способ приготовления бивалентной вакцины для профилактики менингококковой инфекции

Формула изобретения

1. Способ приготовления бивалентной вакцины для профилактики менингококковой инфекции, включающий конъюгацию капсульных полисахаридов с препаратами белков наружной мембраны менингококков серогруппы В, отличающийся тем, что в качестве препаратов белков наружной мембраны менингококков серогруппы В используют синтезированные пептидные фрагменты белков, выбранные из последовательности аминокислот экспонированных петель и их трансмембранных участков, несущих В- и Т-эпитопы, обладающие протективной активностью в отношении серогрупп А, В и С менингококков, а в качестве капсульных полисахаридов - полисахариды менингококков серогруппы А при приготовлении бивалентной В/А вакцины или серогруппы С при приготовлении бивалентной В/С вакцины, причем перед конъюгацией упомянутые полисахариды менингококков подвергают окислению.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют синтезированные пептидные фрагменты белков классов РоrА или ОраВ.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что окисление полисахаридов менингококков серогрупп А или С проводят в течение 2,0-4,0 ч при обеспечении их иммунологической активности.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и микробиологии и может быть использовано для создания вакцин широкого спектра действия для профилактики менингококковой инфекции.

В настоящее время вопрос эффективной вакцинопрофилактики менингококковой инфекции стоит достаточно остро в большинстве стран мира. Инфекционное заболевание человека, вызываемое бактерией Neisseria meningitidis, характеризуется высокой смертностью и серьезными осложнениями. Частота заболевания в развитых странах составляет 1-3 случая в год на 100000 человек, в развивающихся странах в период эпидемии эта величина может достигать 100. Даже при лечении антибиотиками смертность от этой инфекции достигает 10%, и еще у 5-20% пациентов отмечаются серьезные неврологические последствия заболевания.

Заболевания менингококковым менингитом вызываются в 90% случаев штаммами N. meningitidis серогрупп А, В и С. Для профилактики заболевания, вызываемого менингококком серогрупп А и С, созданы эффективные вакцины, в то время как для менингита В такой нет.

Для вакцинации против менингита, вызываемого микроорганизмом N. meningitidis серогрупп А и С, успешно применяются препараты, приготовленные на основе капсульного полисахарида, а именно сами полисахариды, стабилизированные лактозой. В отличие от полисахаридов серогрупп А и С (далее полисахарид А и С) свободный полисахарид В слабоиммуногенен. Описаны попытки его модификации для усиления иммуногенности и индукции с его помощью защиты против менингококка серогруппы В. Предложено конъюгировать нативный полисахарид В с белками-носителями (RU 2105568 С1, 27.02.1998; US 5902586, 11.05.1999; US 6080589, 27.06.2000, US 6350449 В1, 26.02.2002; US 5683699, 04.11.1997; US 5780606, 14.07.1998), например, столбнячным анатоксином. Известна также конъюгация поверхностных белков N. meningitidis серогруппы В с его же капсульным полисахаридом (US 5811102, 22.09.1998; RU 2181378 С2, 20.04.2002) или его олигосахаридными фрагментами (US 2001/0048929 Al, 06.12.2001). Описано использование конструкций, включающих олисахаридные фрагменты капсульных полисахаридов различных возбудителей (в том числе полисахаридов В менингококка) и гетерологичный белок-носитель (RU 2105568 С1). Антигенной активностью обладает и полисахарид В - белковый комплекс N. meningitides серогруппы В (SU 1708846 A1, 30.01.1992; RU 1750689 A1, 30.07.92; US 4753796, 28.06.1988). Иммунизация перечисленными конструкциями вызывает формирование пула антител к полисахариду В.

Однако использование для вакцинации капсульного полисахарида бактерий серогруппы В вызывает опасения из-за гипотетической возможности развития аутоиммунного заболевания в связи с подобием его структуры углеводным цепям гликопротеинов и ганглиозидов клеток нервных тканей человека и эмбриональных тканей (Finne J., et al.// Lancet - 1983, Vol.1, p.p. 355-357; Finne J., et al.// J. Immunol. - 1987, vol. 138, p.p. 4402-4407). В связи с этим было предложено использовать в качестве вакцин компоненты внешней мембраны менингококка серогруппы В, а именно белки или липополисахарид. Описаны препараты (RU 2068270 С1, 27.10.1996; RU 2074728 C1, 10.03.1997; RU 2161037 С2, 27.12.2000), которые могут быть использованы в качестве основы для создания противоменингококковой вакцины на основе различных вариантов липополисахарида менингококка. Они обладают низкой пирогенностью и токсичностью, однако сведений о протективности для основных серогрупп А, В и С менингококка не приводится.

Внешняя мембрана бактерии N. meningitidis содержит множество белков, к которым во время инфекции образуются протективные (бактерицидные, опсонизирующие) антитела. Поэтому в ряде исследований предложено проводить вакцинацию смесями этих белков или индивидуальными белками. Так, кубинскими исследователями описан способ получения везикулярной вакцины против менингококка серогруппы В, основанный на использовании белкового антигенного комплекса, компоненты которого встречаются у разных патогенных серотипов (RU 2023448 Cl, 10.11.1994). Для увеличения иммуногенности белкового комплекса в препарат вводят капсульный полисахарид С и адъювант (гидроокись или фосфат алюминия). Препарат индуцирует продукцию бактерицидных антител у людей и формирует различную степень защиты от менингококковой инфекции серогруппы В. Похожая везикулярная вакцина, основанная на использовании белков внешней мембраны, но не включающая полисахарид С, описана норвежскими исследователями (Fredriksen J.H. et al., NIPH Ann. - 1991. - vol.14, p.p.67-79). Недостатком этих вакцин является вариация химического состава между партиями, а также недостаточная защита против гетерологичных штаммов особенно у младших возрастных групп ввиду мутаций белков внешней мембраны. Таким образом, они не способны защищать от всего разнообразия циркулирующих штаммов. Везикулярная вакцина, описанная в заявке (US 2002/0110569 A1, 15.08.2002) по замыслу авторов должна защищать против различных серогрупп N. meningitidis, но никаких экспериментальных данных в пользу этого предположения не приводится. Описано также использование для индукции иммунитета против менингококка серогруппы В отдельных мембранных белков (РоrА, Ора, Орс, Тbр), но их структура варьирует от штамма к штамму. Известен высококонсервативный белок NspA (см., например, ЕР 0815234, 07.01.1998 ), но антитела к нему обеспечивают защиту лишь от 50% штаммов N. meningitidis серогруппы В (Мое et al. Infect. Immun., 2001, 69:3762). Новые возможности открыло секвенирование генома N. meningitidis (WO 99/57280, 11.11.1999) и обнаружение целой группы новых поверхностных белков. Ряд белков был получен генно-инженерными методами (WO 01/64920 А2, 07.09.2001; US 2002/0102276 A1, 1.08.2002), однако их защитные свойства не приводятся.

Таким образом, в настоящее время отсутствует эффективная вакцина против менингита В, пригодная для использования в различных регионах мира, что делает целесообразным поиск новых подходов к ее созданию. Кроме того, очевидно, что для профилактики менингококкового менингита целесообразно создавать поливалентные вакцины, защищающие одновременно от менингококков разных серогрупп. Помимо кубинской везикулярной В-вакцины, в состав которой входит полисахарид менингококка серогруппы С (RU 2023448 С1, 10.11.1994), но для которой не продемонстрирована защита от этого серотипа N. meningitidis, описаны комбинированные В/С вакцины, включающие конъюгат полисахарида С с носителем и протеолипосомы, включающие мембранные белки N. meningitidis серогруппы В (WO 99/61053 A1, 02.12.1999; WO 01/37863 А2, 31.05.2001). Эффективность этих конъюгатов продемонстрирована получением антитител на полисахарид и белок. Декларируется протективная активность композиции против менингококков серогрупп В и С, однако при этом экспериментально протективная активность композиции не показана.

Следует также отметить, что во всех описанных выше вакцинах против менингита В для потенциирования иммунного ответа использовался адъювант, главным образом гидроокись алюминия, которая обладает низкой эффективностью. В связи с этим исключение адъювантов представляется обоснованным и целесообразным.

Как следует из приведенного выше материала, полисахарид-белковые и полисахарид-пептидные конъюгаты неоднократно применялись при создании противоменингитных вакцин, однако пептидный компонент использовался лишь в роли носителя Т-эпитопов и, как правило, был чужеродным (неменингококкового происхождения), что не позволяло при инфицировании менингококком отвечать Т-клеткам памяти. Не описано и адъювантное действие полисахарида. Так, в патенте US 6472506 B1, 29.10.2002 описаны полисахаридно-пептидные конъюгаты, в которых пептиды использовались для усиления образования антител на полисахариды менингококка А и С. Несмотря на то, что этот подход довольно эффективен относительно получения антител на полисахарид, однако не показана специфичность противопептидного иммунитета для защиты именно от менингокковой инфекции, поскольку использован пептид, не относящийся к менингококку.

В заявке US 2002/0048929 A1, 06.12.2001 описана вакцина против менингококков индивидуальных серогрупп (А или В, или С... и т.д.) на основе конъюгатов полисахаридов или их фрагментов и белков внешней мембраны или их фрагментов. Вакцину предлагается использовать с адъювантом или без него. Однако в примерах представлены только конъюгаты полисахаридов W, Y с фрагментом чужеродного белка неменингококкового происхождения, и нет сведений о протективной активности этих конъюгатов.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ приготовления вакцины против менингококковой инфекции серогрупп В/С, включающий конъюгацию капсульных полисахаридов с препаратами белков наружной мембраны менингококков серогруппы В, описанный в заявке WO 01/37863 А2, 31.05.2001. Вакцина предназначалась против инфекции, обусловленной менингококками серогрупп В и С, но не предполагалась против менингококка серогруппы А. Эффективность этих конъюгатов продемонстрирована получением антитител на полисахарид и белок, однако при этом экспериментально не показана протективная активность композиции.

Задачей патентуемого изобретения является приготовление бивалентной вакцины, способной защитить от менингококковой инфекции серогрупп В/А или серогрупп В/С, которая не содержит полисахарид и не использует какие-либо адъюванты.

Технический результат изобретения - повышение протективной активности против менигококковой инфекции различных серогрупп, обеспечивается тем, что способ приготовления бивалентной вакцины для профилактики менингококковой инфекции включает конъюгацию капсульных полисахаридов с препаратами белков наружной мембраны менингококков серогруппы В. В качестве препаратов белков наружной мембраны менингококков серогруппы В используют синтезированные пептидные фрагменты белков, выбранные из последовательности аминокислот экспонированных петель и их трансмембранных участков, несущих В- и Т-эпитопы, обладающие протективной активностью в отношении серогрупп А, В и С менингококков, а в качестве капсульных полисахаридов - полисахариды менингококков серогруппы А при приготовлении бивалентной В/А вакцины или серогруппы С при приготовлении бивалентной В/С вакцины, причем перед конъюгацией упомянутые полисахариды менингококков подвергают окислению.

Способ может характеризоваться тем, что используют синтезированные пептидные фрагменты белков классов РоrА или ОраВ.

Способ может характеризоваться также тем, что окисление полисахаридов менингококков серогрупп А или С проводят в течение 2,0 4,0 часов при обеспечении их иммунологической активности.

В патентуемом изобретении предлагается иной метод повышения протективной активности против менингококков серогрупп В и А (или В и С). Он заключается в приготовлении конъюгата полисахарида А (или С) с синтезированными протективными фрагментами белков внешней мембраны менингококка серогруппы В. Протективная активность определяется по различию в защите иммунизированных и контрольных животных от заражения вирулентной культурой менингококка. Обычно наличие протективной активности признается при снижении числа колониеобразующих клеток (КОЕ) более чем в 2 раза или увеличении титра специфических антител также более чем в 2 раза.

Внешняя мембрана бактерии N. meningitidis содержит ряд белков, обладающих протективной активностью. Один из перспективных путей приготовления противоменингитной вакцины заключается в синтезе фрагментов белков наружной мембраны менингококка и создании на их основе искусственного вакцинирующего препарата. Такой подход дает возможность проводить вакцинацию “неинфекционными” химически индивидуальными соединениями, индуцирующими строго направленный иммунный ответ. Исследованные авторами патентуемого изобретения иммунологические свойства пептидных фрагментов белков наружной мембраны менингококка позволили определить перспективные протективные пептиды, на основе которых разрабатывается искусственная противоменингококковая вакцина. Этот подход позволяет обеспечивать защиту против менингококка серогрупп В/А (т.е. В+А) или В/С (т.е. В+С) без применения адъюванта.

Изобретение основывается на экспериментах, результаты которых представлены на рисунках, где:

на фиг.1 представлены характеристики полисахарида А в зависимости от времени его окисления;

на фиг.2, 3 - фрагменты ЯМР-спектров конъюгата полисахарида А;

на фиг.4 - иммуногенная активность полисахаридного компонента конъюгатов после иммунизации этими конъюгатами (титр антител к полисахариду А);

на фиг.5 - протективная активность полисахаридного компонента конъюгатов при заражении менингококком серогруппы А;

на фиг.6 - иммуногенная активность пептидного компонента конъюгатов после иммунизации этими конъюгатами (титр антител к пептиду);

на фиг.7 - протективная активность пептидного компонента конъюгатов при заражении менингококком серогруппы В.

Вакцина против менингококка готовится с использованием капсульного полисахарида из микробной массы менингококка серогруппы А или серогруппы С. Капсульные полисахариды возбудителя N. meningitidis серогрупп А и С (в дальнейшем полисахарид А и полисахарид С соответственно) являются промышленными коммерческими препаратами, на основе которых приготовляются применяемые в настоящее время вакцины против бактериального менингита.

Способ приготовления вакцины одинаков как для полисахарида А, так и для полисахарида С. Экспериментальные данные, приведенные на фигурах, относятся к приготовлению вакцины менингококковой инфекции серогрупп В/А (то есть серогруппы В и серогруппы А),

Капсульный полисахарид А (или С соответственно) подвергали окислению по методу Дженингса с соавторами (Jennings H.J., C.Lugovski. //J. Immunology, Sept. 1981, v.1 27, №3; US 5902586). Навеску сухого полисахарида А растворяли в фосфатном буфере (0,1М, рН 6.0) с добавлением 60 % раствора NaIO₄. Раствор интенсивно перемешивали в течение 1 мин, после чего инкубировали при комнатной температуре в темноте.

Оптимальная длительность инкубирования установлена экспериментальным путем, исходя из того, что, с одной стороны, в результате окисления полисахарида должно генерироваться достаточное количество высокореакционноспособных функциональных групп, необходимых для конъюгации с пептидами. С другой стороны, окисление полисахарида должно приводить к минимальному нарушению пространственной конфигурации полисахарида, то есть к сохранению иммуногенной активности.

Для установления оптимальной длительности инкубирования, в процессе окисления проводился отбор проб через 2, 4, б и 24 часа от момента начала реакции. Исследование показало, что максимальное число альдегидных групп полисахарида достигается при времени реакции более 2 часов (фиг.1, кривая 1). При этом результаты иммунологического анализа этих же проб показали, что в течение первых четырех часов практически не происходит снижения иммуногенности (фиг.1, кривая 2).

При 6-часовой обработке происходит деградация препарата - его иммунологическая активность снижается в 2 раза. Через 24 часа инкубации активность окисленного полисахарида снижается примерно в 16 раз. На основании этих данных, а также принимая во внимание сохранение активности полисахарида, была установлена оптимальная длительность окисления 2,0-4,0 часа. Полученные результаты по времени окисления сходны с рекомендациями - 2 часа, приведенными в описании патента US 5902586, однако полученными для полисахарида В.

Далее к реакционной смеси добавляли этиленгликоль до достижения концентрации 4%, перемешивали и оставляли на 1 час. Окисленный полисахарид отделяли от низкомолекулярных продуктов реакции посредством гель-фильтрационной хроматографии на колонке PD-10 (сорбент - Sephadex G-25M, длина колонки - 5 см, объем колонки - 9,1 мл). Детектор - Pharmacia LKB Uvicord SII (источник света - ртутная лампа, используемая длина волны - 226 нм), элюент - вода, скорость элюирования ~1 мл/мин. Колонка предварительно откалибрована по красителю Blue Dextran-2000 №С505. Собиралась фракция, соответствующая первому пику хроматограммы, выходящая с объемом, равным свободному объему колонки (~3 мл). Фракцию упаривали на аппарате SpeedVac (скорость центрифуги - 20 000 об/мин, время осушки ~12 часов). Выход окисленного полисахарида составляет ~80%, что соответствует данным Дженингса 63-86%.

На фиг.2, 3 представлены фрагменты ЯМР-спектров конъюгата полисахарида А, с использованием тирозина в качестве модельного аминокомпонента. Оценка эффективности конъюгации определялась по соотношению значений интегралов пиков ЯМР-спектров, соответствующих ароматическим протонам тирозина и NAc-протонам полисахарида. Установлено, что максимальная степень модификации полисахарида составляет 1:4 (на 4 звена полисахарида приходится 1 остаток тирозина). Выход конъюгата составляет ~46% от максимального теоретически возможного (если количество тирозина, необходимого для полной модификации всех неацилированных звеньев цепи полисахарида, принять за 100%). По данным спектрофотометрии, средняя степень модификации также составляла 1:4 (при выходе конъюгата ~45%). Образование двойной связи C=N в конъюгате дополнительно подтверждено методами ИК-спектроскопии. Полученные данные хорошо воспроизводимы от опыта к опыту.

Для последующей конъюгации приготовленных полисахаридов использовали пептиды, синтезированные в группе синтетических вакцин Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Их структура представлена в табл. 1. Пептиды выбраны из последовательности аминокислот экспонированных петель и их трансмембранных участков, несущих В- и Т-эпитопы, обладают протективной активностью в отношении серогрупп А, В и С менингококков.

Конъюгацию полисахарида с синтезированными пептидами проводили по методике Каспера (D.L.Kasper et al. /J. din. Invest., Nov. 1996, v.98, №10, p.2308-2314). Сухой окисленный полисахарид (А или С) растворяли в карбонатном буфере (0,1М, рН 9,0) до концентрации 2 мг/мл и добавляли требуемое количество пептида, предварительно растворенного в том же буфере до концентрация раствора 2 мг/мл. Раствор перемешивали и оставляли в темноте на 5 дней для конъюгации при комнатной температуре в закрытой пробирке.

Таблица 1 Структуры использованных пептидов в виде последовательностей аминокислот
Класс белка	Характеристики синтезированного пептида
	Номер	Мол. масса	Структура
РоrА	<I> 273-292	2135	AQLDLSENGDKTKNSTTEIA
	<II> 306-332	2324	ISYAHGFDFIERGKKGENTSYDQIIAG
ОраВ	<III> 41-63	2703	DYFRNYRTHSIHPRVSVGYDPGD
	<IV> 109-130	2475	TFHAVSSLGLSAIYDFKLNDKF
	<V> 131-150	2732	DKFDKFKPYIGVRVAYGHVKHQV

Через 5 дней готовый конъюгат отделяли гель-фильтрационной хроматографией на колонке PD-10 от низкомолекулярных продуктов реакции. Фракцию, соответствующую первому хроматографическому пику, собирали и упаривали на аппарате SpeedVac (скорость центрифуги - 20 000 об/мин, время осушки ~12 часов).

Выход сухого препарата в результате конъюгации для исследованных пептидов, представленных в табл. 1, составляет от 59 до 98%.

Активность полученных препаратов оценивали по нарастанию специфических антител и по степени защищенности мышей, иммунизированных конъюгатами, от заражения менингококком серогрупп А и В.

На фиг.4, 5 показана иммуногенная и протективная активности полисахаридного компонента конъюгатов (черные столбцы - контроль). Для оценки указанных показателей мышей линии СВА внутривенно иммунизировали пептидполисахаридными конъюгатами. Уровень антител в крови к полисахариду определяли методом ИФА на 6-й день после иммунизации животных. В дальнейшем животных заражали живой вирулентной культурой менингококка серогруппы А. Показателем защищенности животных от менингококковой инфекции служило снижение числа микробов (КОЕ) в крови иммунизированных мышей по сравнению с контрольными животными. Контролем служили неиммунизированные мыши, зараженные по той же схеме.

Протективную активность полисахаридного компонента конъюгата оценивали при заражении мышей менингококком серогруппы А (штамм А208). Положительным контролем служили мыши, иммунизированные полисахаридом А.

Из фиг.4 видно, что уровень специфических антител к полисахаридному компоненту одинаков для всех изученных конъюгатов, соответствует 1:160 и является протективным как в опытах на животных, так и для человека. При этом не имеет значения вид конъюгируемого пептида.

Из фиг.5 видно, что уровень КОЕ в крови иммунизированных конъюгатами мышей был существенно ниже и колебался от 8 до 58 КОЕ в единице объема крови, по сравнению с контрольными мышами (250 КОЕ). Иммунизация мышей полисахаридом приводила к снижению числа КОЕ до 5. Число микробов в крови зараженных животных снижалось более чем в 2 раза (для отдельных пептидов защита составляла от 79 до 97%).

Из полученных данных следует, что полисахаридный компонент конъюгата сохраняет свою протективную активность и способен защищать животных от менингококка серогруппы А.

На фиг.6, 7 показана иммуногенная и протективная активности пептидного компонента конъюгатов. Уровень антител в крови животных к пептидному компоненту определяли методом ИФА на 30-й день после иммунизации. В дальнейшем мышей заражали живой вирулентной культурой менингококка серогруппы В. Контролем служили неиммунизированные мыши, зараженные по той же схеме. Протективную активность пептидного компонента конъюгата оценивали при заражении мышей менингококком серогруппы В (штамм Н44/76).

Из фиг. 6 видно, что уровень специфических антител к пептидному компоненту варьирует. В частности, для пептидов <III> и <V> антитела не выявлялись. Следует отметить, что антитела к этим пептидам не выявлялись и при иммунизации мышей свободными пептидами с адъювантом, хотя протективная активность присутствовала - см. Д.О.Короев и др. Индукция противоменингитного иммунитета с помощью синтетических пептидов. II. Иммуноактивные синтетические фрагменты белка ОраВ из Neisseria Meningitidis. II Биоорган, химия, 2001, т.27, N 1, с.21-26. Для пептида <IV> уровень специфических антител составил 1:640. Особый интерес представляет конъюгат с пептидом <I>, поскольку при иммунизации этим пептидом в свободном состоянии антитела не выявлялись. Титр антител к этому пептиду после конъюгации его с полисахаридом составил 1:160.

Из фиг.7 видно, что уровень КОЕ в крови иммунизированных конъюгатами мышей существенно ниже по сравнению с контрольными мышами (250 КОЕ). Каждый из пяти введенных конъюгатов защищал мышей от заражения менингококком. Число микробов в крови зараженных животных снижалось более чем в 2 раза (для отдельных пептидов защита составляла от 54 до 86%). В то же время иммунизация мышей полисахаридом А приводила к статистически незначимому снижению числа КОЕ (до 180). Из полученных данных следует, что пептидный компонент конъюгата сохраняет свою протективную активность и способен защищать животных от менингококка серогруппы В.

Аналогичные экспериментальные материалы получены и для менингококковой инфекции серогрупп В/С.

Таким образом, приведенные экспериментальные данные показывают перспективность патентуемого способа приготовления поливалентной менингококковой вакцины против менингокококовой инфекции серогрупп В/А или серогрупп В/С на основе полисахаридов серогруппы А или С и пептидных фрагментов белков наружной мембраны менингококка серогруппы В.

Патентуемые бивалентные В/А и В/С вакцины создают возможность при их ассоциации получить поливалентный вакцинный препарат для профилактики трех основных эпидемически значимых возбудителей менингококковой инфекции серогрупп А, В, С.