

ЯМР (CDCl ₃) 0,98 (т, 3, СН₃), 0,92 (т, 3, СН₃), 3,65 + 3,70 (2хм, эпоксид СН).

Соединение 5

Раствор 80 мг стероидного соединения 4 в 3 мл ТГФ нагревали с обратным холодильником с 10 мг LiAlH₄. После 2 ч исходное вещество исчезло. Смесь гасили добавлением 30 мкл насыщ. раствора Na₂ SO₄ и 0,20 г Na₂SO₄, перемешивали в течение 15 мин и фильтровали через целит. Фильтрат концентрировали и остаток пропускали через короткую колонку с силикагелем с получением 55 мг 5; R_f 0,24 (толуол-ацетон 9/1); ЯМР (CDCl ₃) 4,04 (м, 1, СНОН), 3,78 (с, 3, ОСН₃), 2,85 (м, 2, СН₂ при С6), 0,92 (с, 3, СН₃).

Соединение 6

К раствору этантиолата натрия (полученного из 0,7 мл этантиола и 0,27 г 60% дисперсии NaH) в 9 мл ДМФ добавляли 120 мг стероидного соединения 5. Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 3 ч. Далее реакционную смесь выливали в воду и экстрагировали этилацетатом. Проводили хроматографию органического вещества с получением 80 мг 6, точка плавления 224-226; R_f 0,30 (толуол-ацетон 8/2); ЯМР (CDCl₃) 4,00 (м, 1, СНОН), 7,12 (ar H1), 6,20 (ar H2), 6,54 (ar H4).

Соединение 7

К раствору 2,7 г стероидного соединения 3 в 20 мл метиленхлорида и 3 мл пиридина добавляли при 0°С 1,9 мл триметилсилилхлорида. После перемешивания в течение 1/2 ч реакционную смесь выливали в воду и экстрагировали этилацетатом с получением 3,3 г по существу очищенного силилоксипроизводного 7, R_f 0,8 (гептан-ацетон 8/2); ЯМР (CDCl₃ ) 0,03 (с, 9, ТМС), 5,68, 5,91 (2хс, СН олефин).

Соединение 8

Раствор 3,2 г 7 в 25 мл безводного ТГФ обрабатывали при 0°С с помощью раствора 2,2 мл боран-диметилсульфидного комплекса в 20 мл ТГФ. Реакционную смесь далее перемешивали в течение 2 ч при 45°С. Избыток реагента разрушали осторожным добавлением 4,5 мл абс. этанола с последующим добавлением 11 мл 2 н. NaOH и 7,7 мл 30% перекиси водорода. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Таким образом полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии и получали 1,7 г желаемого -спирта 8. R_f 0,36 (гептан-ацетон 8/2); ЯМР (CDCl₃ ) 4,42 (м, 1, СНОН), 0,12 (с, 9, ТМС), 0,79 (с, 3, СН₃ ).

Соединение 9

Раствор 1,6 г 8 и 1,3 г трифенилфосфина в 60 мл толуола обрабатывали с помощью 0,84 г пара-нитробензойной кислоты и 0,8 мл диэтилазодикарбоксилата при 0°С. После перемешивания в течение 1 ч реакция завершалась. Смесь выливали в насыщ. водный раствор NаНСО₃ и экстрагировали этилацетатом. После хроматографической очистки получали 2,9 г -нитробензоата, R_f 0,64 (гептан-ацетон 8/2); ЯМР (CDCl₃ ) 5,34 (м, 1, CHOC(O)Ar), 0,91 (с, 3, СН₃), 0,95 (т, 3, СН₃), 3,80 (с, 3, ОСН₃). Данное вещество растворяли в смеси 40 мл ТГФ-метанол (1/1 по объему) и обрабатывали 4 мл раствора 2 н. NaOH. После перемешивания в течение 15 мин реакционную смесь вносили в воду, и продукт экстрагировали этилацетатом. После пропускания через короткую колонку с силикагелем получали 1,3 г -спирта 9; R_f 0,64 (гептан-ацетон 8/2); ЯМР (CDCl₃ ) 4,31 (м, 1, СНОН).

Соединение 10

Раствор 1,3 г 9 в 30 мл ацетона обрабатывали 2 мл 2 н. НСl. После 1 ч смесь нейтрализовали добавлением насыщенного NаНСО₃ и концентрировали. Остаток разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом с получением 1,0 г 10, R_f 0,10 (гептан-ацетон 8/2); ЯМР (CDCl ₃) 0,90 (т, 3, СН₃), 0,95 (с, 3, СН₃), 4,48 (м, 1, СНОН).

Соединение 11

К раствору этантиолата натрия (полученного из 0,7 мл этантиола и 0,3 г 60% дисперсии NaH) в 9 мл ДМФ добавляли 120 мг стероидного соединения 10. Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 3 ч. Далее смесь вносили в воду и экстрагировали этилацетатом. После хроматографии органического вещества получали 80 мг 11, точка плавления 143-145°С (этанол-вода); R_f 0,41 (толуол-ацетон 7/3); ЯМР (CDCl ₃) 4,45 (м, 1, СНОН), 0,93 (с, 3, СН₃), 0,90 (т, 3, СН ₃), 6,62 + 7,10 (АВ, 2, H1, 2), 6,53 (д, 1, Н4).

Соединение 13

К раствору 29 мл 1 М аллилбромида магния в эфире добавляли 80 мл безводного ТГФ. При -50°С добавляли 10 г 7-пропил,16-аллилэстрон-3-О-бензилового эфира 12 в 40 мл ТГФ. После перемешивания в течение 1/2 ч смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и вносили в 300 мл насыщ. водного NH₄Cl. Продукт экстрагировали этилацетатом и очищали с помощью хроматографии на силикагеле для удаления стереоизомеров с получением 7,2 г желаемого 16,17-диаллильного производного 13.

R_f 0,26 (гептан-этилацетат 9/1); 17-аллил-изомер R_f 0,45. ЯМР (CDCl₃) 0,88 (т, 3, СН₃), 0,96 (с, 3, СН₃), 6,08 (м, 1, СН-аллил), 5,80 (м, 1, СН-аллил), 4,95-5,20 (м, 4, 2х СН₂-аллил), 5,02 (CH₂OBz).

Соединение 14

Порцию в 40 мг дихлорида

бензилидентрисциклогексилфосфинорутения (катализатор обмена Grubbs) добавляли к раствору 450 мг 13 в 10 мл метиленхлорида. После перемешивания в течение 1 ч добавляли дополнительно 400 мг катализатора. После 12 ч растворитель удаляли и заменяли 20 мл толуола и смесь перемешивали вместе с 5 г основного оксида алюминия при 60°С для абсорбции катализатора. После фильтрации через целит и промывания толуолом и этилацетатом получали 400 мг по существу чистого 14; R_f 0,34(гептан-этилацетат 8/2); R_f 13 0,45. ЯМР (CDCl₃) 5,02 (с, 2, СН₃О), 5,97 (с, 2, СН=СН), 0,97 (с, 3, СН₃).

Соединение 15

К раствору 340 мг 14 в 0,5 мл метиленхлорида добавляли 8 мкл пиридина, 0,14 мл 30% водн. H₂O₂ с последующим добавлением 2 мг метилтриоксорения. После перемешивания в течение 1 ч эпоксидирование завершалось, приводя к получению преимущественно желаемого -эпоксида, также как и к некоторому количеству -изомера. Смесь выливали в воду и насыщ. Na₂S₂О ₃ и экстрагировали этилацетатом. После хроматографии получали 230 мг 15 и 80 мг нежелаемого -эпоксида. R_f 0,36 (толуол-этилацетат 95/5; для сравнения: R _f соединения 14: 0,39). ЯМР (CDCl₃) 3,31, 3,38 (м, 2, СН(О)СН).

Соединение 16

Смесь 4,2 г 15 и 350 мг LiAlH₄ в 20 мл безводного ТГФ нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч. Далее смесь охлаждали и последовательно обрабатывали 1 мл насыщ. водного Na₂ SO₄, 28 мл этилацетата и 8 г Na₂SO ₄. После перемешивания в течение 1/2 ч при комнатной температуре реакционную смесь фильтровали через целит и фильтрат концентрировали и хроматографировали с получением 3,4 г 16, точка плавления 147-148°С, R_f 0,20 (толуол-этилацетат 8/2; R_f 23 0,55). ЯМР (CDCl₃) 4,25 (широкий с, 1, СНОН), 0,90 (с, 3, СН₃), 0,86 (т, 3, СН₃), 5,02 (с, 2, OCH₂Ar).

Соединение 17: (=7,16,17,22S)-7-пропил-16,24-цикло-19,21-динорхола-1,3,5(10)-триен-3,17,22-триол

Раствор 3,3 г 16 в 200 мл этанола гидрировали в присутствии 300 мг 5% Pd/C. После завершения реакции катализатор отфильтровывали через целит и раствор концентрировали. Остаток растирали вместе с эфиром и далее вместе с водой с получением 1,7 г 17; точка плавления 146-147°С, R_f 0,53 (толуол-этилацетат 1/1; R_f 16 0,60). ЯМР (CDCl₃) 4,26 (широкий с, 1, СНОН), 7,14, 6,62 (АВ, 2, H1, H2), 6,54 (d, H4).

Соединение 18: (=7,16,17,22S)-3,22-диасетокси-7-пропил-16,24-цикло-19,21-динорхола-1,3,5(10)-триен-17ол

100 мг соединения 17 растворяли в 1 мл пиридина и обрабатывали 0,1 мл уксусным ангидридом. После перемешивания в течение 2 ч добавляли воду и смесь концентрировали. Полученный остаток растворяли в этилацетате и экстрагировали водой и насыщенным водным раствором NаНСО₃. Органический растворитель удаляли при пониженном давлении с получением целевого соединения (110 мг). ЯМР (CDCl ₃) 0,88 (т, 3Н, СН₃, пропил); 1,08 (с, 3Н, 18-СН ₃) ; 2,09 (с, 3Н, ацетил); 2,28 (с, 3Н, ацетил); (д, 1Н, Н4); 6,83 (dd, 1H, H2).

Оценка эстрогенной активности in vitro

Соединения оценивали по их активности в отношении эстрогеновых рецепторов в тесте связывания и тесте трансактивации, применяя или рецептор эстрогена человека.

Конкурентное связывание с цитоплазматическим эстрогеновым рецептором человека или из рекомбинантных клеток яичника китайского хомячка (СНО) применяли для оценки относительной аффинности связывания (=RBA) (степень эффективности) тестируемого соединения по сравнению с (17)-эстрадиолом (Е₂) для эстрогеновых рецепторов или , присутствующих в цитозоле рекомбинантных клеток СНО, стабильно трансфицированных эстрогеновым рецептором человека (hER) или рецептором (hER).

Эстрогенную и антиэстрогенную активность соединений определяли в биоанализе in vitro с помощью рекомбинантных клеток яичника китайского хомячка (СНО), стабильно котрансфицированных эстрогеновым рецептором человека (hER) или (hER), промотором окситоцина крысы (RO) и репортерным геном люциферазы (LUC). Эстрогенную агонистическую трансактивацию (степень эффективности) тестируемого соединения в виде стимуляции трансактивации фермента люциферазы, опосредованной эстрогеновыми рецепторами hER или hER, сравнивали с эстрогеновым стандартом эстрадиолом. Антиэстрогенную активность (степень эффективности) тестируемого соединения, т.е. способности ингибирования трансактивации фермента люциферазы, опосредованной действием (17)-эстрадиола на эстрогеновые рецепторы hER или hER, сравнивали со стандартом ICI 164,384 (=(7, 17)-N-бутил-3,17-дигидрокси-N-метилэстра-1,3,5(10)-триен-7-ундеканамид).

Результаты (табл.1)

Таблица 1
Соединение формулы 3	R7	R 11	6-кольцевое (n=1)или 5-кольцевое (n=0)	Анализ связывания Ег/Ег	Трансактивация Еr/Еr	Селективность агониста Er/Er
А	Н	Н	6-кольцевое	8,6/0,3	5,5/0,2	27
В	СН 3	Н	6-кольцевое	20/5,2	16/<0,1	>160
С(=11)	С2Н 5	Н	5-кольцевое	18/14	12/<0,1	>120
D	С2Н5	Н	6-кольцевое	17/8,7	11,5/0,1	>115
Е(=171) )	С3Н 7	Н	6-кольцевое	42/13,9	26/<0,1	>260
F	Н	С 3Н7	5-кольцевое	16,3/0,4	11/0,2	55
G	СН3	Н	7-кольцевое		2,3/<0,02	>115
Н	СН3	СН3	6-кольцевое		30/0,35	85
I	С 4Н9	Н	6-кольцевое		2,9/0,02	>145
1) 17 представляет собой Оrg 41621

Соединение 17 в антагонистических тестах показало степень селективности Er/Er<0,1/67.

Соединение, соответствующее уровню техники, согласно формуле 3, но не содержащее 22-гидроксигруппу и содержащее R₇ -пропил, R₁₁ водород и 6-членное Е-кольцо, имеющее название (7,16,17)-7-пропил-16, 24-цикло-19, 21-динорхола-1,3,5(10)-триен-3,17-диол, в анализе связывания обладало соотношением ER/ER 15/7 и в анализе агонистической трансактивации 0,3/<0,1.

Оценка профилактического действия на потерю костной массы, индуцированной овариэктомией, у крыс (антиостеопороэный тест)

Введение

Овариэктомия у крыс индуцирует потерю костной массы, которая является следствием дефицита эстрогена. Введение эстрогеновых соединений предотвращает этот эффект. Тест применяют для оценки соединения в отношении антиостеопорозной активности у крыс с овариэктомией (OVX). Влияние на костную массу может оцениваться с помощью периферической количественной компьютерной томографии (pQCT) или с помощью количественного анализа рентгенограмм. По уровню остеокальцина в плазме и уровню дезоксипиридинолина, кальция и фосфата в моче оценивают метаболизм костной ткани. Увеличение массы матки и снижение массы тела и тимуса отражает эффект эстрогена.

Тестируемые животные

Взрослые неоплодотворенные самки крыс Wistar массой 225-250 г. Род: Hsd/Cpd: Wu, SPF-bred by Harlan, СРВ, Zeist, The Netherlands.

Эксперимент

В 1-ый день эксперимента крыс взвешивали и распределяли по клеткам в зависимости от массы тела, при этом крысу с наименьшей массой тела помещали в первую клетку и крысу с наибольшей массой - в последнюю клетку. Схему обработки для крыс выбирали произвольно (случайным образом).

Фиктивную операцию и оварэктомию проводили под анестезией эфиром. Вслед за восстановлением после анестезии в течение 24 ч вводили носитель, контрольное соединение и тестируемое соединение один или два раза в сутки в течение 4 недель. В течение этого периода крыс еженедельно взвешивали. После 4 недель проводили аутопсию. При аутопсии крыс анестезировали эфиром и брали кровь из брюшной аорты. Выделяли оба бедра, позвоночный столб L1L2L3L4 (необязательно), матку, тимус, печень, почки, надпочечники, щитовидную железу и гипофиз. Измерения минеральной плотности костной ткани и геометрии правого бедра проводили с помощью pQCT в день аутопсии на свежих тканях. Минеральную плотность трабекулярной костной ткани метафизной части бедренной кости (FBMDDIS мг/см³ ) определяли с помощью pQCT (периферическая количественная компьютерная томография; ХСТ 960А, Stratec, Birkenfeld, Germany).

Интерпретация результатов

Овариэктомия приводит к статистически достоверному снижению плотности костной ткани дистальной части и объему трабекулярной костной ткани бедренной кости и к статистически достоверному повышению уровней остеокальцина в плазме и дезоксипиридинолина в моче (Р<0,05, 2 way ANOVA).

Тестируемые соединения считали активными в случае, когда средние значения плотности костной ткани дистальной части бедренной кости были достоверно повышенными по сравнению с контрольной группой с овариэктомией. Влияние соединений на уровень дезоксипиридинолина в моче отражало влияние на резорбцию костной ткани, влияние на уровень остеокальцина в плазме отражало влияние на обновление костной ткани и могло помочь понять механизм действия.

Минимальная активная доза (MAD) представляет собой дозу, при которой достигается среднее пропорциональное различие по минеральной плотности трабекулярной костной ткани между 40 и 60%.

Ссылки

Wronski T.J. and Yen C.F.: The ovariectomised rat as an animal model for postmenopausal bone loss. Cells and Materials, Supp. 1 (1991): 69-76.

Yamazaki I. and Yamaguchi H.: Characteristics of an ovariectomised osteopenic rat model. J. Bone Min. Res. 4 (1989): 12-22.

Ederveen A.G.H. and Kloosterboer H.J.: Tibolone, a steroid with a tissue specific hormonal profile, completely prevents ovariectomy-induced bone loss in sexually mature rats. J. Bone & Mineral Research, Vol 14, pp. 1963-1970, 1999.

Результат:

Соединение 17 (Org 41621): в тесте на остеопороз перорально 30 мкг/кг.

Соединение, соответствующее уровню техники (7,16,17)-7-пропил-16,24-цикло-19,21-динорхола-1,3,5(10)-триен-3,17-диол: 190 мкг/кг перорально.

Оценка эстрогенной активности in vivo

Эстрогенную активность in vivo определяли с помощью теста Allen Doisy, описанного в F. Allen, L.A. Doisy, J. Amer. Med. Assoc., 81, 819-821 (1923).

Результат:

Соединение 17 (Org 41621): Allen Doisy подкожно 5 мкг/кг, перорально 30 мкг/кг.

Соединение, соответствующее уровню техники (7,16,17) -7-пропил-16,24-цикло-19,21-динорхола-1,3,5(10)-триен-3,17-диол: Allen Doisy подкожно 24 мкг/кг, перорально 125 мкг/кг.