питательная среда для выращивания клеточной культуры ajuga reptans l
Классы МПК: | C12N5/04 клетки или ткани растений |
Автор(ы): | Алексеева Л.И. (RU) |
Патентообладатель(и): | Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2004-01-22 публикация патента:
27.05.2005 |
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания растительных тканей, и может быть использована для получения биологически активных веществ, в частности экдистероидов. Питательная среда, позволяющая выращивать клеточную культуру Ajuga reptans L. на агаризованной модифицированной питательной среде, содержит макро- и микросоли по Мурасиге-Скугу, сахарозу – 30 г/л, инозитол – 100 мг/л. Витамины по Стаба содержит, мг/л: фолиевая кислота – 0,5; рибофлавин – 0,5; биотин – 1, Са-пантотенат – 1, пиридоксин – 1, тиамина хлорид – 1, никотинамид – 2, кобаламин – 0,0015 и поливинилпиролидон – 2 г/л, с добавлением -ситостерина от 5 мг/л до 50 мг/л или MnSO4· 5Н2О 606,5 мг/л. Изобретение позволяет увеличить содержание экдистероидов в клеточной культуре Ajuga reptans L. 2 табл.
Формула изобретения
Питательная среда для выращивания клеточной культуры Ajuga reptans L., характеризующаяся тем, что она содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:
Агар-агар 8000
KNO3 1900
NH4NO3 1650
СаСl2 332
MgSO4· 7Н2О 370
КН2РО4 170
FeSO4· 7Н2О 27,85
Nа2 ЭДТА 37,25
Н3ВО 3 6,2
МnSO4· 5Н2 O 24,1
ZnSO4· 7Н2 О 8,6
Nа2МоО4 0,25
КI 0,83
CuSO4· 5Н2О 0,025
СоСl2· 6Н2О 0,025
сахароза 30000
инозитол 100
фолиевая кислота 0,5
рибофлавин 0,5
биотин 1
Са-пантотенат 1
пиридоксин 1
тиамина хлорид 1
никотинамид 2
кобаламин 0,0015
поливинилпиролидон 2000
-ситостерин или 5-50
MnSO4· 5Н2О 606,5
вода до 1 л
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания растительных тканей, и может быть использовано для получения биологически активных веществ, в частности экдистероидов.
Питательная среда для выращивания клеточной культуры Ajuga reptans L. из патентных источников не выявлена. Наиболее близкой к заявленному изобретению является агаризованная питательная среда для выращивания клеточной культуры Ajuga reptans L. (Володин В.В. Экдистероиды в интактных растениях и клеточных культурах // Автореферат дис. доктора биол. наук. 1999. Москва. 52 с.) следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге-Скугу, сахароза - 30 г/л, инозитол - 100 мг/л и витамины по Стаба, мг/л: фолиевая кислота - 0,5; рибофлавин - 0,5; биотин - 1; Са-пантотенат - 1; пиридоксин - 1; тиамина хлорид - 1; никотинамид - 2; кобаламин - 0,0015 и поливинилпиролидон - 2 г/л. Данный состав питательной среды не позволяет получить клеточные культуры с высоким содержанием экдистероидов.
Технический результат настоящего изобретения состоит в определении состава питательной среды для получения клеточной культуры Ajuga reptans L. с высоким содержанием экдистероидов.
Технический результат достигается тем, что клеточную культуру Ajuga reptans L. выращивают на агаризованной питательной среде, которая в отличие от прототипа содержит дополнительно -ситостерин 5-50 мг/л или дополнительно MnSO4· 5H2O 606,5 мг/л.
Пример 1. Контроль (по прототипу).
Для получения клеточной культуры Ajuga reptans L. готовили питательную среду, используя химически чистые реактивы. Готовили агаризованную питательную среду следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге-Скугу, сахароза - 30 г/л, инозитол - 100 мг/л и витамины по Стаба, мг/л: фолиевая кислота - 0,5; рибофлавин - 0,5; биотин -1; Са-пантотенат - 1; пиридоксин - 1; тиамина хлорид - 1; никотинамид - 2; кобаламин - 0,0015 и поливинилпиролидон - 2 г/л. Среду стерилизовали в автоклаве 10 мин при 1 атм. Чашки Петри стерилизовали в сухожаровом шкафу при 180° С, завернутые в бумагу Крафт. В стерильном боксе в чашки Петри разливали по 40 мл питательной среды. Первичную клеточную культуру Ajuga reptans L. пассировали на агаризованную среду. Чашки Петри термостатировали при 26±1°С в условиях темноты. Спустя 4 недели определяли интенсивность роста и содержание экдистероидов в клеточной культуре. Интенсивность роста определяли по изменению сырой массы клеток в цикле выращивания. Повторность вариантов для клеточных культур 5-ти кратная.
Экдистероиды определяли в биомассе клеточных культур, которую высушивали при 60° С в течение 24 часов. 50-80 мг высушенной измельченной пробы экстрагировали метанолом в течение 16-18 ч. После центрифугирования аликвоту 1 мл разбавляли дистиллированной водой (1:4) и пропускали через концентрирующий патрон Диапак С 16 (БиоХимМак, Россия). Сорбированные экдистероиды элюировали 3 мл 60%-ного метанола и анализировали ВЭЖХ. Анализ экдистероидов из клеточных культур проводили на хроматографической системе Varian, Pro Star (США), колонка Diasorb C16/T (150× 4мм) (БиоХимМак, Россия), размер частиц 7 мкм; состав элюента: ацетонитрил-вода (100:20, по объему); скорость элюции - 1.5 мл/мин. Детектирование проводили при =242 нм. В качестве стандартов веществ использовали эталонные образцы экдистероидов, полученные в лаборатории биохимии и биотехнологии растений (Институт биологии Коми НЦ УрО РАН). Количество экдистероидов рассчитывали методом абсолютной калибровки.
Содержание в клеточной культуре Ajuga reptans L. 20-гидроксиэкдизона составило 0,293±0,010 мг/г сухой массы, 29-норциастерона + 29-норсенгостерона - 0,031±0,001 мг/г, аюгалактона - 0,096±0,010 мг/г, суммы экдистероидов - 0,420 мг/г.
Пример 2-4.
Получение клеточной культуры проводят аналогично примеру 1, различием является добавление в среду -ситостерина в количестве 5 мг/л; 25 мг/л; 50 мг/л. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1 | ||||||
Варианты | Концентра ция - ситостерина в среде, мг/л | Индекс роста по сырой массе | Содержание экдистероидов, мг/г сухой массы | |||
20-гидроксиэкдизон | 29-норциасте рон + 29-норсенгос терон | Аюгалактон | Сумма экдистероидов | |||
1 | Контроль | 8,58±0,87 | 0,293±0,010 | 0,031±0,001 | 0,096±0,010 | 0,420 |
2 | 5 | 7,36±0,52 | 0,250±0,010 | 0,031±0,001 | 0,233±0,047 | 0,514 |
3 | 25 | 10,18±0,76 | 1,041±0,031 | 0,567±0,044 | 0,527±0,023 | 2,135 |
4 | 50 | 12,00±0,78 | 1,228±0,047 | 0,166±0,007 | 1,058±0,089 | 2,452 |
При концентрации в среде -ситостерина 5 мг/л увеличение концентрации аюгалактона составляет 242%. При концентрации в среде -ситостерина 25 мг/л увеличение концентрации 20-гидроксиэкдизона составляет 355%, концентрации 29-норциастерона + 29-норсенгостерона - 1830%, концентрации аюгалактона - 549%, суммы экдистероидов - 508%. При концентрации в среде -ситостерина 50 мг/л увеличение концентрации 20-гидроксиэкдизона составляет 419%, концентрации 29-норциастерона + 29-норсенгостерона - 535%, концентрации аюгалактона - 1102%, суммы экдистероидов - 584%.
Пример 5.
Получение клеточной культуры проводят аналогично примеру 1, различием является добавление в среду дополнительно МnSO4· 5Н2О 606,5 мг/л. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2 | ||||||
Варианты | Концентрация MnSO4· 5H2O, мг/л | Индекс роста по сырой массе | Содержание экдистероидов, мг/г сухой массы | |||
20-гидроксиэкдизон | 29-норциастерон + 29-норсенгостерон | Аюгалактон | Сумма экдисте роидов | |||
1 | Контроль(по прототипу) (24,1) | 8,58±0,87 | 0,293±0,010 | 0,031±0,001 | 0,096±0,010 | 0,420 |
5 | 630,6 | 13,94±1,70 | 0,905±0,010 | 0,401±0,010 | 0,612±0,047 | 1,918 |
При концентрации в среде MnSO4· 5H2O 630,6 мг/л увеличение концентрации 20-гидроксиэкдизона составляет 309%, концентрации 29-норциастерона + 29-норсенгостерона - 1294%, концентрации аюгалактона - 638%, суммы экдистероидов - 456%.
Таким образом, применение предлагаемого состава питательной среды позволяет увеличить содержание экдистероидов в клеточной культуре Ajuga reptans L.
Класс C12N5/04 клетки или ткани растений