способ обнаружения ошибочно спаренных оснований в нуклеиновых кислотах

Формула изобретения

1. Способ обнаружения ошибочного спаривания одной или более числа пар оснований в тестируемой нуклеиновой кислоте, включающий получение тестируемой и эталонной ДНК в одноцепочечной форме путем амплификации с праймерами, один из которых мечен по 5'-концу; приведение в контакт цепочек с получением гетеродуплекса и гомодуплекса; иммобилизацию полученного гетеродуплекса на носителе; приведение иммобилизованного гетеродуплекса в контакт с пептидами, экспонированными на фаговой частице; удаление фагов, не связавшихся с гетеродуплексом: диссоциацию связавшихся фагов и отделение их от гетеродуплекса; проведение связывания диссоциированных фагов с гомодуплексом; отделение связавшихся с гомодуплексом фаговых частиц; размножение не связавшихся фаговых частиц на чувствительном штамме бактерии Е. coli; определение наличия или отсутствия ошибочного спаривания с помощью размноженных фагов путем сравнения титров фаговых частиц, связавшихся на испытуемом гетеродуплексе и эталонном гомодуплексе, при этом соотношение указанных титров от 5 до 3 раз, полученное при делении оптической плотности (ОП₆₀₀) для гетеродуплекса на оптическую плотность для гомодуплексов, свидетельствует о наличии ошибочного спаривания в испытуемом гетеродуплексе.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве метки при проведении амплификации для получения одноцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот используют биотин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве носителя для временной иммобилизации гетеродуплекса используют парамагнитные микрочастицы Fе₃ O₄, несущие на поверхности несколько молекул стрептавидина.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве пептидов, экспонированных на поверхности фаговых частиц, используют статистически выбранные пептиды в составе фаговой библиотеки р III HPL 15.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области молекулярной генетики и биотехнологии, конкретно к способам обнаружения ошибок спаривания оснований в нуклеиновых кислотах (точечных мутаций), что является основой для автоматизации молекулярно-эпидемиологических исследований различных заболеваний. Предлагаемое техническое решение касается использования фагового дисплея для поиска пептидов, экспонированных на поверхности фаговой частицы и проявляющих способность связываться с неспаренностями.

Точечные мутации лежат в основе многих серьезных многофакторных заболеваний, таких как рак, атеросклероз и т.д. Выявление полиморфизма генов и влияние точечных мутаций в медицине и генетике крайне актуально. С полиморфизмом генов связывают лекарственную устойчивость патогенных микроорганизмов, чувствительность организма-хозяина к инфекциям, к неблагоприятным факторам окружающей среды (радиации, химическим мутагенам), к эффективности вакцинации и т.п. Определение точечных мутаций в генах по многим локусам из большого количества образцов ДНК является основой молекулярно-эпидемиологических исследований различных заболеваний и требует создания быстрых и простых методов [1]. В связи с широким использованием однонуклеотидных полиморфных маркеров для обнаружения геномных локусов, влияющих на фенотипическую вариабельность различных признаков, таких как устойчивость к инфекциям, опухолям, неблагоприятному воздействию мутагенных факторов окружающей среды и т.п., особенно возрастает потребность в методах с высокой пропускной способностью, пригодных для автоматизации, а именно в связи с развитием технологии чипов.

Известны и широко используются способы, основанные на предварительной амплификации анализируемого фрагмента ДНК (или кДНК) в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и конформационно обусловленных различиях в электрофоретической подвижности цепей ДНК с мутациями и без них. Одним из простых является способ использования одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP, single-stranded conformational polymorphism) [2]. Этот способ заключается в том, что дикий и мутантный тип ДНК-мишени амплифицируют в ПЦР, денатурируют и после медленной ренатурации разделяют электрофорезом в ПААГ-геле в неденатурирующих условиях (обычно с добавлением глицирина). Одноцепочечная ДНК ренатурирует в трехмерную структуру в соответствии с первичной нуклеотидной последовательностью. Изменения в последовательности (вплоть до замены одного нуклеотида) влияют на третичную структуру и приводят к изменению подвижности образца в геле, что может быть визуализировано известными способами (окраской этидиум бромидом, серебром, введением радиоактивной или флюоресцентной метки). SSCP показывает высокую чувствительность при анализе небольших фрагментов ДНК (не более 200 п.о.); при увеличении длины фрагмента до 400 п.о. и более чувствительность способа резко падает, что является его основным недостатком.

Другим широко используемым способом является денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE-denaturing gradient gel electrophoresis), который также основан на различиях в миграции ДНК-фрагментов дикого и мутантного типов [3]. В отличие от SSCP, DGGE более трудоемок, так как после ПЦР и денатурации ДНК проводят перекрестное смешивание образцов для получения смеси гетеро- и гомодуплексов, которую анализируют по подвижности в геле с градиентом денатурирующего агента (мочевины). Оптимальным для анализа являются фрагменты длиной от 400-800 п.о. Кроме длины исследуемого фрагмента чувствительность способа также зависит от нуклеотидного окружения мутации, что требует дополнительных ухищрений, а именно - подбора определенных праймеров с повышенным содержанием G/C - пар нуклеотидов. Эти недостатки, а также необходимость применения дорогостоящей аппаратуры, ограничивают использование DGGE.

Иным подходом к определению ошибок спаривания оснований в нуклеиновых кислотах являются способы, основанные на химическом или ферментативном расщеплении двуспиральных фрагментов нуклеиновых кислот в месте локализации неспаренного основания в искусственно сформированном гетеродуплексе ДНК-ДНК (для химического) и РНК-ДНК (для ферментативного расщепления). Недостатком при использовании ферментативного расщепления является необходимость применения меченой РНК, которая является нестабильным субстратом, а сам способ по чувствительности не превышает 50%. Химическое расщепление не требует получения РНК, однако, для детекции расщепленной ДНК используется токсичный химический агент-пиридин [4]. Несмотря на высокую чувствительность (до 100%) и широкий диапазон анализируемых длин (до 1,7 тыс. п.о.), необходимость использования высокотоксических веществ значительно ограничивает использование данного способа в широких медико-генетических исследованиях, не говоря о широком внедрении в практику.

Известен способ обнаружения ошибочного спаривания одной или большего числа пар оснований путем расщепления резолвазой [5]. Способ предусматривает контакт эталонной и тестируемой нуклеиновых кислот в одноцепочечных формах для образования гетеродуплекса, который иммобилизуется на гелеподобном носителе, с резолвазой (например, Т4 эндонуклеазой VII), способной распознавать по меньшей мере одно ошибочное спаривание с последующим расщеплением до образования продуктов, анализируемых гель-электрофорезом. Недостатком данного способа является то, что на конечном этапе для получения результата требуется проведение электрофореза, что затрудняет полную автоматизацию процесса.

В настоящее время интенсивно изучается вопрос о возможности детекции неспаренных оснований в составе двуцепочечной ДНК с помощью ферментов системы репарации. В частности, показано, что белок MutS может специфически связываться с ДНК, содержащей неспаренные основания, а образовавшийся комплекс может детектироваться по изменению подвижности при электрофорезе [6, 7]. Основные проблемы, ограничивающие широкое использование Mut-белков, заключаются в низких значениях констант связывания (особенно к А/С паре), высокой чувствительности к конкретному нуклеотидному окружению и неспецифическом связывании с ДНК при различных вариантах первичной структуры.

Технической задачей изобретения является создание унифицированного (быстрого и простого) способа для определения однонуклеотидных замен (точечных мутаций) на дуплексе ДНК, использующего ДНК-белковые взаимодействия. При этом ключевую роль должна играть возможность быстрого подбора белкового лиганда, специфичного для нуклеотидных замен в конкретном геномном локусе, который будет подвергаться массовому анализу.

Перспективным направлением для решения этой проблемы может оказаться использование технологии "фагового дисплея", который становится наиболее распространенным подходом к исследованию механизма связывания белков с различными субстратами.

Возможность селекции фагов, связывающихся со специфическими фрагментами ДНК и РНК, из состава рекомбинантной библиотеки, содержащей случайные пептидные вставки в поверхностных фаговых белках, была продемонстрирована в ряде экспериментов по изучению взаимодействий белков с нуклеиновыми кислотами [8, 9].

Использование "фагового дисплея" для определения ошибочно спаренных оснований в нуклеиновых кислотах в литературе не описано.

Поставленная задача решается путем разработки стратегии отбора фагов, несущих пептидные аналоги функционально активных модулей белков репарационной системы, способных избирательно связываться с участками неспаренных оснований на двуцепочечных ДНК конкретного локуса, что является основой создания способа для обнаружения точечных мутаций в генах и изучения их полиморфизма. Стратегия основана на комбинации "фагового дисплея" с использованием биотинилированных праймеров для получения ПЦР-фрагментов и парамагнитных частиц со стрептавидином для физического разделения комплексов ДНК-фаг.

Сущность предлагаемого способа определения ошибочно спаренных оснований в ДНК (точечных мутаций) заключается в том, что на начальной стадии процесса получают одноцепочечную форму тестируемой ДНК (например, в ПЦР амплификации с последующим денатурированием) и эталонной нуклеиновой кислоты - гомологичный участок ДНК дикого типа (например, в ПЦР с последующим денатурированием или химически синтезированный олигонуклеотид), при этом реакцию амплификации проводят с праймерами, один из которых биотинилирован по 5'-концу; затем осуществляют контакт между цепочками и временную иммобилизацию полученного гетеродуплекса (например, с помощью магнитных микрочастиц Fе₃O₄, несущих на поверхности несколько молекул стрептавидина); иммобилизованный гетеродуплекс приводят в контакт с пептидами, экспонированными на поверхности фаговой частицы (например, со статистическими (рандомизированными) пептидами в составе фаговой библиотеки HPL); проводят полное удаление несвязавшихся с гетеродуплексами ("ненужных") фагов, реассоциацию связавшихся фагов и отделение их от гетеродуплекса (например, с помощью магнитного разделения с использованием системы "Dynal") и последующее повторное ("вычитающее") связывание реассоциированных фагов с гомодуплексом (например, неденатурированным гомологичным ПЦР-фрагментом ДНК дикого типа); в завершение проводят удаление связавшихся с гомодуплексом фаговых частиц вместе с гетеродуплексом (например, с использованием магнитной системы Dynal) от несвязавшихся, которые размножают на чувствительном штамме E.coli (например, Е. coli К 91).

Отселектированные подобным образом фаги избирательно (предпочтительно) связываются с ошибочно спаренными основаниями в составе любого гетеродуплекса. Для усиления чувствительности процедуру селекции (раунд) можно повторить. Полученные фаги могут быть иммобилизованы на различные носители и использоваться в полностью автоматизированных процессах (например, в чипах).

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

- Фиг.1. Схема получения гетеродуплексов.

- Фиг.2. Схема селекции фагов.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого технического решения ниже следуют примеры его осуществления.

Пример 1. Получение тестируемой и эталонной ДНК в одноцепочечной форме с обеспечением последующего контакта между цепочками для получения временно иммобилизованного гетеродуплекса с неспаренными основаниями

Гетеродуплексы получают путем смешивания различных цепей фрагментов ДНК, отличающихся точечными несоответствиями (один как пример тестируемого, другой - эталонный), полученными в реакции амплификации с праймерами, один из которых биотинилирован с 5' конца. (Фиг.1). Праймеры имеют следующую структуру:

- Р5: 5'-*АСТ ССА ССА ТТА GCA ССС ААА G (биотинилированный)

- Н: 5'-TGA ТТТ САС GGA GGA TGG TG (небиотинилированный)

Состав реакционной смеси: буфер (75 мМ трис-HCl, 20 мМ (NH₄)₂SO₄ , 0,01% Twin-20, 4 мМ MgCl₂); dATP, dGTP, dTTP, dCTP каждый 0,2 мМ; праймеры каждый 0,5 мкМ (5-10 рмоль); Taq - ДНК полимераза 2,5 е.а./100 мкл; геномная ДНК 0,3 мкг. ПЦР проводят в объеме 25 мкл. Температурный режим: 94°С - 1 мин, 58°С - 0,6 мин, 72°С - 0,4 мин, 38 циклов. Качество продукта контролируют в 4% полиакриламидном гель-электрофорезе (соотношение акриламид /бисакриламид 19:1).

Выделение биотинилированного ПЦР-фрагмента ДНК осуществляют с использованием системы магнитных микрочастиц Fе₃O₄, несущих на поверхности несколько молекул стрептавидина (фирма Dynal, Норвегия). Для этого микрочастицы, отмытые от буфера хранения, смешивают с раствором ДНК и инкубируют 15 мин при комнатной температуре для связывания биотина в составе ПЦР-фрагмента со стрептавидином на магнитной частице. Оптимальное соотношение составляет 5 мкг микрочастиц к 1 мкл реакционной смеси ПЦР. Суммарно, к 40 мкл суспензии микрочастиц в буфере 2×BW (WB:5 мМ трис НСl, pH 7,5; 0,5 мМ EDTA; 1 мМ NaCl) добавляют 40 мкл ПЦР-смеси. После инкубации микрочастицы со связавшимися через биотин-стрептавидиновое взаимодействие молекулами ДНК осаждают, поместив пробирку в магнитное поле. После этого супернатант отбрасывают, а осадок дважды промывают в буфере BW путем суспендирования с последующим повторным магнитным разделением.

Разделение цепей ДНК ПЦР-фрагментов проводят в соответствии с рекомендациями фирмы Dynal с небольшими модификациями. Для этого выделенную описанным выше способом ДНК денатурируют в 10 мкл 0,1 М NaOH в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем пробирку помещают в магнитное поле и осаждают микрочастицы на стенке пробирки. При этом осаждается биотинилированная цепь. В растворе остается цепь ДНК, не имеющая биотиновой метки. Супернатант отбирают в отдельную пробирку и нейтрализуют добавлением 5 мкл 0,2 М НСl и 1 мкл 1 М трис-HCl, pH 7,5. Осадок микрочастиц, связанных с ДНК, промывают последовательно 50 мкл 0,1 М NaOH, 50 мкл буфера BW, 50 мкл буфера ТЕ. После этого комплиментарные цепи перекрестно объединяют между собой при нейтральном pH. Таким образом, биотинилированная цепь одного типа первичной структуры объединяется с небиотинилированной цепью другого (фиг.1). Для ренатурации смесь прогревают 10 мин при 95°С и затем медленно охлаждают до 30°С в течение 30-40 мин. Гомодуплексы, используемые в стадии “вычитания” и для оценки эффективности связывания, представляют собой 2 типа исходных ПЦР-фрагментов (1b-1а и 2b-2а) с полностью спаренными основаниями.

Пример 2. Приведение иммобилизованного гетеродуплекса в контакт с пептидами, экспонированными на фаговой частице, с последующей диссоциацией связавшихся фагов (после предварительного полного удаления несвязавшихся фагов) и отделением их от гетеродуплекса.

Гетеродуплексы, получение которых описано в Примере 1, используют для селекции фагов, избирательно связывающихся с неспаренными участками. Общая схема одного раунда селекции представлена на фиг.2.

Для селекции была использована пептидная фаговая библиотека рIII- HPL 15, любезно предоставленная G.P.Smith (University of Columbia, Missouri, U.S.A.). Библиотека представляет собой коллекцию 15-мерных пептидов, экспонированных на поверхности нитчатого фага f1 E.coli в составе минорного белка оболочки pIII, со статистически выбранной пептидной вставкой длиной 15 а.к. в минорный А белок [10]. Концентрация фаговых частиц в исходной библиотеке составляет 10¹⁴ вирионов/мл.

Все манипуляции с фагами, а именно размножение и титрование с использованием чувствительных клеток E.coli К.91 Kan (Km^r) проводят в соответствии с методами [11]. В селекционном раунде проводят инкубацию в буфере связывания (ВС, 10 mM NaCl; 20 mМ Tris-HCl, pH 7,8; 5 mМ MgCl) фаговых частиц с искусственными гетеродуплексами в соотношении 10:1. Лимитирующим в данном соотношении было количество биотинилированного гетеродуплекса, обеспечивающее компактность магнитного осадка и визуальный контроль за ним. Эти требования были соблюдены при внесении в инкубационную смесь не менее 2×109 виpиoнoв/мкл.

После 30 мин инкубации при 37°С получают магнитный осадок, содержащий взаимодействующие с гетеродуплексом фаги. Осадок после удаления магнитного супернатанта, содержащего несвязавшиеся фаги, многократно промывают до полного устранения фагового фона, что контролируют титрованием промывочных фракций. Осадок ресуспендируют в буфере диссоциации (BD, 1 M NaCl,) в течение 10 мин при температуре 50°С для разделения фагов и гетеродуплексных фрагментов. Освободившиеся от фагов гетеродуплексы удаляют путем магнитного осаждения, а к оставшимся фагам добавляют 5 мкл гомодуплексов при соотношении (10:1).

Селекция начинается со стадии инкубации фагов с биотинилированными гетеродуплексами. В первом раунде гетеродуплексы инкубируют с фагами из исходной фаговой библиотеки. В последующих раундах инкубацию проводят с фагами, полученными в предыдущем раунде.

Условия инкубации были подобраны, исходя из необходимости обеспечения максимального специфического связывания фагов к неспаренным участкам. Исходя из предположения, что фаговые пептиды функционально имитируют взаимодействие белка Mut S с неспаренными участками ДНК [7], при выборе условий руководствовались данными, что в отличие от Zn finger белков, связывающихся с ДНК в присутствии ионов Zn [9], белки Mut семейства не являются металлозависимыми и, как показали эксперименты, связывание их с ДНК происходит при физиологических значениях pH, концентрации соли и в диапазоне температур от 20 до 40°С [6, 7].

Объем инкубационной смеси был равен 10 мкл, что с одной стороны было вызвано необходимостью обеспечения более высокой концентрации взаимодействующих компонентов (фагов и дуплексов), а с другой стороны - это был минимальный объем, в котором проведение магнитного разделения поддается визуальному контролю.

После инкубации, как видно из фиг.2, все связавшиеся с ДНК фаги находятся в магнитном осадке, а не связавшиеся - в супернатанте, который в дальнейшем удаляется. Причем среди фагов, связавшихся с ДНК, есть как нужные, взаимодействующие только с неспаренными участками (mismached bind (МВ)-фаги), так и фаги, которые связываются со спаренными участками ДНК (sequence bind (8В)-фаги) на протяженности всего дуплекса. Спаренные области ДНК фрагмента, как показано выше, идентичны у гомо- и гетеродуплексов. Полное удаление всех фагов (кроме SB- и МВ-фагов), в том числе и связавшихся с другими субстратами (магнитными частицами, стенками пробирок и пр.), осуществляют путем серии "отмывок" при последовательной смене буфера с последующим его удалением после магнитного связывания комплексов гетеродуплекс - фаг (фиг.2). Необходимое число "отмывок" было определено экспериментальным путем. Для этого после каждой "отмывки" определяли количество фагов, оставшихся в магнитном супернатанте. Результаты определения необходимого количества "отмывок" для полного удаления несвязавшихся фагов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Динамика "отмывок" "неспецифических" фагов
Количество "отмывок"	Количество неспецифических фагов в супернатанте, ф.ч./мкл
5	(5-11)·105
7	(5-8)·10 2
10	0

Для увеличения эффективности удаления неспецифических фагов объем отмывочного буфера многократно (в 20 раз) превышал объем инкубационной смеси. Однако, как видно из таблицы, после пятой "отмывки" остается достаточно много "неспецифических" фагов, и только после десятой фаговый фон исчезает.

После того как "неспецифические" фаги полностью удалены, проводят стадию диссоциации комплекса гетеродуплекс - фаг. Диссоциацию проводят в буфере, содержащем NaCl (до 1 М) и при повышенной температуре (до 50°С). Такие достаточно "жесткие" условия отмывки способствуют более эффективной диссоциации фаговых частиц и ДНК. При этих условиях жизнеспособность фаговых частиц не нарушается [12]. Титрование фагов после диссоциации показывает, что общее количество фагов, специфически связавшихся с гетеродуплексами, составляет 10⁴-10⁵ частиц, причем в этот общий пул входят как MB-, так и SB-фаги.

Пример 3. Проведение "вычитающего" связывания реассоциированных фагов с гомодуплексом для удаления вместе с дуплексом, с последующим размножением оставшихся (нужных фагов) на чувствительном штамме E.coli.

Для удаления "ненужных" SB-фагов, пользуясь тем, что спаренные участки у гомо- и гетеродуплексов идентичны, вводят дополнительную стадию "вычитания" - связывание с гомодуплексами (фиг.2). Количество оставшихся после "вычитания" MB- фагов составляет 10¹-10² частиц, т.е. доля "нужных" фагов составляет не более 1% от общего количества связывающихся с ДНК. Предполагая, что связывание фагов с дуплексом по всей длине является равновероятным событием, и учитывая, что протяженность неспаренных оснований составляет не более 1,5% (общее число 447 н.п.-100%, 7 неспаренных оснований - 1,5%), полученные результаты являются вполне ожидаемыми.

Полученные в первом раунде фаги размножают до необходимого титра (10⁹ вирионов в мкл) на чувствительной к фагам культуре E.coli K 91. В общей сложности было проведено 5 раундов селекции.

Пример 4. Оценка эффективности селекции.

Эффективность селекции оценивали по разнице величин оптической плотности (при ОП₆₀₀) после диссоциации связавшихся отселектированных фагов с гетеро- и гомодуплексами. Для этого после соответствующего размножения и концентрирования этих фагов (до 10⁹ вирионов /мкл) проводили инкубацию с дуплексами (отдельно для гомо- и гетеродуплекса). После инкубации следовала 10-кратная отмывка, с последующей стадией диссоциации. Все процедуры проводили, как описано выше. После диссоциации проводили измерение оптической плотности.

В качестве дополнительного контроля брали фаги из исходной библиотеки.

Полученные MB-фаги были оценены по способности отличать гетеродуплексы с неспаренными основаниями от полностью спаренных дуплексов (гомодуплексов). Для сравнения проводили инкубацию фаговых частиц из исходной фаговой библиотеки (pIII НРL-15).После связывания диссоциацию фагов и ДНК дуплексов проводили в условиях, описанных выше. Количество диссоциированных фагов определяли по оптической плотности (ОП ₆₀₀).

Результаты оценки эффективности связывания представлены в таблице 2.

Таблица 2
Эффективность избирательного связывания
Фаг		Оп600
		Гетеродуплекс	Гомодуплекс
Отселектированный	3-й раунд	2,8-3,1	0,45-0,65
	5-й раунд	1,55-1,35	0,45-0,75
Исходный (HPL-15)		0,1-0,18	0,20-0,45

Как видно из таблицы, отселектированные на гетеродуплексах фаги более эффективно связываются именно с данными типом дуплекса. Разница по эффективности связывания с гетеро- и гомодуплексами составляет от 5-ти (в 3 раунде) до 3-х (в 5 раунде) раз. В то же время фаги из исходной фаговой библиотеки практически не связываются с гетеродуплексом. Изменения эффективности связывания зависят, вероятно, от доли МВ-фагов в общем пуле фагов, полученных после размножения в каждом раунде.

Таким образом, предложена система селекции фагов, избирательно (предпочтительно) связывающихся с ошибочно связанными основаниями в составе любого гетеродуплекса. Полученные фаги могут быть использованы для анализа полиморфизма генов, выявления точечных мутаций, а при иммобилизации на различные носители и в полностью автоматизированных процессах, например в чипах.

Литература

1. Grompe M. // Nat. genetics - 1993, v.5, p.111-116.

2. Orita M., Iwahana M., Kanazawa H. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1989, v.86, p.2766-2770.

3. Borresen A.-L., Hoving E., Smith-Sorensen В., Malkin D., Lystad S., Andersen Т., Nesland J.M., Isselbacher K.J., Friend S.H. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991, v.88, p.8405-8409.

4. Anon A. // Nat. Genetics - 1998, v.20, p.217-218.

5. Патент США №5876941, кл. С 12 Q 1/68 // Бюлл. ИСМ - 2000, вып.46, №3, стр.72.

6. Jiricny J., Su Sh.-S., Wood S.G., Modrich P. // Nucl. Acids Res. - 1988, v.16, №16, p.7843-7853.

7. Lishanski A., Ostrander E.A., Rine J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1994, v.91, p.2674-2678.

8. Smith P.G., Petrenko V.A. // Chem. Rev. - 1997, v.97, p.391-410.

9. Choo Y, Klug A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994, v.91, p.11163-11167.

10. Friesen W.J, Darby M.K. // J. Biol. Chem - 1997, v.272, №17, p.10994-10997.

11. Choo Y., Sanchez-Garcia I., Klug A. // Nature - 1994, v.372, p.642-645.

12. Smith G.P., Scott J.K. // Methods in Enzymology - 1993, v.2217, p.225-229.