способ прогнозирования течения ротавирусной инфекции у детей

Формула изобретения

Способ прогнозирования длительности течения ротавирусной инфекции у детей, отличающийся тем, что в копрофильтратах больных в одном диагностикуме одновременно определяют наличие ротавирусного антигена и антител к ротавирусу путем сорбции антигена в копрофильтратах и соединения надосадочной жидкости с пулом фекалий, содержащим ротавирусный антиген в количестве 0,400-0,500 отн. ед., выдерживания в термостате с последующим внесением в панель с иммобилизованными антителами, наличие антител устанавливают по снижению уровня тест-антигена и при содержании антигена более 1,3 отн. ед. и антител менее 0,30 отн. ед. прогнозируют течение инфекции 6-8 дней, а при содежании антигена более 1,3 отн. ед. и антител более 0,60-0,80 отн. ед. прогнозируют течение инфекции 2-3 дня.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к области медицины, точнее к инфектологии, и предназначено для прогнозирования ротавирусной инфекции у детей в первые дни заболевания.

Острые кишечные инфекции (ОКИ) остаются одной из актуальных проблем педиатрии. Это обусловлено их широкой распространенностью во всем мире, сохраняющейся высокой летальностью, особенно у детей в возрасте до 5-ти лет. В России у детей ОКИ устойчиво занимают 2-3-е место среди всех инфекционных заболеваний (Учайкин В.Ф., 1999, Новокшенов А.И. с соавт., 2000; Bern С., Glass R.I., 1994). Гастроэнтериты вирусной этиологии составляют более 50% всех острых кишечных инфекций у детей. Ведущее этиологическое значение имеют ротавирусы, выявляемые в 58,3% всех вирусных гастроэнтеритов.

Ротавирусная инфекция - острое заразное заболевание человека и животных, вызываемое ротавирусами, относится к группе кишечных инфекций, характеризующееся поражением желудочно-кишечного тракта по типу гастроэнтерита. Обычно заболевание имеет острое начало с триады симптомов: подъем температуры тела, рвота и диарея. В части случаев описано постепенное развитие симптоматики с нарастанием тяжести процесса и развитием обезвоживания. В клинической картине ротавирусного гастроэнтерита в период развернутых клинических проявлений ведущими являются синдромы гастроэнтерита и интоксикации. Синдром гастроэнтерита характеризуется развитием диареи, снижением аппетита, появлением урчания и болей в животе, тошноты и рвоты. Рвота обычно предшествует или появляется одновременно с развитием диареи. Характерна повторная рвота, многократная, но у всех она непродолжительная, 1-3 дня. Длительность лихорадочной реакции составляет в среднем 2-4 дня, в единичных случаях она продолжается до 8 дней (Машилов В.П., 1997; Васильев и др., 2000). Боль локализуется преимущественно в верхней половине живота или является диффузной, она может быть различной интенсивности. Почти всегда она сопровождается громким урчанием в животе.

Диарея характеризуется обильным водянистым пенистым стулом желтого цвета без патологических примесей. В части случаев имеется зеленоватое окрашивание и примесь прозрачной слизи, смешанной с фекалиями (Учайкин В.Ф., 1999; Грачева Н.М., Аваков А.А., Блохина И.Т., 1998). Кратность дефекации составляет от 2-5 раз в сутки до 20 и более раз. Продолжительность диареи - 3-6 дней, в отдельных случаях до 8 дней. Потери жидкости и электролитов вследствие рвоты и диареи могут быть значительными и приводят к развитию дегидратации (эксикоза). При дегидратации I-II степени отмечается жажда, сухость во рту, слабость, бледность, дегидратация III степени характеризуется наряду с этими симптомами также осиплостью голоса, судорогами мышц конечностей, акроцианозом, снижением тургора кожи, уменьшением диуреза. Описанные случаи ротавирусного заболевания с летальным исходом относятся именно к этому виду осложнений. Синдром эксикоза чаще всего развивается на 3-4 день от начала гастроэнтерита, таким образом, вовремя диагностированное и правильно спрогнозированное заболевание позволяет принять адекватные меры для предотвращения развития осложнения.

В настоящее время диагностические приемы при ротавирусной инфекции и прогнозирование проводится по клиническим особенностям течения болезни и по вирусологическим методам лабораторной диагностики. Прогноз течения ротавирусной инфекции осуществляется по выраженности отдельных клинических проявлений, характерных для ротавирусного гастроэнтерита. Прогностически более длительное и тяжелое течение заболевания у детей ожидается в случае одновременного развития всех симптомов, в то время как проявление только одного симптома позволяет прогнозировать более легкое и быстрое течение болезни.

Однако постановка диагноза ротавирусного гастроэнтерита, а следовательно, и прогноз только по клинической картине представляют определенные сложности ввиду отсутствия симптомов, строго патогномоничных для этой патологии, в связи с чем диагноз “ротавирусный гастроэнтерит” нуждается в лабораторном подтверждении (Грачева Н.М., Аваков А.А., Блохина И.Т., 1998).

Существует ряд способов диагностики и прогнозирования ротавирусной инфекции с помощью вирусологических методов. Высокая чувствительность этих методов обуславливает возможность его применения для диагностики и прогнозирования ротавирусного гастроэнтерита в ранние сроки болезни. К этим методам относятся иммуноферментный анализ (ИФА), реакция нейтрализации гемагглютинации (РНГА) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

Недостатком всех перечисленных методов является необходимость использования как минимум двух диагностикумов для выявления ротавируса и противоротавирусных антител, что затрудняет постановку диагноза и прогноза из-за дороговизны диагностикумов, длительности методов.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ диагностики с попыткой прогнозирования течения ротавирусной инфекции по тестированию антител к ротавирусам в ИФА (Васильев Б.Я., Васильева Р.И., Лобзин Ю.В. Острые кишечные заболевания. Ротавирусы и ротавирусная инфекция). Метод высокоспецифичен, чувствителен. Он заключается в выявлении антител в крови больных на планшетах с иммобилизированным ротавирусным антигеном. Выполняется он стандартно, как и все иммуноферментные тесты: сыворотка больного вносится в лунки таких панелей, через 2 часа после отмывания в эти планшеты вносится человеческий IgG bkb IgM, ортофенилендиамином или другими проявителями перекисного окисления.

Недостатками этого метода являются возможность тестирования антител только в крови, так как в реакции проявляются только антитела этих классов иммуноглобулинов. Местные антитела типа IgA в такой реакции не уловятся. Другим недостатком является то, что при полном обследовании необходимо 3 типа различных ИФА - диагностикумов - для выявления антигена, антител класса IgM и IgG.

Таким образом, с помощью этого метода трудно осуществить прогнозирование на ранних стадиях заболевания и своевременно назначить терапию, а следовательно предупредить развитие осложнения.

С целью устранения указанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ прогнозирования течения ротавирусной инфекции с использованием иммуноферментного определения наличия в копрофильтратах больных ротавирусного антигена и противовирусных антител, который отличается тем, что для подобного определения используют в иммуноферментном анализе один диагностикум для тестирования антигена, причем наряду с тестированием антигена проводят его сорбцию в копрофильтратах больных, а в таких пробах с удаленным антигеном определяют местные антиротавирусные антитела. Для этого пробы с десорбированным антигеном соединяют в количестве 50 мкл с равным объемом стандартного ротавирусного антигена, содержащего 0,400-0,500 оптических единиц активности при его тестировании в ИФА, пробы выдерживают в термостате при 37°, вносят в стандартную тест-систему для тестирования ротавирусного антигена и определяют уровень не нейтрализованного антигена. Способ отличается тем, что в копрофильтратах расчитывают уровень местных антител в относительных единицах и прогнозируют длительное течение инфекции по наличию антигена > 1,3 относительных единиц при отсутствии антител, а при наличии антигена в той же концентрации и уровня антител порядка 0,600-0,800 относительных единиц - течение инфекции в пределах 2-3 дней.

Способ осуществляется следующим образом.

Из фекалий больных готовят 10-20% суспензию на физиологическом растворе и выдерживают ее в течение ночи при + 4°С. Приготовленные образцы осветляют центрифугированием при 2000 об/мин и перед постановкой способа хранят при - 20°С

При постановке способа полученные пробы вносят в лунки иммунофермантной тест-системы для обнаружения ротавирусных антигенов человека (производства НПП "Аквапаст") в количестве 100 мкл, выдерживают в течение 2 часов при 37°С во влажной камере. Собранную жидкость после сорбции с отсутствием вирусного антигена используют для определения антител.

В сорбированном материале определяют концентрацию ротавирусного антигена стандартным для данной тест-системы введением в лунки конъюгата и проведением ферментной реакции с использованием тетраметилбензидина, учет результатов проводят измерением оптической плотности при длине волны 450 нм с помощью многоканального спектрофотометра. Наличие ротавирусного антигена подтверждается отношением опытной пробы к отрицательному контролю > 1,3 (отн.ед.).

В жидкости после сорбции исследуемого материала определяют суммарные противоротавирусные антитела. С этой целью надосадок после первого этапа сорбции соединяют со стандартным, заранее протитрованным тест-антигеном ротавируса, содержащим 0,400-0,500 отн.ед. Таким тест-вирусом могут быть стандартный препарат антигена ротавируса промышленного производства или субстрат, приготовленный из фекалий больных ротавирусной инфекцией. Смесь надосадка и стандартного тест-вируса по 50 мкл помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем материал вносят в лунки тест-системы для определения ротавирусного антигена и выявляют уровень не нейтрализованного антителами тест-вируса по стандартной схеме определения антигена в указанной диагностической тест-системе. Контролем в этом случае служили лунки с внесенным в них стандартным тест-вирусом без проб от больных.

Уровень выявляемых антител рассчитывается по формуле А=(Воп.-Вк)/Вк, где:

А - уровень выявляемых антител в отн.ед (от 0,10-0,80 отн.ед.),

Воп. - ротавирусный антиген в опытной пробе после инактивации антителами,

Вк - ротавирусный антиген в контрольной пробе.

Следующий этап предлагаемого способа заключается в составлении прогноза течения ротавирусной инфекции у больных с наличием в фекалиях ротавирусного антигена (более 1,3 отн.ед.) и отсутствием противоротавирусных антител (менее 0,30 отн.ед), в противоположность больным при таком же уровне антигена и присутствием антител в концентрации 0,600-0,800 отн.ед.

Технический результат данного изобретения заключается в повышении точности прогноза.

Авторы впервые предложили использовать для прогноза течения ротавирусной инфекции у детей комплексную оценку показателей антигена и антител.

Предварительная сорбция копрофильтратов для удаления антигена позволяет более полно выявить местные антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов - IgA, IgM и IgG, не входящие в структуру специфических иммунных комплексов. Эти антитела выявляются с помощью тест-вируса - в виде копрофильтрата, содержащего антиген ротавируса в пределах 0,400-0,500 отн.ед. В специальных исследованиях нами установлено, что это оптимальная концентрация для выявления противовирусных антител. Меньшая доза вируса - в пределах 0,150-0,300 отн.ед., создает высокий процент ложноположительных реакций (до 20%), большая доза (>0,600 отн.ед.) приводит к выявлению минимальных концентраций антител.

Таким образом, данный способ позволяет при использовании одного иммуноферментного набора (для выявления ротавирусного антигена) тестировать и антиген и антитела. Антитела определяются суммарно всех классов, что дает возможность тестировать их вне зависимости от их структуры и происхождения. В то же время это создает условия для использования только одного вида иммуноферментного диагностикума.

При первичных обследованиях с тестированием тест-вируса и его рабочей дозы затрачиваемое время удваивается по отношению к времени для выявления одного антигена и составляет 5-6 часов. В дальнейшем при повторном использовании тест-вируса затрачиваемое время практически удлиняется на 30 мин по отношению к времени первично тестируемого антигена (2,5-3 часа).

Наш метод добавляет в диагностике ротавирусной инфекции 43,9% подтверждения обнаружения специфического Аг или Ат

Основные клинические симптомы, обуславливающие тяжесть течения заболевания, у этих больных были более выражены. Синдром интоксикации отмечался в 75% случаев и продолжался в среднем в течение 3 дней. Фебрильная лихорадка в первые дни заболевания наблюдалась у 66,7% больных, длительность всего лихорадочного периода в среднем составила 3,8 дня. Рвота продолжалась до 3 дней у 66,7% заболевших, синдром эксикоза I или II степени развивался в 75% наблюдаемых нами случаев. В данной группе больных продолжительность диареи, характерной для ротавирусной инфекции, достигала у 16,7% больных 6 дней, а в среднем составила 4,3 дня. Продолжительность всего периода ротавирусного гастроэнтерита в этой группе была от 6 до 8 дней.

При наличии и Аг и Ат в копрофильтратах в высоких концентрациях от 0,60 до 0,80 прогноз течения инфекции был более благоприятным. Так синдром интоксикации отмечался у 61,1% больных и длился не более 2 дней. Лихорадочный период был короче, чем в первой группе больных, и составил в среднем 2,9 дня, причем фебрильных цифр температура тела достигала лишь в 44,4% в первые дни заболевания. Продолжительность рвоты не превышала 2 дней и встречалась в 61,1% случаев. Эксикоз развивался в 38,9% случаев в основном I степени. Длительность диареи не превышала 3 дней. Таким образом, продолжительность ротавирусной инфекции в данной группе больных составила не более 3 дней.

Таким образом, предложенный нами способ легко выполним, представляет собой единую систему реакций ИФА, может выполняться в любых вирусологических лабораториях и позволяет спрогнозировать на ранних сроках заболевания течение ротавирусной инфекции только по вирусологическим показателям (уровень антигена и антител в копрофильтратах). Результатом такого прогнозирования является своевременное назначение рациональной терапии, а следовательно предупреждение развития осложнения. Экономическая эффективность метода безусловна, так как не требует включения в систему диагностикумов нескольких тестов.

Способ осуществляется следующим образом: используя надосадок копрофильтратов после сорбции антигена в классическом ИФА соединяют данные надосадки с пулом фекалий, содержащих ротавирусный антиген в количестве 0,400-0,500 отн.ед., выдерживают в термостате в течение 2 часов и вносят в панель с иммобилизированными антителами к ротавирусной инфекции. По снижению уровня тест-антигена более 0,30 отн.ед. устанавливают наличие антител в копрофильтрате больного. Прогноз осуществляют, оценивая количество и антигена и антител: по наличию в копрофильтрате антигена (>1,3) при отсутствии антител (0,30 отн.ед.) можно спрогнозировать более длительное течение инфекции от 6 до 8 дней. При наличии высоких концентраций антигена (>1,3 отн.ед.) и антител (0,69-0,80 отн.ед.) - течение не более 3 дней.

Описанный способ прогнозирования можно проиллюстрировать на конкретных примерах:

Пример 1.

Больной Коля М., 1 г. 4 мес., Ист. б. №608, диагноз: Острый ротавирусный гастроэнтерит, средней тяжести.

Из анамнеза известно, что заболел остро, сначала появился водянистый пенистый стул, в течение дня 5 раз, через несколько часов поднялась температура тела до 38°С. Утром следующего дня отмечалась однократная рвота и водянистый стул без патологических примесей. При этом ребенок был вялым, сонливым, аппетит отсутствовал, от приема воды отказывался. Госпитализирован в НИИ детских инфекций на 2-ой день заболевания.

При поступлении выражен синдром интоксикации, температура тела 37,2°С, продолжалась водянистая диарея до 4 раз в течение дня, при пальпации живота умеренная болезненность и урчание по ходу кишечника. Ребенок поступил в состоянии эксикоза I степени. Диагноз был поставлен на основании лабораторных вирусологических данных (ИФА, ПЭМ), а также типичной клинической картины гастроэнтерита. В анализе кала обнаружен ротавирусный Аг в количестве 1,47 усл.ед., а специфические Ат - 0,19. Применив наш способ, мы спрогнозировали неблагоприятное течение ротавирусного гастроэнтерита в данном случае и попытались предупредить возможные осложнения. Назначив с первых часов поступления адекватную терапию, удалось избежать нарастания эксикоза и утяжеления течения инфекции. Однако, так как ребенок поступил уже в состоянии эксикоза, предотвратить длительность течения гастроэнтерита не представлялось возможным. Клиническое выздоровление наступило лишь на 8-й день.

Пример 2.

Больной Саша А., 3 г. 9 мес., Ист. б. №1606, диагноз: Острый ротавирусный гастроэнтерит, легкой степени тяжести.

Из анамнеза известно: заболел остро, одновременно с многократной рвотой появился водянистый без патологических примесей стул, более 10 раз в течение дня. На следующий день температура тела поднялась до 37,5°С, рвоты продолжались, диарея прекратилась на 2-ой день заболевания. Ребенок был госпитализирован в клинику НИИ детских инфекций на второй день заболевания, вечером.

При поступлении: синдром интоксикации достаточно выражен (слабость, адинамия, отсутствие аппетита), рвота повторная, проявления эксикоза I степени. В ИФА анализе кала Аг - 1,35, Ат - 0,72. Диагноз также бал поставлен на основании вирусологического подтверждения. Наш прогноз в данном случае был благоприятным, несмотря на развившийся на догоспитальном этапе эксикоз, так как в копрофильтратах определялись специфические антитела в высоких концентрациях. Ребенку была назначена стандартная терапия. Синдромы интоксикации, эксикоза, лихорадки и рвоты купировались на 2-ой - 3-й день лечения, диарея больше не повторялась. Ребенок выписан домой с клиническим выздоровлением.

Нами было обследовано 120 больных, перенесших острый ротавирусный гастроэнтерит, что позволило выявить достоверную коррелятивную зависимость этих данных, диагностировать инфекцию на ранних сроках заболевания и спрогнозировать тяжесть течения у 55 больных. Данный способ позволил добиться снижения развития тяжелых форм заболевания, предупреждения нарастания выраженности клинических симптомов на госпитальном этапе, предупреждения развития осложненного течения благодаря ранней оценке возможных тяжести и длительности течения ротавирусной инфекции и в результате своевременного проведения необходимой терапии.