способ определения аллелопатической активности почвы

Формула изобретения

Способ определения аллелопатической активности почвы, включающий использование в качестве биотеста микроскопической водоросли хлореллы, распределение суспензии клеток хлореллы на бумажном фильтре на поверхности почвенной пластинки в чашках Петри, получение хлорофильного экстракта, определение оптической плотности экстракта и сравнение с контрольным вариантом, отличающийся тем, что в чашках Петри распределяют суспензию клеток хлореллы объемом 20 мл, чашки накрывают и ставят в светотеплицу, проводят экспозицию в течение 7 дней, затем фильтры извлекают из чашек, высушивают в шкафу при температуре 38-42°С, измельчают и проводят экстракцию, а аллелопатическую активность почвы выражают в процентах от оптической плотности экстракта на контрольном варианте, в котором хлорелла выращивается на фильтре, помещенном на четыре слоя увлажненной фильтровальной бумаги или ваты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области почвенной биохимии и может быть использовано при проведении научных исследований.

Известен способ определения аллелопатической активности почвы по содержанию водорастворимых колинов в почве по Гродзинскому [1]. При этом вытяжка из почвы для определения активности водорастворимых колинов готовится по следующей методике. В колбу из средних образцов отбирают по 100 г почвы, к которым приливается по 50 мл воды. Затем в течение 4-5 часов при периодическом взбалтывании происходит настаивание приготовленной таким образом смеси, после чего она фильтруется. Затем семена редиса сорта Красный с белым кончиком определенной фракции помещаются на фильтровальную бумагу, положенную в чашку Петри, таким образом, что по ее диаметру получается вертикальная складка, делящая чашку на две половины: две повторности. На каждой половине простым карандашом пишется вариант и номер повторности, затем бумага увлажняется водной вытяжкой из почвы, на них раскладывается по 100 семян на каждую половину, чашки закрывают крышками и ставят на проращивание в термостат на 12 часов. В контрольном варианте для смачивания применяется вода. Через 12 часов подсчитывают число проросших семян, учитывая в их числе и лопнувшие. Должно быть 50% проросших семян в контрольном варианте. Затем определяется так называемая всхожесть при К=50, которая является величиной всхожести семян на данных вариантах по отношению к контролю, всхожесть на котором условно принимается за 100%. Затем всхожесть при К=50 переводится в условные кумариновые единицы (УКЕ) по разработанной А.М.Гродзинским шкале.

Недостатком данного способа наряду с его высокой трудоемкостью является также и то, что в данном случае полученная информация больше характеризует активность водной вытяжки, которая может существенно отличаться от активности почвы вследствие тесной связи характера действия физиологически активных веществ (фитостимуляция или фитотоксичность) с их концентрацией в среде.

Известен также способ определения аллелопатической активности почвы с помощью почвенных пластин Красильникова [2]. Из среднего образца отбирается 75 г почвы, которая помещается в чашку Петри. Почва в чашке разравнивается, увлажняется до такого состояния, при котором она может доводиться шпателем до пастообразного состояния. Поверхность пастообразной массы приглаживается мокрым шпателем так, чтобы она была выровненной. Фитотоксическое или фитостимулирующее действие почвы определяется по реакции разложенных на поверхности семян культурных растений: энергии их прорастания, всхожести, величины изменения 9-дневных проростков по отношению к контролю (обычно в процентах). В качестве контроля используются круги из 3-4 слоев фильтрованной бумаги, помещенные в чашки Петри и увлажненные дистиллированной водой.

Недостатком известного способа является его трудоемкость, связанная с подсчетом семян тест-культур, их раскладыванием на поверхность почвенных пластин, фитометрическими измерениями проростков.

Также известен способ определения аллелопатической активности почвы, в котором для изучения токсичности почвы бумажные диски с нанесенной на них суспензией клеток хлореллы помещают на почвенные пластины в чашки Петри. Ингибирование роста хлореллы определяют по изменению оптической плотности экстракта по сравнению с исходной плотностью с помощью фотоэлектрокалориметра. Контролем служит почва, не обладающая токсичностью, а также автоклавированная и промытая почва исследуемых вариантов.

Недостатком данного способа является его более низкая точность из-за отсутствия контролируемых условий экспозиции и подготовки хлорофилльного материала, а также из-за использования в качестве контроля почвы, которая неизбежно обладает физиолого-биохимической активностью, несмотря на автоклавирование и промывание.

Задачей предлагаемого способа является уменьшение трудоемкости, повышение степени адекватности полученных результатов реальным условиям, повышение степени универсальности получаемой характеристики и точности получаемых показателей.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном способе определения аллелопатической активности почвы, согласно изобретению, в чашке Петри распределяют суспензию клеток хлореллы объемом 20 мл, чашки накрывают и ставят в светотеплицу, проводят экспозицию в течение 7 дней, затем фильтры извлекают из чашек, высушивают в шкафу при температуре 38-42°, измельчают ножницами, аллелопатическая активность (стимулирующий или ингибирующий эффект) выражается в процентах от оптической плотности на контрольном варианте, в котором хлорелла выращивается на фильтре, помещенном на 4 слоя увлажненной фильтровальной бумаги или ваты.

Способ осуществляют следующим образом. С выращенной на косячках питательной среды стерильной культуры хлореллы делается смыв стерильной дистиллированной водой из расчета 15-17 косячков на 1 литр воды. Затем на приготовленные по Красильникову (1966) в чашках Петри почвенные пластины раскладываются обеззоленные фильтры, на которые пипеткой распределяются 20 мл суспензии клеток хлореллы. Меньшее количество суспензии существенно увеличивает время экспозиции, большее - уменьшает различия.

Чашки накрываются и ставятся в светотеплицу. Выращивание хлореллы без светотеплицы не дает результатов: в проведенном опыте в условиях светотеплицы фитотоксичность почвы составляла более 25%, тогда как при выращивании без светотеплицы фитотоксичность не обнаруживалась.

Через 7 дней фильтры извлекают из чашек. При такой экспозиции наблюдается максимальный эффект. При большей или меньшей продолжительности опыта различия уменьшаются. В проведенных исследованиях различия между контрольным и испытуемым вариантом составили через 7 дней экспозиции 62%, при уменьшении времени экспозиции разница уменьшалась до 29% на четвертый и 35% на пятый день; на восьмой день составила 55%, на десятый - 37%.

Затем фильтры высушивают в шкафу при температуре 38-42° и измельчают ножницами и из них производится экстракция хлорофилла этиловым спиртом.

Измельчение является необходимым условием осуществления способа. Без измельчения количество извлекаемого хлорофилла снижается, что связано с проникновением клеток хлореллы внутрь фильтра при их размножении.

Температурные параметры высушивания фильтров являются также существенным условием. При меньшей, чем 38° температуре происходит существенное (до 70%) уменьшение различий из-за увеличения сроков высушивания, при температуре более 42° начинается разрушение хлорофилла.

Полученный экстрагент немедленно фильтруется, оптическая плотность профильтрованного экстрагента определяется при красном светофильтре. Аллелопатическая активность (стимулирующий или ингибирующий эффект) выражается в процентах от оптической плотности на контрольном варианте, в котором хлорелла выращивается на фильтре, помещенном на 4 слоя увлажненной фильтровальной бумаги или ваты.

Предложенный способ имеет следующие преимущества перед известными:

1. Хлорелла развивается на почвенных пластинках, приготовленных по Красильникову. Таким образом, интенсивность размножения этого растения отражает состояние почвенной среды, а не водной вытяжки, что выгодно отличает данный способ от известного [1].

2. Реакция хлореллы на наличие физиологически активных веществ совпадает с таковой у высших растений, и показатели этой реакции являются универсальными. Это позволяет избежать недостатков известного способа [2].

4. Создание строго контролируемых условий, заключающихся в использовании определенного объема суспензии клеток хлореллы, строго определенном времени экспозиции, температурных параметров подготовки фильтров с хлореллой, использование абсолютно нейтрального с точки зрения аллелопатической активности биотеста позволяет повысить точность опыта в сравнении с известным [3].

Результаты контрольного применения данного способа приведены в таблице.

Таблица
Сравнительная оценка различных способов определения аллелопатической активности почвы
Вариант Опыта	Коэффициент корреляции прироста надземной массы (г) и показателя аллелопатической активности, определенным:
	по Красильникову, 1966	По Гродинскому, 1979	Предлагаемым способом
1	0,79	0,67	0,91
2	0,81	0,70	0,95
3	0,80	0,69	0,93
4	0,81	0,68	0,96

Как видно из приведенных данных, наиболее тесная взаимосвязь между полученными значениями показателя аллелопатической активности почвы и приростом надземной массы возделываемой культуры (ячменя) у предлагаемого способа.

Источники информации

1. Гродзинский А.М. (ред.) Аллелопатическое почвоутомление. - Киев: Наукова думка, 1976. - с.217-220.

2. Красильников Н.А. Методы изучения почвенных микроорганизмов. - М., 1966. – 176 с.

3. Гродзинский А.М. (ред.). Методологические проблемы аллелопатии / Сб. научных трудов. - Киев: наукова думка, 1989. - С.80 (прототип).