способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом

Формула изобретения

Способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом, включающий образование иммунокомплекса на поверхности электрода, отличающийся тем, что для образования иммунокомплекса инкубируют в сыворотке крови антиген, иммобилизованный на поверхности толстопленочного графитового электрода, промывают электрод буферным раствором и инкубируют с раствором белка не иммунного происхождения, меченного металлом, с последующей повторной промывкой буферным раствором и помещают в трехэлектродную ячейку, в которой определяют специфические антитела по реакции окисления металла.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области электрохимических методов анализа, а именно к диагностике патологических состояний при анализе биологического объекта.

Используемые в настоящее время методы диагностики требуют сложного и дорогостоящего оборудования, т. к. они основаны на спектрофотометрической регистрации аналитического сигнала. Применяемые в этом методе в качестве метки антитела против человеческих иммуноглобулинов конъюгированы с ферментом пероксидазой хрена. Процесс конъюгирования является дорогостоящей, трудоемкой процедурой, кроме того, фермент как органическая макромолекула со специфической функцией не устойчив. В случае электрохимического способа определения необходимо привлечение дополнительных медиаторных систем, которые являются также неустойчивыми реагентами.

Известен способ определения патологических состояний, в котором используют человеческий сывороточный альбумин и ионы висмута в качестве модели для иммуноэлектрохимического анализа. Комплексообразователь, используемый для конъюгации антител и ионов висмута - диэтилтриаминпентаацетат (ДТА). Подложка - электроды, изготовленные методом трафаретной печати. На поверхность электродов наносят раствор нечеловеческого сывороточного альбумина (ЧСА), затем инкубируют 30 минут в блокирующем растворе (фосфатный буфер рН=7.2, твин-20) и стандартный раствор, содержащий 10 мг/мл ЧСА-ДТА-Висмут. Сигнал регистрируют методом инверсионной потенциометрии. Берут свободный реагент, содержащий 1,0 М раствор соляной кислоты и 20 мг/мл Hg²⁺, капают на рабочую поверхность. Ртуть, совместно выделенная, после покрытия образует нерастворимое соединение с висмутом. Потенциограмму регистрируют одновременно с процессом химического окисления (J. Wang and В. Tian "Thick-Film Electrochemical Immunosensor Based on Stripping Potentiometric Detection of a Metal Ion Label." Anal.Chem. 1998, 70, 1682-1685).

Недостатком такого способа является применение в процессе анализа соединений ртути, которые являются токсичными, а также высокая трудоемкость и сложность процесса.

Известен способ определения патологических состояний, при котором диагностируют Hanta-вирус в плазме крови. Анализ основан на образовании иммунокомплекса антиген-антитело с последующим взаимодействием в растворе антител против человеческих антител, меченных пероксидазой. В реакционную смесь добавляют H₂ O₂ и KI. Последующую детекцию пероксидазной метки проводят в режиме амперометрии. Энзим служит катализатором при окислении иодида в йод в присутствии перекиси. Регистрируют ток восстановления йода (Rajesh Krishan, Andrey L. Ghindilis, Plamen Atanasov, Ebtisam Wilkins, Jim Montoya, and Frederick T.Koster "Fast Amperometric Immunoassay for Hantavirus Infection". Electroanalysis 1996, 8, №12, 1131-1134).

Недостатком такого способа является применение в анализе дорогостоящего неустойчивого фермента, а также необходимость использования дополнительных реактивов (Н₂О₂ и KI). Детекцию метки проводят косвенно, предварительно окислив иодид, а только затем регистрируют восстановление иода.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, служит способ определения патологических состояний биологических объектов, включающий образование иммунокомплекса на поверхности электрода, присоединение метки к иммунокомплексу и последующую детекцию метки для оценки патологического состояния. При этом используют коллоидное золото в качестве иммуноэлектрохимической метки с гусиными иммуноглобулинами против человеческих антител (М.В. Gonzales Garsia, A. Costa Garsia "Adsorptive stripping voltammetric behaviour of colloidal gold and immunogold on carbon paste electrode". Bioelectrochemistry and Bioenergetics 38, 1995, стр. 389-395).

Недостатком данного способа является следующее: применяемые в этом способе антитела - гусиные иммуноглобулины против человеческих антител являются дорогими реактивами, также этот способ неприменим ни к одной диагностически значимой, реальной системе по определению белков или макромолекул.

Предлагаемое изобретение направлено на упрощение метода анализа, снижение его стоимости, повышение достоверности результатов диагностирования, расширение спектра определяемых объектов.

Это достигается тем, что в качестве электрода используют толстопленочный графитсодержащий электрод, иммунокомплекс на котором включает антиген, антитело и метку, причем в качестве метки используют конъюгат белка неимунного происхождения и металлов, при этом о патологическом состоянии судят по реакции окисления металлов.

Указанные отличительные признаки существенны. Использование толстопленочного графитсодержащего электрода, обладающего высокой сорбционной способностью обеспечивает устойчивое формирование иммунокомплекса с последующей инкубацией в растворе белка неиммунного происхождения, меченного металлом. Применение белка неимунного происхождения конъюгированного с металлом в качестве метки существенно удешевляет и упрощает процесс диагностирования и с учетом оценки по реакции окисления металлов повышает точность и достоверность определения.

На фигуре 1 изображен общий вид разового толстопленочного графитового электрода, где 1 - подложка из стеклотекстолита, 2 - дорожка из графитовой пасты, 3 - слой изолятора или цементита, 4 - рабочая поверхность электрода. Предлагаемое изобретение характеризуется следующими примерами.

На фигуре 2 изображены анодные вольтамперограммы окисления золота, зарегистрированные, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита.

На фигуре 3 изображены анодные вольтамперограммы окисления серебра, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита.

На фигуре 4 изображены анодные вольтамперограммы окисления серебра, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита.

На фигуре 5 изображены анодные вольтамперограммы, зарегистрированные, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего антитела к альфа-фетопротеинам, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего антитела к альфа-фетопротеинам.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В качестве подложки берут разовый толстопленочный графитовый электрод с плоской поверхностью. На подложку из стеклотекстолита 1 наносят дорожку из графитовой пасты 2. После отверждения пасты при 120°С изолируют нерабочую поверхность электрода цементитом 3. На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (вируса клещевого энцефалита). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в сыворотке крови пациента в течение 30 минут при температуре 37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Затем инкубируют с раствором протеина А, меченного коллоидным золотом. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М соляная кислота. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 1,0 В (окисление золота) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенпиостата. Для холостого опыта используют сыворотку крови, не содержащую антитела к вирусу клещевого энцефалита. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.2). В организме пациента обнаружено 0,002 мг/мл специфических антител против вируса клещевого энцефалита.

Пример 2.

На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (вируса клещевого энцефалита). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в сыворотке крови пациента в течение 30 минут при Т=37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и твин-20. Проводят инкубацию с раствором протеина А, меченного серебром. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М хлорид калия. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 0,05 В (окисление серебра) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенциостата. Для холостого опыта используют сыворотку крови, не содержащую антитела к вирусу клещевого энцефалита. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.3). В организме пациента обнаружено 0,002 мг/мл специфических антител против вируса клещевого энцефалита.

Пример 3.

На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (вируса клещевого энцефалита). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в сыворотке крови пациента в течение 30 минут при Т=37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и твин-20. Затем инкубируют с раствором протеина А, меченного серебром. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М хлорид калия. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 0,05 В (окисление серебра) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенциостата. Для холостого опыта используют сыворотку крови, не содержащую антитела к вирусу клещевого энцефалита. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.4). В организме пациента обнаружено 0,00002 мг/мл специфических антител против вируса клещевого энцефалита.

Пример 4.

На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (альфа-фетопротеина). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в высокоспецифической фракции антител (иммуноглобулинов G из гипериммунных сывороток) в течение 30 минут при Т=37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и твин-20. Затем инкубируют с раствором протеина А, меченного серебром. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М хлорид калия. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 0,05 В (окисление серебра) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенциостата. Для холостого опыта используют буферный раствор при рН=7,2. Концентрация антител - 0,005 мг/мл. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.5).

Использование предлагаемого способа позволяет упростить и удешевить процедуру электрохимического анализа за счет использования в качестве подложки разового графитового толстопленочного электрода, более доступного по получению и дешевого конъюгата белка не иммунного происхождения и металла, проведением в предлагаемом способе окисления металла методом анодной вольтамперометрии.