фармацевтическая композиция и способ лечения прогрессирующего фиброза и цирроза печени

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения прогрессирующего фиброза и цирроза печени, включающая 5-(2-пиразинил)-4-метил-1,2-дитиол-3-тион (олтипраз) и диметил-4,4’-диметокси-5,6,5’,6’-диметилен-диоксибифенил-2,2’-дикарбоксилат (DDВ).

2. Фармацевтическая композиция по п.1, изготовленная в виде лекарственной формы, выбранной из группы, состоящей из капсул, таблеток, мягких капсул, суспензий, сиропов, растворов для инъекций и порошков.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, предназначенная для орального введения.

4. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой весовое соотношение олтипраза и DDB составляет 50-1: 1-50.

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4 для изготовления лекарства для профилактики и лечения прогрессирующего фиброза и цирроза печени.

6. Способ профилактики и лечения прогрессирующего фиброза и цирроза печени, включающий введение млекопитающим фармацевтической композиции по любому из пп.1-4.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, касается фармацевтической композиции для лечения и профилактики фиброза и цирроза печени. В частности, настоящее изобретение касается фармацевтической композиции для лечения и профилактики фиброза и цирроза печени, включающей 5-(2-пиразинил)-4-метил-1,2-дитиол-3-тион (oltipraz) и диметил-4,4’-диметокси-5,6,5’,6’-диметилен-диоксибифенил-2,2’-дикарбоксилат (DDB) в качестве основных активных ингредиентов.

Уровень техники

Печень играет ключевую роль в метаболизме ксенобиотиков и метаболизме эндогенных веществ и является важным органом с соответствующими ферментативными реакциями и энергетическим метаболизмом. Среди многих хронических заболеваний в Корее наиболее распространенными и угрожающими жизни болезнями являются гепатит, цирроз и рак печени после сердечно-сосудистых заболеваний. Поскольку в Корее имеется относительно большая популяция пьющих по сравнению с развитыми странами и вызванные пьянством повреждения печени встречаются довольно часто, много внимания уделяется лечению заболеваний печени. Хронические повреждения печени, вызванные вирусными инфекциями или употреблением алкоголя, зачастую приводят к циррозу или раку печени. Учитывая физиологические характеристики и значение тканей печени, а также ввиду важности лечения и профилактики заболеваний печени, существует большая потребность в окончательной разработке терапевтических и профилактических средств против повреждения печени.

Различные вещества, включая некоторые синтетические соединения и галеновые препараты, проявляют защитное действие на печень in vitro и in vivo. Известно, что силимарин (silymarin) и бетаин обладают защитным действием на печень, причем их механизм действия заключается в ингибировании цитокинов и повышении уровня глутатиона, однако трудно ожидать от них лечебного эффекта вследствие низкой эффективности. Эти средства часто применяются в клинических испытаниях, поскольку сейчас не имеется хороших лечебных средств против заболеваний печени. Малотилат (malotilate) и его производные, которые показаны при лечении фиброза печени, защищают печень от токсических химикатов, а их вероятный механизм действия включает индукцию конъюгирующих ферментов II фазы и ингибирование цитохромов Р450. Однако эти соединения неизбирательно ингибируют некоторые цитохромы Р450 и проявляют лишь профилактическое действие.

Известно, что некоторые замещенные серосодержащие дитиолтионы, встречающиеся в природе в крестоцветных растениях, обладают защитным действием на печень. Из них олтипраз (oltipraz) применялся как лечебное средство против шистосомоза; он имеет следующую формулу:

Олтипраз повышает клеточное содержание тиолов и индуцирует экспрессию ферментов, ответственных за поддержание пула глутатиона (GSH) и детоксикацию тканей от электрофильных молекул. Олтипраз повышает активности следующих ферментов: NAD(P)H-xинoнpeдyктaзы, микросомной эпоксидгидроксилазы, глутатион-S-трансферазы (GST) и UDP-GT. В частности, GST защищает печень от таких токсических химикатов, как тетрахлорид углерода или ацетаминофен (Ansher SS, Dolan P, and Bueding E. Chemoprotective effects of two dithiolthiones and of butylhydroxyanisole against carbon tetrachloride and acetaminophen toxicity. 1983 Hepatology 3, 932-935).

Кроме того, олтипраз подавляет канцерогенез, вызванный бензо[а]пиреном, NDEA и урациловым ипритом, а также индуцированный афлатоксином В1 онкогенез в печени и индуцированный азоксиметаном канцерогенез в толстой кишке (Bolton MG, Munoz A, Jacobson LP, Groopman JD, Maxuitenko YY, Roebuck BD, and Kensler TW. Transient intervention with oltipraz protects against aflatoxin-induced hepatic tumorigenesis. 1993, Cancer Res.53, 3499-3504).

Известны следующие механизмы подавления канцерогенеза олтипразом. Во-первых, он повышает уровень антиоксиданта - восстановленного GSH в тканях. Во-вторых, он ингибирует биоактивацию канцерогенов такими ферментами I фазы, как цитохром Р450. В-третьих, олтипраз усиливает детоксикацию канцерогенов, индуцируя детоксикационные ферменты II фазы, включая GST и UDP-GT. В-четвертых, он ингибирует репликацию вируса иммунодефицита человека (HIV) I типа in vitro. В-пятых, он устраняет реакционно-способные промежуточные продукты в клетках путем повышения уровня тиолов и усиливает репарацию ДНК. Сообщалось, что олтипраз повышает уровень GSH в большинстве тканей и устраняет свободные радикалы, образовавшиеся при облучении или из ксенобиотиков. Также известно, что олтипраз действует как защитное средство от радиации, способствуя поддержанию клеточного гомеостаза.

Учитывая вышеприведенное описание, далее будет изложена более подробная информация. Рак представляет собой неконтролируемый рост и дифференцировку клеток, вероятно, вследствие повреждения ДНК в соматических клетках (Cancer Biology, 3rd ed. Raymond W. Ruddon, pp. 61-95, 497-507, Oxford Press). Противораковое действие химических веществ зависит главным образом от их антимутагенных свойств или от их активности по подавлению трансформации в раковые клетки или пролиферации раковых клеток. Олтипраз изучали в качестве средства для химиопрофилактики рака (Ansher et al., 1983; Bolton et al., 1993). Противораковое химиопрофилактическое действие олтипраза связано не только с ингибированием цитохрома Р450 3А, но также с индукцией детоксикационных ферментов II фазы. Олтипраз повышает экспрессию гутатион-S-трансферазы (GST) в клетках и на животных (Clapper et al., 1994; Davidson et al., 1990), что связано с подавлением вызванных токсическими веществами тканевых повреждений и канцерогенеза (Kensler et al., 1987; Maxuitenko et al., 1998). Олтипраз предохраняет печень от тканевых повреждений, вызванных облучением (Kim et al., 1997), а известная из предшествующего исследования индукция GST означает адаптационную реакцию клетки. Олтипраз также защищает печень от токсических веществ (Ansher et al., 1983). Олтипраз подавляет индуцированный афлатоксином В1 канцерогенез посредством катализируемой цитохромом Р450 3А метаболической активации карциногена. Согласно недавним клиническим испытаниям олтипраз снижает уровень афлатоксина В1 в плазме крови у людей, подверженных высокому риску рака печени. Применение олтипраза также вело к снижению индуцированного афлатоксином В 1 канцерогенеза у животных.

Сообщалось, что олтипраз ингибирует репликацию вируса гепатита В (HBV) в клетках 2.2.15, инфицированных плазмидой, содержащей ДНК HBV. Так, олтипраз ингибирует транскрипцию гена вируса гепатита В, повышает экспрессию белка р53 (Chi et al., 1998) и ингибирует репликацию вируса иммунодефицита человека (HIV) (Prochaska et al., 1995).

Проводились клинические испытания в отношении химиопрофилактического действия олтипраза против канцерогенеза в печени в Китае. Результаты показали, что олтипраз обладает слабым защитным действием против канцерогенеза в печени. Также известно, что олтипраз предохраняет печень от гепатотоксичности токсических веществ, по крайней мере, в небольшой степени. Кроме того, была доказана безопасность олтипраза в испытаниях на токсичность, проводившихся на крысах и собаках (Fund. Appl. Toxicol. 1997 Jan; 35(1): 9-21).

Происходящее из Shizandrae соединение DDB (диметил-4,4’-диметокси-5,6,5’,6’-диметилен-диоксибифенил-2,2’-дикарбоксилат) является лекарственным средством для лечения гепатита, которое применяется клинически в Восточной Азии, включая Корею. DDB защищает ткани печени от повреждений, вызванных тетрахлоридом углерода, галактозамином, тиоацетамидом и преднизолоном, а также повышает выработку антител. Поскольку известно, что DDB был эффективньм в клинических испытаниях на больных гепатитом, он широко применяется в клинических условиях. Авторы настоящего изобретения сообщали, что фармакологическое действие DDB связано с ингибированием активации В-NF и продукции -TNF. Кроме того, оказалось, что DDB не влияет на экспрессию ферментов метаболизма лекарств. Поскольку В-NF известен как фактор транскрипции, опосредующий воспалительные реакции, то ингибитор В-NF должен обладать способностью к подавлению системных воспалительных процессов.

Фиброз печени - это предпатологическое состояние, в котором пораженные ткани печени при таких хронических заболеваниях печени, как гепатит, не восстанавливаются до нормальной ткани, а превращаются в волокнистые ткани типа коллагена в процессе адаптационной реакции in vivo. Хотя фиброз печени является следствием восстановительного процесса in vivo в ответ на повреждение ткани, при этом ткань печени замещается волокнистыми тканями, которые не могут выполнять нормальные функции (метаболизма in vivo или выработки желчи). Поскольку постоянный и повторяющийся фиброгенез печени ведет к циррозу и в конечном итоге приводит к смерти, большое значение имеет разработка новых лекарственных препаратов для лечения фиброза печени. Однако, поскольку механизм фиброгенеза печени в точности не известен, хорошие лекарственные препараты еще не разработаны.

Последние исследования показали, что -трансформирующий ростовой фактор (-TGF) - цитокин, секретируемый клетками Купфера и клетками Ито в печени, - является важным фактором фиброза печени. Кроме того, сообщалось, что блокирование активности p-TGF с помощью антител или антисмысловой JfTHLR, а также модифицирование рецепторов P-TGF значительно уменьшает фиброз печени. Однако эти исследования были подтверждены только на уровне экспериментов. Не было сообщений о лекарственных препаратах против фиброза и цирроза печени, пригодных для клинического применения.

Сущность изобретения

Цель настоящего изобретения предусматривает получение фармацевтической композиции, максимально эффективной при лечении фиброза и цирроза печени, которая может применяться и как профилактическое средство.

Другая цель настоящего изобретения предусматривает применение фармацевтической композиции, применяемой для получения лекарства для лечения и профилактики фиброза и цирроза печени.

Еще одна цель настоящего изобретения предусматривает способ лечения или профилактики фиброза и цирроза печени, включающий введение фармацевтической композиции млекопитающему.

Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию для лечения и профилактики фиброза и цирроза печени, которая включает 5-(2-пиразинил)-4-метил-1,2-дитиол-3-тион (олтипраз) и диметил-4,4’-диметокси-5,6,5’,6’-диметилен-диоксибифенил-2,2’-дикарбоксилат (DDB) в качестве основных компонентов. Соотношение олтипраз:DDB в этой композиции составляет предпочтительно 50-1:1-50, наиболее предпочтительно 5:1. Композиции олтипраз/DDB по настоящему изобретению проявляют необычайно хорошее действие при лечении и профилактике фиброза и цирроза печени и являются безопасными препаратами, обладающими низкой токсичностью в организме человека.

Перечень фигур

Фиг.1а - фотография, показывающая ингибирующее действие олтипраза на

экспрессию мРНК 1-TGF в печени при введении крысе DMN.

Фиг.2а - фотография ткани печени нормального животного (окрашивание Н&Е).

Фиг.2b - фотография ткани печени нормального животного (окрашивание Н&Е).

Фиг.3а - фотография ткани печени в группе, получавшей DMN (окрашивание Н&Е).

Фиг.3b - фотография ткани печени в группе, получавшей DMN (трехцветное окрашивание по Массону).

Фиг.4а - фотография ткани печени в группе, получавшей одновременно DMN и олтипраз (25 мг/кг)/DDB (5 мг/кг) (окрашивание Н&Е).

Фиг.4b - фотография ткани печени в группе, получавшей одновременно DMN и олтипраз (25 мг/кг)/DDB (5 мг/кг) (трехцветное окрашивание по Массону).

Фиг.5а - фотография ткани печени в группе, получавшей одновременно DMN и олтипраз (15 мг/кг)/DDB (15 мг/кг) (окрашивание Н&Е).

Фиг.5b - фотография ткани печени в группе, получавшей одновременно DMN и олтипраз (15 мг/кг)/DDB (15 мг/кг) (трехцветное окрашивание по Массону).

Фиг.6а - фотография ткани печени в группе, получавшей одновременно DMN и олтипраз (5 мг/кг)/DDB (25 мг/кг) (окрашивание Н&Е).

Фиг.6b - фотография ткани печени в группе, получавшей одновременно DMN и олтипраз (5 мг/кг)/DDB (25 мг/кг) (трехцветное окрашивание по Массону).

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения сделали беспрецедентное открытие, что олтипраз обладает непредвиденным, необычайным действием при лечении и профилактике фиброза и цирроза печени. Кроме того, они открыли, что эффективность олтипраза при лечении и профилактике значительно возрастает в комбинации с DDB.

Фиброз - это предварительная стадия цирроза, он возникает при тяжелом повреждении печени под действием ряда факторов. Цирроз имеет некоторое отношение к канцерогенезу: он заметно повышает вероятность рака печени у больных. Однако патологический механизм цирроза четко отличается от рака печени. Таким образом, фиброз печени возникает при хроническом и тяжелом повреждении тканей печени. К факторам, вызывающим повреждение тканей печени, относятся вирусы, паразиты, употребление алкоголя, химические вещества и лекарства. Фиброз печени возникает из-за чрезмерной продукции внеклеточного матрикса (коллагена I, III и IV типа) вследствие активации непаренхиматических клеток в ткани печени: клеток Купфера, звездчатых клеток и др. В частности, фиброз возникает при активации и последующей трансформации звездчатых клеток в миофибробласты. Активированные звездчатые клетки затем вырабатывают избыточное количество внеклеточного матрикса. Более того, фиброз и цирроз как патологические феномены четко отличаются от вирусного гепатита и рака печени. Так, способы лечения и профилактики их также отличаются. Однако в настоящее время нет пригодных для клинического применения лекарств от цирроза печени.

Настоящее изобретение основывается на открытии того, что олтипраз, известный как эффективное средство предупреждения рака печени, также эффективен против фиброза и цирроза печени, которые совершенно отличаются по патологическим механизмам от рака печени. Кроме того, настоящее изобретение отличается применением олтипраза вместе с DDB, который ранее был известен только как средство против гепатита, что обеспечивает такую эффективность в лечении и профилактике фиброза и цирроза печени, которая превосходит все ожидания. Эти факты подтверждены экспериментами, описанными ниже.

Олтипраз или олтипраз/DDB уменьшают число баллов по шкале фиброза и шкале Knodell, служащих показателями вызванного диметилнитрозамином (DMN) фиброза. Это совпадает с результатами микроскопического исследования образцов ткани. Кроме того, при введении олтипраза или олтипраза/DBB значительно уменьшаются такие показатели гепатотоксичности, как ALT, AST, билирубин и -глутамилтранспептидаза (-GT). Это свидетельствует, что олтипраз или олтипраз/DBB могут облегчать фиброз, замедляя соответствующие процессы. Механизм подавления фиброза олтипразом или олтипразом/ DBB вращается вокруг ингибирования экспрессии -TGF. Согласно результатам количественного RT-PCR, олтипраз или олтипраз/DBB полностью ингибируют повышение экспрессии -TGF, вызванное диметилнитрозамином. Это служит свидетельством того, что олтипраз как лекарство способен подавлять возникновение и развитие фиброза и цирроза печени. Олтипраз индуцирует детоксикационные ферменты печени GST и mЕН, повышает GSH и проявляет конъюгирование радикалов, тогда как DDB не индуцирует детоксикационные ферменты. С учетом вышесказанного можно полагать, что олтипраз и DDB обладают комплементарными фармакологическими эффектами. В частности, поскольку считается, что ингибирование DDB метаболической активности CYP3A в микросомах печени человека ведет к подавлению метаболизма олтипраза, то даже низкие дозы олтипраза могут обеспечивать сильную защиту печени и продлевать время действия этого препарата.

В настоящем изобретении лечебные эффекты комбинации олтипраз/DBB наблюдались при различных соотношениях на крысах, которым ранее вводили DMN. В этих опытах весовые соотношения олтипраз/DBB составляли 25:5, 15:15 и 5:25 (мг/кг). При этом после введения DMN (измерения проводились через 1 неделю после его введения в течение 3 недель) значительно повышались ALT, AST, билирубин, -глутамилтранспептидаза (-GT), число баллов по шкале фиброза и шкале Knodell по сравнению с контрольной группой. Напротив, при введении олтипраза/DBB эти величины понижались. Олтипраз (25 мг/кг) / DDB (5 мг/кг) проявляли наибольшее подавление фиброза. Это доказывает, что олтипраз и DBB проявляют синергизм в подавлении повреждения печени и фиброза, и показывает, что их оптимальное соотношение равно 5:1. Кроме того, при введении комбинации олтипраз/DBB биохимические показатели крови (число баллов по шкале фиброза и шкале Knodell) снижались сильнее, чем при введении одного олтипраза (50 мг/кг). Соответственно, можно полагать, что применение олтипраза вместе с DDB будет уменьшать побочные эффекты, такие как расстройства желудочно-кишечного тракта, парестезия рук и ног и др., возникающие при высоких дозах олтипраза. DDB подавляет воспалительную реакцию, которую вызывает DMN, а олтипраз предотвращает экспрессию -TGF, усиливает экспрессию антиокислительных ферментов и вызывает повышение GSH. По этому механизму олтипраз/DBB увеличивает до предела действенность лечения и профилактики фиброза печени. Так реализуется комплементарность эффектов олтипраза/DBB для защиты печени. Кроме того, олтипраз/DBB может применяться в клинике, так как при этом почти не проявляются побочные эффекты.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения предпочтительно применяется путем комбинирования составленных независимо препаратов или путем получения комбинированного препарата, содержащего смесь лекарственных веществ. На практике фармацевтическая композиция настоящего изобретения применяется в виде готовых лекарственных форм, подходящих для приема внутрь в соответствии с правилами соответствующей области фармацевтики. При этом лекарственные формы для приема внутрь (перорально) включают твердые и мягкие капсулы, таблетки, порошки и т.д. Пероральные композиции, наряду с олтипразом/DBB как фармакологически активным агентом, могут содержать один или несколько фармацевтически неактивных, стандартных носителей. Например, пероральная композиция может содержать такие добавки, как крахмал, лактоза, карбоксиметилцеллюлоза, каолин и другие наполнители; вода, желатин, спирт, глюкоза, гуммиарабик, трагакантовая камедь и другие связующие вещества; крахмал, декстрин, альгинат натрия и другие дезинтегрирующие вещества; тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, вазелиновое масло и другие смазочные вещества. Также можно добавлять вещества, способствующие растворению.

Ежедневная дозировка по настоящему изобретению зависит от различных факторов, таких как степень поражения печени пациента, продолжительности гепатита, возраста, состояния здоровья, осложнений и т.п. Тем не менее, обычно взрослым композицию олтипраз/DBB назначают один или два раза в день в общей дозе от 5 до 200 мг в день, более предпочтительно от 25 до 50 мг. Однако у больных с тяжелым поражением печени или при применении в качестве средства против рецидивов после удаления раковой опухоли печени настоящее изобретение позволяет выходить за указанные пределы фармацевтической композиции и назначать еще большие дозы. Наиболее предпочтительно принимать перорально дважды в день одну или две готовые формы, содержащие 25 мг олтипраза и 5 мг DDB.

В фармацевтической композиции настоящего изобретения оптимальным образом сочетаются олтипраз, обладающий замечательными качествами подавления фиброза и защиты печени, и DDB, обладающий отличным действием подавления воспалительных реакций. Эта композиция обеспечивает подавление фиброза и цирроза печени, обладает слабой токсичностью и почти не имеет побочных эффектов. Таким образом, настоящее изобретение может безопасно применяться в течение длительного времени для лечения и профилактики фиброза и цирроза печени.

Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно на рабочих примерах. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Контрольные примеры

Контрольный пример 1. Антифиброзное действие олтипраза (1)

У крыс, которым непрерывно вводили диметилнитрозамин (DMN) на протяжении 4 недель, наблюдалось 4-кратное повышение аланин-аминотрансферазы (ALT) и аспартат-аминотрансферазы (AST) в плазме крови. При предварительном введении олтипраза в дозе 50 мг/кг повышение активностей ALT и AST в плазме крови ингибировалось на 50% (табл.1).

Активность -глутамилтранспептидазы (-GT) и содержание билирубина в плазме крови служат индикаторами функционального состояния печени. Олтипраз ингибировал повышение активности -GT на 70-80% у крыс, получавших DMN. С другой стороны, при введении DMN содержание билирубина повышалось в 8 раз по сравнению с контрольной группой. Когда одновременно с DMN вводили олтипраз (50 мг/кг), повышение билирубина в плазме подавлялось на 65%.

Таблица 1. Значения ALT, AST, -GT и билирубина
Группа	ALT	AST	-GT	Билирубин
Контроль	49±2	113±6	0,2±0,1	0,2±0,01
DMN	190±12*	412±39*	12,1±4,1*	0,9±0,2*
DMN+ олтипраз 50 мг/кг	116±4 #	246±32*	2,6±0,5*	0,3±0,03 #

Каждое значение представляет среднее значение ± стандартное отклонение. Число использованных животных колебалось от 8 до 16. Статистическую значимость по каждой группе определяли с помощью критерия Ньюмана-Кельса для многофакторного анализа. Показатели значимости: * = р<0,05 по сравнению с контролем; ^# = р<0,05 по сравнению с группой, получавшей DMN.

Контрольный пример 2. Антифиброзное действие олтипраза (2)

Гистопатологический эффект олтипраза на DMN-индуцированный фиброз печени исследовали на лабораторных животных. Явный фиброз наблюдался у крыс, получавших DMN на протяжении 4 недель по 3 раза в неделю. Когда одновременно с DMN вводили олтипраз (перорально в дозах 5-50 мг/кг по 3 раза в неделю на протяжении 4 недель), фиброз печеночной ткани уменьшался по сравнению с введением одного DMN. Некроз и фиброз печеночной ткани определяли гистологически, используя такие показатели гистопатологии печени, как окрашивание по Ван Гизону (Van Gieson) и трехцветное окрашивание по Массону (Masson) (табл.2).

Олтипраз в дозе 50 мг/кг эффективно уменьшал DMN-индуцированный фиброз (табл.2). Степень фиброза определяли по шкале фиброза и шкале Knodell, которые показывают степень повреждения печени и фиброза. По сравнению с группой, получавшей только DMN, в группе DMN+олтипраз отмечалось меньшее число баллов по шкале фиброза и шкале Knodell, что свидетельствует об излечении повреждений печени и фиброза.

Таблица 2. Подавление олтипразом фиброза печеночной ткани
Группа	По шкале фиброза	По шкале Knodell
Контроль	0	0
DMN	3,7±0,5	16,1±2,9
DMN + олтипраз 5 мг/кг	3,1±0,4*	11,1±1,7*
DMN+ олтипраз 15 мг/кг	2,9±0,8*	12,1±1,9*
DMN+ олтипраз 50 мг/кг	2,5±0,9**	8,0±1,6**

Каждое значение представляет среднее значение ± стандартное отклонение. Число использованных животных колебалось от 8 до 16. Статистическую значимость по каждой группе определяли с помощью критерия Ньюмана-Кельса для многофакторного анализа. Показатели значимости: * = р<0,05, ** = р<0,01. Степень фиброза: 0 = норма, 1 = слабое присутствие фиброзной ткани, 2 = умеренное присутствие фиброзной ткани, 3 = заметное присутствие фиброзной ткани, 4 = признаки сильного фиброза. Шкала Knodell - это сумма баллов по перипортальным перемычкам (максимум = 10), внутридольковой гибели клеток (максимум = 4), портальному воспалению (максимум = 4) и фиброзу (максимум = 4).

Контрольный пример 3. Фармакологический механизм антифиброзного действия олтипраза

-TGF - это основной цитокин, экспрессия которого возрастает при фиброзе по мере повреждения тканей. Экспрессию мРНК 1-TGF у животных измеряли методом RT-PCR при введении одного DMN и при одновременном введении олтипраза и DMN. У животных, получавших DMN на протяжении 4 недель, необратимый чрезмерный фиброгенез не дал возможности измерить экспрессию мРНК 1-TGF. Экспрессию мРНК 1-TGF измеряли у животных, получавших один DMN. Через 18 часов после введения DMN вводили олтипраз. После этого измеряли экспрессию мРНК 1-TGF через 24 часа. У крыс, получавших DMN, мРНК 1-TGF заметно возрастала в ткани печени. DMN-индуцированная экспрессия мРНК 1-TGF полностью ингибровалась при введении олтипраза в дозе 100 мг/кг. Экспрессия мРНК GAPDH не изменялась ни при введении одного DMN, ни при одновременном введении олтипраза и DMN. Следовательно, это означает, что фармакологический механизм подавления фиброза печени олтипразом заключается в уменьшении экспрессии 1-TGF (фиг.1).

Контрольный пример 4. Оценка ингибирования олтипразом продукции -TGF

Проводили опыты на клетках макрофагов RAW264.7 для проверки того, что олтипраз непосредственно ингибирует продукцию -TGF, который экспрессируется на высоком уровне в макрофагах, а также для оценки связанных с этим молекулярных фармакологических механизмов. Когда олтипраз непосредственно добавляли к клеткам RAW264.7 с повышенным уровнем экспрессии -TGF, оказалось, что олтипраз ингибирует экспрессию -TGF дозозависимым образом. Эти результаты показывают, что олтипраз может действовать как антифиброзный агент в печеночных клетках Купфера путем ингибирования продукции -TGF. Более того, повышение экспрессии -TGF ингибируется EGTA или генистеином, который является ингибитором тирозиновых киназ. Этот результат показывает, что ингибирование олтипразом продукции -TGF может быть следствием регуляции внутриклеточного кальция и изменения активности протеинкиназ (табл.3).

Таблица 3. Ингибирование олтипразом экспрессии p-TGF в макрофагах
	Контроль	Олтипраз 30 мкМ	Олтипраз 100 мкМ	EGTA 1 мМ	Генистеин 100 мкМ
Ингибирование -TGF (%)	0	30	60	80	80

Контрольный пример 5. Противовоспалительный механизм DDB (ингибирование активации В-NF)

Известно, что активация В-NF связана с воспалительными процессами. Чтобы сравнить активность В-NF в печеночной ткани при введении DDB и без введения DDB, проводили следующие опыты. Использовали самцов крыс SD весом около 150 г. В каждой группе было 7 крыс. В контрольной группе (введение растворителя) и опытной группе (введение DDB в дозах от 20 до 100 мг/кг/день) активность В-NF измеряли после введения эндотоксина (липополисахарида, или LPS) методом смещения подвижности при электрофорезе (EMSA).

Введение LPS (1 мкг/кг) вело к повышению уровня транскрипции комплекса р50 и р65 молекул В-NF в ядрах. Однако введение DDB (20-100 мг/кг) за 2 часа до введения LPS блокировало транслокацию комплекса В-NF в ядра и его активность. Эти результаты показывают, что DDB обладает способностью к ингибированию LPS-индицированной активации В-NF в печени крыс.

Стимуляция клеток Raw264.7 добавлением 1 мкг/кг LPS вызывала повышение связывания В-NF с ДНК через 30 мин или 1 час. DDB в концентрации 0,1, 0,3 и 1,0 мМ ингибировал активность В-NF концентрационно-зависимым образом. Эти результаты совпадают с результатами, полученными на печени крыс, получавших DDB (табл.4).

Таблица 4. Влияние DDB на активацию В-NF
Группа	LPS 1 мкг/кг или 1 мкг/мл	LPS + DDB 20 мг/кг	LPS + DDB 50 мг/кг	LPS+ DDB 100 мг/кг	LPS + DDB 0,1 мМ	LPS + DDB 0,3 мМ	LPS + DDB 1,0 мМ
Ингибирование активации В-NF (%)	0	42	63	73	33	35	65

Ингибирование деградации субъединицы I-В NF

Транслокации В-NF в ядро предшествует фосфорилирование и протеолитическая деградация субъединицы I-В. Этот опыт проводился для того, чтобы проверить, связан ли эффект DDB на активацию В-NF с ингибированием деградации I-В. Уровень белка I-В снижался через 30 мин после введения крысам LPS (1 мкг/кг). Напротив, введение DDB за 2 часа до введения LPS уменьшало снижение белка I-В, вызванное LPS. Также на клетках RAW264.7 DDB ингибировал деградацию белка I-кВа концентрационно-зависимым образом в диапазоне концентраций от 0,3 до 1 мМ. Эти результаты показывают, что DDB ингибирует деградацию I-В и тем самым активацию В-NF (табл.5).

Таблица 5. Влияние DDB на деградацию I-В
	LPS 1 мкг/кг или 1 мкг/мл	LPS + DDB 100 мг/кг	LPS + DDB 0,1 мМ	LPS + DDB 0,3 мМ	LPS + DDB 1,0 мМ
Ингибирование деградации I-В (%)	о	67	22	34	65

Контрольный пример 6. Противовоспалительный механизм DDB (ингибирование продукции и экспрессии мРНК -TNF)

-TNF - это основной посредник реакции на LPS, который участвует в воспалительных процессах. Методом ELISA определяли, снижается ли выделение в кровь -TNF при ингибировании DDB активности В-NF. Однократное введение LPS (1 мкг/кг, внутривенно) вело к повышению уровня -TNF с 35 до 5160 пг/мл плазмы через 2 часа после введения. Введение DDB в дозе 20, 50 или 100 мг/кг предотвращало вызванное LPS повышение уровня -TNF, снижая его до 1350, 1230 и 690 пг/мл плазмы, соответственно. В клетках RAW264.7 DDB уменьшал вызванную LPS продукцию -TNF. Эти результаты показывают, что DDB ингибирует экспрессию -TNF в макрофагах и в печени (табл.6).

Таблица 6. Влияние DDB на продукцию -TNF в плазме
	LPS 1 мкг/кг или 1 мкг/мл	LPS + DDB 20 мг/кг	LPS + DDB 50 мг/кг	LPS + DDB 100 мг/кг	LPS + DDB 1,0 мг/кг
Ингибирование активации В-NF (%)	о	74	76	87	65

Контрольный пример 7. Антифиброзное действие комбинации олтипраз/DDВ(1)

Антифиброзное действие комбинации изучали, изменяя соотношение компонентов в этой комбинации. При исследовании эффекта этой комбинации с различными пропорциями компонентов была частично модифицирована схема дозировки DMN. Тогда как в контрольных примерах 1 и 2 DMN вводили крысам в дозе 10 мкл/кг в целом 12 раз за период 4 недель, по 3 раза в неделю, при оценке эффекта комбинации с различными пропорциями компонентов использовали модель с меньшим повреждением печени у животных, в которой DMN вводили крысам в дозе 10 мкл/кг в целом 9 раз за период 3 недель, по 3 раза в неделю, после чего в данном контрольном примере DMN не вводили в оставшуюся 1 неделю.

Через 1 неделю после введения DMN на протяжении 3 недель у животных было отмечено 2,9 балла по шкале фиброза и 11,7 баллов по шкале Knodell. Таким образом, у этих животных наблюдалось уменьшение фиброза печени по сравнению с животными, получавшими DMN на протяжении 4 недель, у которых было 3,7 балла по шкале фиброза и 16,1 баллов по шкале Knodell.

Через 1 неделю после введения DMN на протяжении 3 недель по 3 раза в неделю активности ALT и AST в плазме крови животных повышались в 4 раза по сравнению с контрольной группой.

У животных, получавших олтипраз и DBB в соотношении доз 25:5, 15:15 и 5:25 мг/кг на протяжении 3 недель (по 3 раза в неделю на следующий день после каждого введения DMN), повышение активностей ALT и AST в плазме крови животных значительно подавлялось по сравнению с животными, получавшими только DMN. При сравнении эффективности различных пропорций компонентов в комбинации оказалось, что животные в группе, получавшей олтипраз и DBB в соотношении доз 15:15 мг/кг, также проявляли значительное торможение активностей ALT и AST в плазме, однако степень торможения была меньшей, чем у животных, получавших олтипраз и DBB в соотношении доз 25:5 мг/кг (табл.7).

Активность -GT и содержание билирубина в плазме крови служат репрезентативными индикаторами функционального состояния печени. У крыс, получавших олтипраз и DBB в соотношении доз 25:5, 15:15 и 5:25 мг/кг на протяжении 3 недель, DMN-индуцированное повышение билирубина в плазме подавлялось в статистически значимой степени. Подобно результатам по ALT и AST из тех групп животных, которым вводили олтипраз и DBB, повышение билирубина сильнее всего подавлялось у животных, получавших олтипраз и DBB в соотношении доз 25:5 мг/кг.

Общее содержание белка и уровень альбумина в крови служат индикаторами синтеза белка в печеночной ткани. При развитии цирроза печени общее содержание белка в крови обычно снижается. Через 1 неделю после введения DMN на протяжении 3 недель общее содержание белка у животных значительно снижалось, однако оно выходило на нормальный уровень контрольной группы в тех группах животных, которые получали олтипраз и DBB в соотношении доз 25:5 и 15:15 мг/кг (табл.7).

Эти результаты свидетельствуют, что из тех пропорций компонентов олтипраза и DBB, что применялись в этом примере, наибольшее подавление фиброза печени, вызванного DMN, проявляла группа животных, получавших олтипраз и DBB в соотношении 25:5 мг/кг. Следует также отметить, что данный эффект в группе животных, получавших олтипраз (25 мг/кг) / DDB (5 мг/кг), сравним или превосходит тот, что наблюдался в контрольном примере 1 у животных, получавших один олтипраз в дозе 50 мг/кг. Действительно, подавление DMN-индуцированного повышения ALT составило 40% в группе, получавшей один олтипраз в дозе 50 мг/кг, тогда как подавление фиброза печени составило 43% при введении олтипраза и DBB в дозе 25:5 мг/кг. Близкие результаты были получены и в случае других показателей.

Таблица 7. Влияние DDB на продукцию -TNF в плазме
Группа	ALT	AST	Общее содержание белка	Альбумин	Билирубин
Контрольная группа	44±3	114±6	6,2±0,1	5,1±0,1	0,25±0,02
DMN	169±7*	222±14*	5,0±0,2*	4,0±0,2*	1,1±0,3*
DMN + олтипраз 25 /DDB 5 мг/кг	98±9#	156±8#	5,9±0,2#	4,8±0,1 #	0,3±0,04 #
DMN + олтипраз 15 /DDB 15 мг/кг	108±10#	194±19	5,7±0,2 #	4,7±0,1 #	0,4±0,08#
DMN + олтипраз 5 /DDB 25 мг/кг	127±8#	206±14	5,3±0,1 #	4,3±0,1	0,4±0,09#

Каждое значение представляет среднее значение ± стандартное отклонение. Число использованных животных колебалось от 8 до 10. Статистическую значимость по каждой группе определяли с помощью критерия Ньюмана-Кельса для многофакторного анализа. Показатели значимости: * = р<0,05 по сравнению с контролем; ^# = р<0,05 по сравнению с группой, получавшей DMN.

Контрольный пример 8. Антифиброзное действие олтипраза/DDB (2)

Гистопатологический эффект различных комбинаций олтипраз/DBB на DMN-индуцированный фиброз печени исследовали на лабораторных животных. Фиброз печени не наблюдался у нормальных крыс (фиг.2а и 2b). Явный фиброз печеночной ткани наблюдался у крыс через 1 неделю после введения DMN на протяжении 3 недель по 3 раза в день (фиг.3а и 3b). При введении олтипраза и DDB в соотношении доз 25:5 и 15:15 мг/кг на протяжении 3 недель (по 3 раза в неделю на следующий день после введения DMN), фиброз печеночной ткани значительно уменьшался по сравнению с введением одного DMN. В частности, группа животных, получавших олтипраз и DBB в соотношении доз 25:5 мг/кг (фиг.4а и 4b), превосходила по эффективности препарата группы животных, получавших олтипраз и DBB в соотношении доз 15:15 мг/кг (фиг.5а и 5b) и 5:25 мг/кг (фиг.6а и 6b), и развитие фиброза печени сильно подавлялось.

Некроз и фиброз печеночной ткани определяли гистологически, используя такой индикатор накопления коллагена, как трехцветное окрашивание по Массону. Степень фиброза печени определяли по шкале фиброза и шкале Knodell, которые показывают степень повреждения печени и фиброза.

Таблица 8. Подавление комбинацией олтипраз/DDB фиброза печеночной ткани
Группа	По шкале фиброза	По шкале Knodell
Контроль	0	0
DMN	2,9±0,9	11,7±1,8
DMN + олтипраз 25: DDB 5 мг/кг	0,3±0,5**	2,0±1,5**
DMN + олтипраз 15: DDB 15 мг/кг	0,3±0,5**	4,0±1,2**
DMN + олтипраз 5: DDB 25 мг/кг	1,2±0,6**	6,0±1,3**

Каждое значение представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение, а число использованных животных колебалось от 8 до 10. Статистическую значимость по каждой группе определяли с помощью критерия Ньюмана-Кельса для многофакторного анализа. Показатели значимости: ** = р<0,01 по сравнению с группой, получавшей DMN. Степень фиброза: 0 = норма, 1 = слабое присутствие фиброзной ткани, 2 = умеренное присутствие фиброзной ткани, 3 = заметное присутствие фиброзной ткани, 4 = признаки сильного фиброза. Шкала Knodell - это сумма баллов по перипортальным перемычкам (максимум = 10), внутридольковой гибели клеток (максимум = 4), портальному воспалению (максимум = 4) и фиброзу (максимум = 4).

Контрольный пример 9. Влияние комбинации олтипраз/DDB на экспрессию -TGF

Как указано выше, -TGF - это цитокин, вызывающий фиброз печени, связь которого с развитием фиброза печени хорошо известна. В табл.9 представлены изменения содержания мРНК -TGF, полученного методом RT-PCR.

В группе, получавшей DMN, наблюдалось значительное увеличение продукции -TGF по сравнению с контрольной группой. У животных, получавших комбинацию олтипраз/DBB в различных пропорциях, количественное определение экспрессии -TGF методом RT-PCR показало, что введение олтипраза в дозе 30 мг/кг и совместное введение олтипраза и DBB в дозе 25:5 мг/кг полностью подавляло экспрессию -TGF. Однако с повышением отношения DDB:олтипраз подавление экспрессии -TGF последовательно уменьшалось. В группе животных, получавших один DDB, не наблюдалось подавления экспрессии -TGF. Следовательно, можно полагать, что подавление экспрессии -TGF вызывается олтипразом. На этом основании наилучшее соотношение между олтипразом и DDB равняется 5:1 (табл.9).

Таблица 9. Относительное ингибирование комбинацией олтипраз/DDB экспрессии -TGF
	DMN 10 мкл/кг	DMN + олтипраз 30 мг/кг	DMN + DDB 30 мг/кг	DMN + олтипраз 25 +DDB5 мг/кг	DMN + олтипраз15 +DDB15 мг/кг	DMN + олтипраз 5 + DDB 25 мг/кг
Ингибирование экспрессии мРНК -TGF (%)	0	65	0	65	30	О

Рабочие примеры

Рабочий пример 1

Олтипраз 25 мг

DDB 1 мг

Лактоза 50 мг

Крахмал 10 мг

Стеарат магния надлежащее количество

Вышеуказанные компоненты смешивали и получали таблетки общепринятым способам таблетирования.

Рабочий пример 2

Олтипраз 50 мг

DDB 1 мг

Лактоза 50 мг

Крахмал 10 мг

Стеарат магния надлежащее количество

Вышеуказанные компоненты смешивали и получали таблетки общепринятым способам таблетирования.

Рабочий пример 3

Олтипраз 5 мг

DDB 10 мг

Лактоза 50 мг

Крахмал 10 мг

Стеарат магния надлежащее количество

Вышеуказанные компоненты смешивали и получали таблетки общепринятым способам таблетирования.

Рабочий пример 4

Олтипраз 25 мг

DDB 5 мг

Лактоза 30 мг

Крахмал 28 мг

Тальк 2 мг

Стеарат магния надлежащее количество

Вышеуказанные компоненты смешивали и получали капсулы путем заполнения этой смесью капсул из твердого желатина общепринятым способам получения капсул.

Рабочий пример 5

Олтипраз 25 мг

DDB 5 мг

Лактоза 30 мг

Крахмал 28 мг

Тальк 2 мг

Стеарат магния надлежащее количество

Вышеуказанные компоненты смешивали и получали капсулы путем заполнения этой смесью капсул из твердого желатина общепринятым способам получения капсул.

Рабочий пример 6

Олтипраз 1 мг

DDB 50 мг

Лактоза 30 мг

Крахмал 28 мг

Тальк 2 мг

Стеарат магния надлежащее количество

Вышеуказанные компоненты смешивали и получали капсулы путем заполнения этой смесью капсул из твердого желатина общепринятым способам получения капсул.

Рабочий пример 7

Олтипраз 5 мг

DDB 25 мг

Лактоза 30 мг

Крахмал 28 мг

Тальк 2 мг

Стеарат магния надлежащее количество

Вышеуказанные компоненты смешивали и получали капсулы путем заполнения этой смесью капсул из твердого желатина общепринятым способам получения капсул,

Рабочий пример 8

Олтипраз 250 мг

DDB 50 мг

Сахар изомеризованный 10 г

Сахар 30 мг

КМЦ натриевая 100 мг

Лимонный ароматизатор надлежащее количество

(добавить очищенную воду до общего объема 100 мл)

Из вышеуказанных компонентов готовили суспензию согласно общепринятым способам получения суспензий. Заполняли суспензией темный флакон на 100 мл и стерилизовали.

Рабочий пример 9

Олтипраз 50 мг

DDB 250 мг

Сахар изомеризованный 20 г

Сахар 20 г

Альгинат натрия 100 мг

Апельсиновый ароматизатор надлежащее количество

(добавить очищенную воду до общего объема 100 мл)

Из вышеуказанных компонентов готовили суспензию согласно общепринятым способам получения суспензий. Заполняли суспензией темный флакон на 100 мл и стерилизовали.

Рабочий пример 10

Олтипраз 25 мг

DDB 5 мг

Лактоза 30 мг

Крахмал 20 мг

Стеарат магния надлежащее количество

Вышеуказанные компоненты смешивали, вносили в покрытую полиэтиленом оболочку и плотно закрывали, получая препарат в виде порошка.

Рабочий пример 11

На 1 мягкую капсулу:

Олтипраз 25 мг

DDB 5 мг

Полиэтиленгликоль 400 400 мг

Глицерин концентрированный 55 мг

Вода очищенная 35 мг

Полиэтиленгликоль смешивали с концентрированным глицерином, а затем добавляли очищенную воду. После доведения смеси до 60°С в нее добавляли олтипраз. Смесь перемешивали примерно при 1500 об/мин. После достижения однородного состояния смесь охлаждали при комнатной температуре с медленным перемешиванием. Удаляли пузырьки воздуха с помощью вакуумного насоса, получая содержимое для мягких капсул.

Оболочку мягких капсул производили согласно общепринятым способам, используя хорошо известную формулу: 132 мг желатина, 52 мг концентрированного глицерина, 6 мг 70%-го раствора дисорбитола на 1 капсулу, соответствующее количество этилванилина в качестве ароматизатора и карнаубский воск в качестве покровного материала.

Промышленное применение

Композиции олтипраз/DBB по настоящему изобретению проявляют необычайно хорошее действие при лечении и профилактике фиброза и цирроза печени. Таким образом, они могут применяться в клинике для лечения и профилактики фиброза и цирроза печени.