миканолид и дигидромиканолид в качестве ингибиторов днк-полимераз

Формула изобретения

1. Способ получения сухого экстракта листьев Mikania micrantha, Mikania scandens и Mikania cordata, содержащего по меньшей мере 50 мас.% миканолида и дигидромиканолида и по меньшей мере 20 % дигидромиканолида, характеризующийся тем, что осуществляют последовательно измельчение и сушку листьев Mikania micrantha, Mikania scandens и Mikania cordata; добавление к измельченным листьям Mikania micrantha, Mikania scandens и Mikania cordata растворителя, выбираемого из толуола, этилацетата, смесей толуола с этилацетатом, смесей толуола с ацетоном, смесей этилацетата с гептаном и смесей гептана с ацетоном в соотношениях 7:3 - 3:7; фильтрацию и извлечение фильтрата; концентрирование раствора экстракта первичного экстрагирования с достижением концентрации от 2,5 до 10% в расчете на сухой экстракт; распределение концентрированного экстракта, полученного на предыдущей стадии, между экстрагирующим растворителем и смесью, содержащей 10 - 50% метанола или этанола в воде; промывание водно-спиртовой фазы н-гексаном или гептаном; удаление спирта из водно-спиртовой фазы; экстракцию полученной водной фазы этилацетатом; сушку фазы этилацетата при помощи осушителя; выпаривание растворителей и выделение сухого экстракта; очистку полученного сухого экстракта посредством физико-химического метода разделения, такого, как фильтрация или кристаллизация, и получают после удаления растворителей желаемый сухой экстракт.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что распределение концентрированного экстракта осуществляют при помощи смеси, содержащей 25 - 30% метанола в воде.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что физико-химический метод разделения представляет собой перекристаллизацию из метанола, этанола или ацетона.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что физико-химический метод разделения представляет собой фильтрацию через силикагель.

5. Способ получения экстракта, обогащенного дигидромиканолидом, из сухого экстракта листьев Mikania micrantha, Mikania scandens и Mikania cordata, содержащего по меньшей мере 50 мас.% миканолида и дигидромиканолида и по меньшей мере 20% дигидромиканолида, отличающийся тем, что гидрируют вышеупомянутый экстракт, растворенный в этилацетате, при температуре в интервале 10 - 35°С в присутствии катализатора гидрирования при давлении водорода 1 - 2 атмосфер.

6. Способ получения дигидромиканолида из экстракта Mikania micrantha, Mikania scandens и Mikania cordata, содержащего по меньшей мере 50 мас.% миканолида и дигидромиканолида и по меньшей мере 20 % дигидромиканолида, отличающийся тем, что осуществляют последовательно: гидрирование вышеупомянутого экстракта посредством способа, описанного в п.5; кристаллизацию дигидромиканолида, вызванную добавлением жидкого н-алкана к раствору экстракта, обогащенного дигидромиканолидом, в этилацетате и выделение вышеупомянутого дигидромиканолида путем фильтрации.

7. Применение миканолида или дигидромиканолида в качестве активного начала лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативных заболеваний.

8. Применение по п.7, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для лечения рака.

9. Лекарственное средство для лечения пролиферативных заболеваний, содержащее растительный экстракт, выбранный из экстракта растений Mikania micrantha, Mikania scandens и Mikania cordata, содержащего по меньшей мере 50 мас.% миканолида и дигидромиканолида и по меньшей мере 20 мас.% дигидромиканолида и экстракта, полученного способом по п.5.

10. Лекарственное средство по п.9, предназначенное для лечения рака.

11. Применение миканолида или дигидромиканолида в качестве активного начала лекарственного средства, предназначенного для лечения паразитарных заболеваний, вызываемых простейшими или протистами.

12. Применение по п.11, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для лечения малярии.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение касается применения в качестве лекарств и, в частности, в качестве антипролиферативных, противовирусных и противопаразитарных препаратов, миканолида, дигидромиканолида и экстрактов, обогащенных дигидромиканолидом. Изобретение касается также способа их получения путем экстракции из растения Mikania micrantha, описанной ниже.

Давно известно, что растения являются источником фармацевтических продуктов и компонентов для традиционной медицины (Phillipson, J.D., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. (1994), 88 Suppl. 1, S17-S19). Лекарственные средства, полученные из натуральных продуктов или их синтетических аналогов, играют очень важную роль.

Например, онкология располагает такими продуктами, как таксол (Paclitaxel^®), винкристин (Oncovin^®), винорелбин (Navelbine ^®), тенипозид (Vumon^®) и многие аналоги камптотецина (КПТ) (СРТ), которые растворимы в воде (Pezzuto, J.M., Biochem. Pharmacol. (1997), 53, 121-133). Другие продукты, полученные из растений, находятся на стадии исследования в отношении предупреждения рестеноза.

Камптотецин, применяемый, например, для лечения рака, представляет собой пентациклический алкалоид, выделенный из древесины Camptotheca acuminata (Wall, M.E., Med. Res. Rev. (1998), 18, 299-314). Первоначально КПТ был идентифицирован как ингибитор опухолевой пролиферации на моделях человеческих клеток. Впоследствии был выявлен отравляющий механизм действия КПТ на фермент топоизомеразы I, вовлеченной в репликацию ДНК. Возрастающее число аналогов КПТ (топотекан, КПТ-11, BN-80915) используется в противоопухолевой терапии человека (Lavergne, О. et coll., J. Med. Chem. (1998), 41, 5410-5419).

Другим примером является таксол, терпеновый алкалоид, выделенный из Taxus brevifolia. Таксол представляет собой мощный цитотоксический препарат, который ингибирует тубулин, представляющий собой белок, участвующий в митозе. Этот продукт особенно эффективен по отношению к опухолям яичника.

Кроме того, известно, что сначала из Catharanthus roseus были экстрагированы алкалоиды vinca. Первоначально их использовали согласно этноботаническим знаниям при других заболеваниях, отличных от рака.

Что касается профилактики рестеноза, то исследования показывают, что это может быть осуществлено с помощью белка, выделенного из Saponaria officinalis - сапонина, связанного с фактором роста фибропласта (ФРФ - фактор роста фибропласта) (FGF - Fibroplast Growth Factor). Этот фактор роста обеспечивает направленную доставку продуктов к клеткам сосудов, благодаря его сродству к рецептору, содержащему ФРФ (Lin P.H. et coll., Atherosclerosis (avril 1998), 137(2), 277-289).

Способ обнаружения таких веществ заключается во фракционировании молекул экстракта растения с последующей оценкой их биологических активностей. Но, принимая во внимание большое число родов, видов и сортов растений и огромное количество молекул, происходящих из упомянутых растений, идентификация молекулы и ее биологической активности остается действием, очень трудным для выполнения.

Mikania micrantha представляет собой пандемическую траву, произрастающую в тропических районах. Она распространяется чрезвычайно быстро, в такой степени, что ее называют "а-milе-a-minute"', другими словами "миля в минуту". Mikania scandens и Mikania cordata часто путают с ней. Указанные три вида растений содержат, в частности, миканолид (I), дигидромиканолид (II), сканденолид (III) и дигидросканденолид (IV).

Структуры миканолида, дигидромиканолида, сканденолида и дигидросканденолида

Экстракция миканолида, дигидромиканолида, сканденолида и дигидросканденолида из Mikania scandens, Mikania cordata и Mikania micrantha была описана, соответственно, в следующих ссылках: Herz, Tetrahedron Lett., (1967), 32, 3111-15; Kiang, Phytochemistry (1968), 7(6), 1035-7; и Cuenca, J. Nat. Prod. (1988), 51(3), 625-6. Используемые растворители включают хлороформ и диэтиловый эфир, которые не могут быть использованы в промышленном масштабе из-за их токсичности и воспламеняемости.

Согласно этноботаническим знаниям Mikania scandens и Mikania cordata использовались и еще используются традиционной медициной в качестве антиастматического, обезболивающего, антиревматического, противовоспалительного, противоракового, жаропонижающего и противоглистного средства в Центральной Америке, где его общим названием является "гуако" (guaco). Только в последнее десятилетие некоторые из их перечисленных свойств были объектом научных исследований, в частности, исследовались экстракты Mikania cordata и их влияние на воспалительные процессы.

Заявителем были проведены в последнее время исследования антипролиферативной активности и было неожиданно обнаружено, что экстракт, обогащенный дигидромиканолидом и миканолидом, так же, как эти же соединения в чистом виде, обладают мощной активностью. Кроме того, дигидромиканолид и миканолид ингибируют репликацию ДНК, ингибируя ДНК-полимеразные ферменты, необходимые для размножения эукариотных и прокариотных клеток, а также вирусов.

Согласно изобретению, вышеупомянутый экстракт, полученный из листьев Mikania micrantha, Mikania scandens и Mikania cordata, содержит более 50%, предпочтительно, более 60% миканолида и дигидромиканолида. Еще более предпочтительно, вышеупомянутый экстракт содержит более 70% миканолида и дигидромиканолида. Предпочтительно, вышеупомянутый экстракт содержит при этом меньше 10%, более предпочтительно, меньше 5% сканденолида и дигидросканденолида. При этом предпочтительны также экстракты, содержащие более 20% дигидромиканолида и, более предпочтительно, более 30% дигидромиканолида.

Вышеупомянутый экстракт может быть получен методом экстракции, описанным ниже, из Mikania micrantha, при этом виды Mikania scandens и Mikania cordata не удаляют.

Таким образом, изобретение касается способа получения экстракта, характеризующегося тем, что он включает последовательно осуществляемые следующие стадии:

- измельчение и сушка листьев Mikania micrantha, Mikania scandens и Mikania cordata;

- добавление к измельченным листьям Mikania micrantha, Mikania scandens и Mikania cordata растворителя, выбираемого из толуола, этилацетата, смесей толуола с этилацетатом, смесей толуола с ацетоном, смесей этилацетата с гептаном и смесей гептана с ацетоном в соотношениях от 7:3 до 3:7;

- фильтрация и извлечение фильтрата;

концентрирование экстракта раствора первичного экстрагирования с получением концентрации от 2,5 до 10% на сухой экстракт;

- распределение концентрированного экстракта, полученного на предыдущей стадии, между экстрагирующим растворителем и смесью, содержащей от 10 до 50% метанола или этанола в воде;

промывание водно-спиртовой фазы н-гексаном или гептаном;

- удаление спирта из водно-спиртовой фазы;

- экстрагирование полученной водной фазы этилацетатом;

- сушка этилацетатной фазы при помощи осушителя;

- выпаривание растворителей и выделение сухого экстракта;

- очистка полученного сухого экстракта посредством физико-химического метода разделения и

- получение, после сушки, сухого экстракта согласно изобретению.

Согласно изобретению физико-химическим методом разделения может быть, например, фильтрация через силикагель, или же согласно предпочтительному варианту кристаллизация в метаноле, этаноле или ацетоне.

Если выбирают фильтрацию через силикагель, то используемыми элюентами будут, предпочтительно, смеси гептан-этилацетат в соотношениях от 9:1 до 1:1.

Если выбирают кристаллизацию, то ее осуществляют, предпочтительно, при температуре в интервале от -10 до 5°С в течение времени, предпочтительно, от 2 до 16 часов.

При этом согласно предпочтительному варианту вышеупомянутого способа распределение концентрированного экстракта осуществляют при помощи смеси, содержащей от 25 до 30% метанола в воде. Предпочтительно, нижнюю водную фазу нагревают, чтобы облегчить разделение фаз, например, до температуры в интервале от 30 до 50°С.

Сухой экстракт, полученный вышеупомянутым способом, может быть обогащен дигидромиканолидом, путем конверсии миканолида в дигидромиканолид каталитическим гидрированием. Дальнейшая перекристаллизация позволяет получить соединение в чистом виде.

Следовательно, объектом изобретения является также способ получения экстракта, обогащенного дигидромиканолидом, заключающийся в гидрировании сухого экстракта, описанного выше, растворенного в этилацетате, при температуре в интервале от 10 до 35°С в присутствии катализатора гидрирования при давлении водорода от 1 до 2 атмосфер в течение времени, составляющего, предпочтительно, от 4 до 16 часов. Предпочтительно, катализатором гидрирования является Pd/СаСО₃.

Кроме того, изобретение касается сухого экстракта, сильно обогащенного дигидромиканолидом, полученного способом гидрирования, описанным выше, с последующим выпариванием растворителей реакции после удаления катализатора путем фильтрации, при этом вышеупомянутый сухой экстракт отличается тем, что он содержит, по меньшей мере, 50% дигидромиканолида и, предпочтительно, по меньшей мере, 92% дигидромиканолида (фармацевтического качества).

Согласно изобретению после гидрирования можно непосредственно получить дигидромиканолид путем добавления жидкого н-алкана к раствору экстракта, обогащенного дигидромиканолидом, в этилацетате и выделения вышеупомянутого дигидромиканолида путем фильтрации. Предпочтительно, н-алкан, используемый для того, чтобы вызвать кристаллизацию, представляет собой н-гексан или н-гептан, более предпочтительно, н-гептан.

Способ, описанный выше, обладает тем преимуществом, что позволяет получить дигидромиканолид со степенью чистоты больше 92% без необходимости прибегать к разделению хроматографического типа.

Различные способы, описанные выше, а также другие возможные варианты, будут детально описаны в разделе под названием "Получение продуктов согласно изобретению".

Заявитель обнаружил, что миканолид, дигидромиканолид и различные экстракты согласно изобретению обладают интересными фармакологическими свойствами и проявляют себя, в частности, в качестве антипролиферативных средств (в частности, в качестве противоракового средства), в качестве противовирусных средств или противопаразитарных средств. Указанные свойства проиллюстрированы в разделе под названием "Фармакологическое исследование продуктов согласно изобретению".

Итак, объектом настоящего изобретения является также лекарственное средство, представляющее собой экстракт, обогащенный дигидромиканолидом, описанный выше, или дигидромиканолид. В частности, объектом изобретения является применение экстракта, описанного выше, миканолида или дигидромиканолида для получения лекарственного средства, предназначенного для ингибирования ДНК-полимераз. В частности, объектом изобретения является применение экстракта, описанного выше, миканолида или дигидромиканолида для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативных заболеваний, в частности, рака, а также вирусных заболеваний и паразитарных заболеваний, вызываемых простейшими (например, малярии) или одноклеточными организмами (например, заболеваний, вызываемых амебами). Кроме того, объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая экстракт, обогащенный дигидромиканолидом, описанный выше, или дигидромиканолид в качестве действующего начала, в случае необходимости, с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

Для применений согласно изобретению предпочитают дигидромиканолид или экстракт, обогащенный дигидромиканолидом. Более предпочтительно, для применений согласно изобретению выбирают дигидромиканолид.

Фармацевтическая композиция согласно изобретению может находиться в форме твердого вещества, например, порошков, гранул, таблеток, желатиновых капсул, липосом или свечей. Подходящими твердыми носителями могут быть, например, фосфат кальция, стеарат магния, тальк, сахара, лактоза, декстрин, крахмал, желатина, целлюлоза, метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, поливинилпирролидин и воск.

Фармацевтические композиции согласно изобретению, содержащие дигидромиканолид, могут также находиться в форме жидкости, например, растворов, эмульсий, суспензий или сиропов. Подходящими жидкими носителями могут быть, например, вода, органические растворители, такие, как глицерин или гликоли, а также их смеси в различных соотношениях в воде.

Введение лекарственного средства согласно изобретению может осуществляться путем местного нанесения, перорально, парентерально, путем внутримышечной инъекции, и т.д.

Предполагаемая доза введения лекарственного средства согласно изобретению составляет от 0,1 мг до 10 г в зависимости от типа используемого действующего вещества.

ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ

Для первичной экстракции могут быть использованы следующие растворители:

- группа I: толуол, этилацетат, смеси толуола с этилацетатом, смеси толуола с ацетоном, смеси этилацетата с гептаном и смеси гептана с ацетоном в соотношениях от 7:3 до 3:7, предпочтительно, в соотношении 1:1 (составы смесей выражены в объемах на объем);

- группа II: ацетон, этанол и метанол;

- группа III: смеси ацетона с водой, этанола с водой или метанола с водой в соотношениях от 9:1 до 1:1 (составы смесей выражены в объемах на объем, если не указано противоположное).

Предпочтительно, растворителем, используемым на первой фазе экстракции, является этилацетат.

Согласно изобретению первичный экстракт разделяют в смеси, содержащей от 10% до 50% метанола или этанола в воде, предпочтительно, в смеси, содержащей от 25% до 40% метанола в воде, при температуре, предпочтительно, в интервале от 15 до 50°С. Предпочтительно, нижнюю водную фазу нагревают, например, до температуры в интервале от 30 до 50°С, чтобы получить более четкое разделение фаз.

В случае, если первичную экстракцию осуществляют при помощи растворителя или смеси растворителей группы I, то перед разделением проводят концентрирование раствора первичного экстракта до получения раствора с концентрацией от 2,5 до 10%, в расчете на сухой экстракт.

В случае, если первичную экстракцию осуществляют при помощи растворителя группы II, то перед разделением первичного экстракта осуществляют концентрированно раствора первичного экстракта до получения концентрации около 50%, в расчете на сухой экстракт, с последующим разбавлением концентрированного экстракта с получением разбавленного экстракта, содержащего от 2,5 до 10% сухого экстракта, причем вышеупомянутое разбавление осуществляют при помощи растворителя или смеси растворителей группы I, предпочтительно, в этилацетате.

В случае, если первичную экстракцию осуществляют при помощи растворителя группы III, то перед разделением первичного экстракта осуществляют упаривание раствора первичного экстракта до получения раствора с концентрацией от 5 до 25%, в расчете на сухой экстракт, которое осуществляют для того, чтобы удалить растворители, смешивающиеся с водой. Затем экстрагируют при помощи растворителя или смеси растворителей группы I, предпочтительно, этилацетата.

После однократного разделения первичного экстракта (который, в случае необходимости, был подвергнут предварительным операциям, описанным выше), водно-спиртовую фазу промывают н-гексаном или гептаном, предпочтительно, гептаном, таким образом, чтобы удалить хлорофиллы, стерины и другие растительные липиды.

Спирт удаляют из водно-спиртовой фазы путем выпаривания и осуществляют новую экстракцию полученной водной фазы при помощи этилацетата.

Затем этилацетатную фазу сушат над осушителем, таким, как безводный MgSO₄ или Na₂SО ₄, фильтруют и выпаривают досуха.

Сухой экстракт, полученный на предыдущей стадии, может быть очищен путем фильтрования, например, фильтрования через силикагель, используя загрузку, составляющую от 2 до 20%, предпочтительно, около 5%, элюируя смесями гептан-этилацетат в соотношении, от 8:2 до 1:1, предпочтительно, 7:3, или смесями толуол-ацетон в соотношении от 9:1 до 6:4, предпочтительно, 7:3. Фильтрат концентрируют досуха с получением согласно изобретению экстракта, обогащенного миканолидом и дигидромиканолидом.

В качестве альтернативы, сухой экстракт может быть очищен перекристаллизацией из метанола, этанола или ацетона, например, из метанольного раствора, содержащего сухой экстракт в концентрации около 10%, при этом смесь выдерживают в течение времени, предпочтительно, от 12 до 16 часов при температуре, находящейся, предпочтительно, в интервале от -10 до 5°С. После фильтрования (или цетрифугирования), промывания кристаллов небольшим количеством метанола и сушки получают экстракт, обогащенный миканолидом и дигидромиканолидом.

Для превращения миканолида в дигидромиканолид может быть осуществлена стадия гидрирования, например, путем растворения полученного экстракта в этилацетате при температуре, находящейся, предпочтительно, в интервале от 10 до 35°С, в присутствии катализатора, такого, как 5%-ный Pd/СаСО₃, под давлением водорода от 1 до 2 атмосфер. Данная стадия гидрирования имеет, кроме того, то преимущество, что облегчает очистку смеси, состоящей из экстракта, обогащенного миканолидом и дигидромиканолидом.

Кристаллизацию дигидромиканолида из концентрированного раствора в этилацетате осуществляют путем добавления жидкого н-алкана, например, н-гептана или н-гексана, предпочтительно, н-гептана. В этом случае получают дигидромиканолид со степенью чистоты, по меньшей мере, равной 92%.

Если нет иных указаний, то все используемые в описании технические и научные, термины имеют то же самое значение, что и значение, обычно понимаемое рядовым специалистом области, к которой принадлежит данное изобретение. Также, все публикации, заявки на патенты, все патенты и все другие материалы, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылки.

Следующие примеры представлены для того, чтобы проиллюстрировать операции, описанные выше, и не должны рассматриваться как ограничительные для объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1:

Сто грамм (100 г) сухих листьев (содержащих менее 10% влаги) Mikania micrantha (с их стеблями), собранных между маем и июлем в местности около Sungei Ara, Penang (Малайзия), измельчают в мельнице с получением частиц размером меньше 4 мм. После добавления 1 л этилацетата смесь интенсивно перемешивают в течение 30 минут при температуре от 55 до 60°С. Твердый остаток отделяют фильтрованием и подвергают второй экстракции в тех же самых условиях. Экстракты первой и второй стадий экстракции объединяют. Экстракт концентрируют при пониженном давлении до получения концентрации содержащегося в нем твердого вещества около 5%, что соответствует объему, приблизительно, 110 мл. Тогда добавляют 40 мл н-гептана.

К экстракту добавляют 125 мл смеси метанол-вода 1:2 и интенсивно перемешивают в сосуде для декантации и дают отстояться. Нижнюю водную фазу нагревают, приблизительно, до 40-50°С, чтобы разрушить возможные эмульсии и облегчить разделение фаз. Фазу вода-метанол сливают снизу. Разделение повторяют еще два раза, используя каждый раз 50 мл смеси метанол-вода 1:3.

Тогда к раствору метанол-вода добавляют 20 мл н-гептана. После интенсивного перемешивания в декантационном сосуде разделяют две фазы. Обезжиренный раствор метанол-вода затем сливают снизу.

Тогда раствор метанол-вода концентрируют при пониженном давлении, чтобы удалить метанол и получить водную суспензию.

К водной суспензии добавляют 100 мл этилацетата и 15 г хлорида натрия. Смесь интенсивно перемешивают в декантационном сосуде и затем дают отстояться. Экстракцию в системе жидкость-жидкость повторяют один раз с 50 мл этилацетата.

Объединенные этилацетатные экстракты сушат добавлением приблизительно 30 г MgSО₄ , причем смесь, перед тем как ее фильтровать, перемешивают в течение приблизительно 10-20 минут (при этом MgSО₄ 2 раза промывают 25 мл этилацетата). Объединенные фильтрат и этилацетат, использованный для промывки, затем выпаривают досуха при пониженном давлении.

Полученный твердый экстракт затем растворяют в 5 мл МеОН и оставляют кристаллизоваться при 4°С на 16 часов. Тогда фильтруют через стеклянный фильтр, при этом выделенные кристаллы промывают 2 мл МеОН при 4°С. После сушки в вакуумной печи получают 481,2 мг сухого экстракта.

Анализ полученного сухого экстракта методом ВЭЖХ дает следующие результаты:

Соединение	Массовое содержание
Миканолид	68,0%
Дигидромиканолид	25%
Сканденолид	5%

Пример 2:

Используют ту же самую методику, что и в примере 1, за исключением того, что вместо добавления 5 мл МеОН после сушки над MgSO₄ и осуществления кристаллизации добавляют 2,8 г целита и выпаривают растворители досуха. Затем фильтруют через слой диоксида кремния (12 г SiO₂ 35-70 мкм). Сначала 4 раза пропускают по 26 мл (т.е. четырехкратный объем колонны) смеси гептан/этилацетат 2:8 (при этом удаляют соответствующие фракции), затем 14 раз по 26 мл смеси гептан/этилацетат 6:4 (при этом выделяют соответствующие фракции). Выделенные фракции объединяют и выпаривают досуха с получением конечного сухого экстракта.

Пример 3:

330 мг сухого экстракта, полученного в примере 1, растворяют в 80 мл этилацетата и раствор, к которому добавляют 248 мг 5% Pd/СаСО₃, помещают в поток водорода (давление составляет от 1 до 2 атмосфер). Перемешивание и поток водорода поддерживают в течение ночи и окончание реакции контролируют методом ВЭЖХ. По окончании реакции добавляют 1 г целита и перемешивают в течение 10 минут. Затем добавляют 5 г безводного MgSO₄ и удаляют твердые вещества фильтрованием через целит. Целит 2 раза промывают 10 мл этилацетата, затем растворители удаляют выпариванием досуха. К выделенному твердому веществу добавляют 3 мл ацетона, затем 3 мл гептана. Частично выпаривают растворители на роторном испарителе при 50°С, затем охлаждают до 0°С при помощи ледяной бани. После фильтрования твердое вещество промывают 2 раза 1 мл смеси ацетон/гептан 50/50. Затем выпаривают досуха и выделяют 214 мг дигидромиканолида.

Спектр ЯМР ¹H (DMSO d6, 400 МГц, ): 0,96 (с, 3Н); 1,25-1,27 (д, 3Н); 1,84-1,89 (м, 1Н); 2,04-2,10 (м, 1Н); 2,49-2,50 (т, 1Н); 2,93-2,98 (м, 1Н); 3,19 (с, 1Н); 3,38-3,39 (д, 1Н); 3,98-3,99 (д, 1Н); 4,62-4,68 (м, 1Н); 5,42-5,43 (д, 1Н); 7,61-7,62 (д, 1Н). Спектр ЯМР ¹³С (DMSO d6, ): 13,3; 20,9; 39,7; 41,1; 42,3; 50,3; 52,3; 54,9; 57,5; 76,7; 81,8; 128,7; 149,9; 171,1; 176,1.

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ

В качестве примера исследуют влияние обработки соединениями согласно изобретению на:

- включение цитозина, меченного ³²Р, в ДНК в присутствии ДНК-полимеразы (неклеточная система);

- включение тимидина, меченного тритием, в ДНК опухолевых клеток, делящихся в течение короткого времени (клеточная система);

- пролиферацию двух линий человеческих клеток Mia-Paca2 и DU145.

1) Процедуры

Клеточные линии

Клеточные линии DU145 (человеческие клетки рака предстательной железы), НТ29 (рака ободочной кишки) и Mia-Paca2 (человеческие клетки рака поджелудочной железы) были приобретены у Американской коллекции тканевых культур (Роквилл, Мэрилэнд, США) (Rockvill, Maryland, USA).

Включение цитозина, меченного ³²P, в ДНК в присутствии ДНК-полимеразы в неклеточной системе

Введение метки в ДНК осуществляют на фрагменте ДНК, который включает нуклеотиды благодаря активности фермента ДНК-полимеразы. Из упомянутых нуклеотидов дЦТФ (dCTP) помечен радиоактивным фосфором (³²P).

Плазмидную ДНК (пкДНК 3, инвитроген, Нидерланды) разбавляют до концентрации 2 нг в 45 мкл раствора ТЭ (10 ммоль/л Трис-HCl; рН 8,0; 1 ммоль/л ЭДТА), затем денатурируют нагреванием при 100°С в течение 10 мин перед тем, как перенести непосредственно в лед. Денатурированную ДНК помещают в пробирку, которая содержит буферный раствор дАТФ, дГТФ, дТТФ, фермент ДНК-полимеразы Кленова без экзонуклеазы и случайные затравки (Rediprime II система случайного мечения затравки RPN 1633, RPN 1634, Amersham pharmacia biotech). Чтобы запустить реакцию, добавляют 2 мкл Redivue [³²Р] дЦТФ (1-дезоксицитидин 5'(- ³²P), удельная активность 250 мкКи, Amersham). Реакцию осуществляют в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения в течение 10 мин при 37°С или 1 часа при комнатной температуре. Реакцию прекращают добавлением 5 мкл 0,2М ЭДТА. Чтобы выделить ДНК, добавляют 200 мкл изопропанола и осадок ДНК извлекают после 10 мин центрифугирования при скорости 12000 об/мин и последующего промывания в 70%-ном этаноле. После окончательной сушки на воздухе ДНК растворяют в 50 мкл ТЭ. 10 мкл считают в 5 мл сцинтиллятора (Instagel^® plus и сцинтилляционный счетчик Packard). Результаты выражены в процентах ингибирования включения меченого нуклеотида в образце по отношению к контрольному образцу

(100 - (число импульсов в мин (DPM) в образце/ число импульсов в мин в контрольном образце)·100).

Включение тимидина, меченного тритием, в ДНК клеток в фазе экспоненциального роста (in vitro)

Клетки НТ 29 засевают в 96-луночные планшеты (культуральный планшет-96, Packard; 4000 клеток в лунку) со средой (DMEM), Gibco BRL, дополненная 10% сыворотки плода теленка, Gibco BRL). На третий день среду удаляют и заменяют средой, содержащей тимидин, меченный тритием (5'-тимидин, TRK.328, 1 мКи, 0,6 мкКи/лунку, Amersham) с исследуемым веществом или без него (интервал от 100 до 0,19 мкг/мл с разбавлениями 1/2). Обработки осуществляют в течение 1 часа. Затем среду удаляют и клетки промывают 2 раза 200 мкл фосфатно-буферным раствором (PBS) (Gibco BRL). Добавляют лизирующий раствор (ДСН (SDS) 1,25%; ЭДТА 5 мМ) и оставляют в течение 10 минут при комнатной температуре, затем добавляют 75 мкл жидкого сцинтиллятора (Microscint^®40, Packard). Считывание осуществляют на приборе Topcount^® (Packard). Результаты выражены в процентах ингибирования включения меченого нуклеотида в образце по отношению к контрольному образцу

(100 - (число импульсов в мин в образце/число импульсов в мин в контрольном образце)·100).

Исследования клеточной пролиферации

Клетки, помещенные в 80 мкл среды Игла, модифицированной по способу Дульбекко (Gibco Bri, Cergy-Pontoise, France), дополненной 10% сыворотки плода теленка, инактивированной нагреванием (Gibco Brl, Cergy-Pontoise, France), 50000 единиц/л пенициллина и 50 мг/л стрептомицина (Gibco Brl, Cergy-Pontoise, France) и 2 мМ глутамина (Gibco Brl, Cergy-Pontoise, France) высевают на 96-луночный планшет в 0 день. На 1 день клетки обрабатывают в течение 96 часов увеличивающимися концентрациями каждого из тестируемых соединений вплоть до 50 мкг/мл. По окончании указанного периода количественные характеристики клеточной пролиферации оценивают колориметрически, основываясь на расщеплении соли тетразолия WST1 митохондриальными дегидрогеназами в жизнеспособных клетках, приводящем к образованию формазана (Boehringer Mannheim, Meylan, France). Данные исследования осуществляют дважды с 8 определениями для каждой исследуемой концентрации. Для каждого исследуемого соединения величины, находящиеся на линейном участке S-образной кривой, запоминают для анализа методом линейной регрессии и используют для оценки средней ингибирующей концентрации ИК₅₀ (CI₅₀). Продукты растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 10^-2 М и используют в культуре с конечной концентрацией ДМСО 0,5%.

2) Результаты

Результаты исследований ингибирования активности ДНК-полимераз представлены в таблице I, приведенной ниже.

Таблица I Ингибирование активности ДНК-полимеразы дигидромиканолидом и миканолидом (100 мкг/мл) в неклеточной системе
Соединение	Ингибирование включения (%)
Дигидромиканолид	73 (n=5; стандартное отклонение =7)
Миканолид	79,6 (n=3; стандартное отклонение =11,0)

Включение тимидина, меченного тритием, в ДНК человеческих клеток НТ 29 ингибируется, когда последние обрабатывают дигидромиканолидом и миканолидом (см. таблицу II, приведенную ниже).

Таблица II
Ингибирование введения (РВМ образец/РВМ контроль)
Концентрация (мкг/мл)	100	50	25
Дигидромиканолид	0,19	0,29	0,58
Миканолид	0,53	0,61	1,04

Наконец, в таблице III, приведенной ниже, представлены величины активностей ингибирования пролиферации in vitro no отношению к опухолевым человеческим клеткам DU145 и Mia-Paca2, обработанным миканолидом и соединениями примеров 1 и 2.

Таблица III Ингибирование пролиферации опухолевых человеческих клеток, обработанных миканолидом и соединениями примеров 1 и 2
Соединение	Средняя ингибирующая концентрация ИK50 (мкмоль/л)
	Mia-Paca2	DU145
Миканолид	3	15
Пример 1	1,6	4,6
Пример 2	1,3	4,3