способ прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза путем типирования полиморфизма ДНК лимфоцитов, выделенных из крови больного, генов TNF-alfa и TNF-beta, отличающийся тем, что из лимфоцитов периферической крови выделяют ДНК методом полимеразно-цепной реакции синтеза ДНК, проводят генотипирование полиморфных локусов - 308GА и +252АG промоторных областей генов TNF- и и при выявлении генотипа LT22, характеризующегося наличием мутации гена TNF- в гомозиготном состоянии, выявляют лиц, предрасположенных к развитию хронического лимфолейкоза, а при определении комбинаций генотипов TNF22/LT22 или TNF12/LT11 у больных хроническим лимфолейкозом прогнозируют агрессивное течение заболевания.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза.

Согласно современным представлениям хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) является опухолью кроветворной системы, характеризующейся пролиферацией и аккумуляцией морфологически зрелых лимфоцитов, в большинстве случаев имеющих фенотип В-лимфоцитов, реже - Т-лимфоцитов. При классической форме ХЛЛ наблюдается прогрессирующий лимфатический лейкоцитоз, диффузная зрелоклеточная пролиферация в лимфоузле и трепанобиоптате костного мозга, увеличение лимфоузлов, селезенки, нередко печени.

По новой переработанной и дополненной классификации гемобластозов лимфатической природы А.И. Воробьева и М.Д. Бриллиант (1999) хронический В-клеточный лейкоз относится к зрелоклеточным опухолям лимфатической системы. Согласно этой классификации больные были разделены на 2 группы - с агрессивным и доброкачественным течением заболевания [Воробьев А.И., Кременецкая А.М., Д.В. //Гематол. и трансфузиол. - 2000, -Т.45, N 3. -C.4-14].

Все формы с агрессивным течением требуют назначения полихимиотерапии, при данном течении прогноз неблагоприятный, наблюдается лекарственная резистентность. Таким образом, раннее определение прогноза позволило бы:

- оптимизировать терапию данного заболевания;

- повлиять на качество жизни этих пациентов;

- снизить количество затрачиваемых средств государством на лечение данных больных.

Известны традиционные способы прогнозирования развития ХЛЛ, например:

Критерии прогнозирования ХЛЛ.: [Nelson К., Bruce D. Cheson /The Oncologist 1999; 4:352-369]

- Удвоение времени лимфоцитов (<12 месяцев - прогноз хуже);

- Диффузная инфильтрация лимфоцитами костного мозга в биопсийном материале (плохой прогноз);

- Сывороточный -2 микроглобуллин (повышенный уровень - прогноз хуже);

- Растворимый CD23 в сыворотке и ЛДГ (повышенный уровень - прогноз хуже).

Аналогом предлагаемого изобретения является способ прогнозирования течения ХЛЛ путем определения хромосомных нарушений. По мнению большинства исследователей, наличие дополнительной хромосомы 12 прогностически неблагоприятно [Juliusson G., Меrup М. Sem. OncoL-1998. -Vol.25. -P.19-26]. Существует точка зрения, что дополнительная хромосома не влияет на прогноз [Geisler С., Philip P., Christensen В. et al Leuk. Res. -1997. -Vol.21. -P.1011-1023]. Также есть мнение, что хронический лимфолейкоз с трисомией 12 представляет собой отдельный вариант болезни с атипичной морфологией лимфоцитов и относительно неблагоприятным течением [Oscier D.G. In: VIII intemat Worksh. On CLL. Darwin medical Communication Ltd.-Oxford Chise, U.K., 1999 -P.17]. Крайне неблагоприятны в прогностическом отношении и делеции хромосомы 11 [Neilson J., Auer R., White D. et al. Leukemia. -1997. -Vol.11. -P.1929-1932]. Медиана выживаемости у данных больных 64 мес.

Недостатками данных способов является следующее.

1. Дороговизна и значительная трудоемкость выполнения данной методики как в амбулаторных, так и в условиях стационара.

2. Достаточно большой выбор неблагоприятных в прогностическом отношении хромосомных нарушений.

3. Большое количество противоречивых литературных данных относительно возможного прогностического значения того или иного хромосомного нарушения.

Другой аналог предлагаемого изобретения - способ прогнозирования развития ХЛЛ путем определения сывороточного уровня интерлейкина-6 (ИЛ-6), который является индикатором активности течения ХЛЛ [Robak Т., Wierzbowska A., Blasinska-Morawiec M et al: Mediators inflamm. - 1999. -Vol. 8(6). - P.277-86]. Так в работе [Fayad L, Keating M.J., Reuben M.J. at al: Blood. - 2001. - Vol.97(1).-P.256-63] показано, что уровень ИЛ-6 и ИЛ-10 был выше у пациентов с ХЛЛ по сравнению с контролем. Пациенты с повышенным уровнем ИЛ-6 и/или ИЛ-10 имели худшую медиану или 3-х летнюю выживаемость и неблагоприятные характеристики (предшествующая температура, увеличение уровня бета-2 микроглобулина или лактат-дегидрогеназы или стадию заболевания по Раи III или IV. Результаты [Hulkkonen J., Vilpo J., Vilpo L. et al: Br J Haematol. - 1998. - Vol.100 (3). - P.478-83] свидетельствуют, что различная способность продуцировать ИЛ-6 и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-) может играть роль при В-ХЛЛ прогрессии и клинической манифестации этого заболевания.

Вместе с тем к недостаткам способа следует отнести следующие:

1) относительно высокую вариабельность сывороточного уровня (СУ) ИЛ-6 даже в течение суток у одного и того же пациента (например, утреннее или послеобеденное время);

2) наличие сопутствующих заболеваний у пациентов может существенно влиять на регистрируемый СУ ИЛ-6. Главным недостатком способа является невозможность выделить группы благоприятного (неблагоприятного) течения заболевания на начальной стадии и тем самым осуществить своевременные профилактические мероприятия (адекватная химиотерапия).

Прототипом данного изобретения является метод, описанный Demeter J. и др. (Demeter J., Porzolt F., Ramiisch S., Schmidt D., Schmidt M., Messer G. Polymorphism of the tumor necrosis factor-alfa and lymphotoxin-alpha genes in chronic lymphocytic leukaemia. // Br. J. Haematol, 1997, Apr; 97(1):107-12), сообщающий о повышении частоты полиморфизма гена TNF-альфа и TNF-бета у больных ХЛЛ по сравнению с контрольной группой. Было выявлено значительное увеличение частоты встречаемости аллели TNF 1 полиморфизма гена TNF-alfa -308G в группе 73 больных ХЛЛ по сравнению с контролем (RR=3.18, границы 95% доверительного интервала 1,57-8,3; р=0.006). А также было выявлено увеличение частоты аллея TNF-beta LT2 у больных ХЛЛ (р=0.004). На основании полученных данных авторы сделали заключение о вовлечении иммуногенетической ассоциации с вовлечением полиморфизма генов цитокинов TNF/LT как паракринных и аутокринных факторов роста в патогенез ХЛЛ.

Недостатками данного метода является следующее.

1. Отсутствие данных о полиморфизме указанных генов при ХЛЛ в зависимости от вариантов течения заболевания.

2. Отсутствие данных об изучении особенности комбинаций генотипов по локусам TNF- и у больных ХЛЛ.

Технический результат - повышение точности прогнозирования развития и течения ХЛЛ. Технический результат достигается тем, что на ранней стадии развития заболевания проводят генотипирование полиморфизма промоторной области гена TNF-alfa и TNF-betta и при выявлении генотипа LT22 выявляют лиц, предрасположенных к развитию ХЛЛ, а при определении комбинации генотипов TNF22/LT22 и TNF12/LT11 прогонозируют у больных ХЛЛ агрессивное течение заболевания.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови.

Материалом для молекулярно-генетического исследования служили образцы ДНК крови. Кровь набирали в пробирки со стандартным консервантом (1 мл глюгицира) в соотношении 4:1. До выделения ДНК кровь хранили при температуре +4°С не более 1 месяца. ДНК выделяли из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew С.С., 1984). Для этого к 4 мл крови добавляли 50 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритона Х 100, 5 мМ MgCl ₂, 10 мМ трис-HCl рН 7,6. Ядра лимфоцитов осаждали центрифугированием при 4°С и 4000 об/мин в течение 20 минут; к осадку добавляли 8 мл раствора, содержащего 25 мМ EDTA (рН=8,0), суспендировали, добавляли 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл, затем инкубировали при 42°С 16 часов. Очистка ДНК от белков производилась с помощью последовательной эктракции раствора ДНК забуференным фенолом (рН=7,8), смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом. При этом фенол активно денатурирует белки, смесь фенол-хлороформа полностью ингибирует РНК-зную активность, в результате последней экстракции хлороформом из препарата ДНК удаляют остатки фенола. Экстракцию производили, смешивая раствор ДНК и растворитель до образования эмульсии. Разделение фаз проводили ценрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин. Осаждение ДНК производилось добавлением двух объемов охлажденного 96% этанола. Осажденную ДНК дважды промывали 70% этанолом, удаляли этанол из пробирки и подсушенный осадок ДНК растворяли в деионизированной Н₂О. Раствор ДНК хранили при -20°С.

Проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ полиморфных локусов генов -308GA промоторного участка гена фактора некроза опухолей (-308TNF-) и +252АG интрона 1 гена фактора некроза опухолей (+252TNF-) проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере в автоматическом режиме с использованием локусспецифических олигонуклеотидных праймеров Полиморфизм -308GA промоторной области гена TNF- выявляли с использованием праймеров, один из которых содержит искусственную однонуклеотидную замену для создания сайта рестрикции в нативной последовательности ДНК для рестриктазы NcoI (Wilson A.G. et al., 1993). Условия ПЦР и состав ПЦР-смеси идентичны вышеизложенным. Продукт ПЦР длиной 108 пн подвергали ферментному гидролизу рестриктазой Ncol при температуре 37°С. Аллель TNF-22 размером 108 пн (генотип АА) типировался на электрофорезе в 7% ПААГ по отсутствию сайта рестрикции, аллель TNF-11 (генотип GG), содержал сайт рестрикции и идентифицировался по наличию двух фрагментов длиной 88 и 20 пн (Wilson A.G.et аl., 1993).

Полиморфизм +252AG интрона 1 гена ФНО- выявляли методом ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Условия ПЦР и состав ПЦР-смеси идентичны вышеизложенным. Продукт ПЦР длиной 300 пн подвергали ферментному гидролизу рестриктазой Ncol при температуре 37°С. Аллель TNF12 размером 300 пн (генотип АА) типировался на электрофорезе в 7% ПААГ по отсутствию сайта рестрикции, тогда как при наличии сайта рестрикции идентифицировался мутантный аллель TNF-22 (генотип GG).

В качестве контроля обследовали группу здоровых индивидов, проживающих на территории республики Башкортостан (101 человек), у которых отсутствовали какие-либо злокачественные заболевания.

В группу с доброкачественным течением ХЛЛ вошли больные с медленным нарастанием лейкоцитоза, очаговым типом роста в костном мозге, незначительным увеличением периферических лимфоузлов и селезенки. В начальной стадии заболевания лечение больным данной группы не назначается.

В группу с агрессивным течением ХЛЛ вошли больные с прогрессирующей формой (быстрое увеличение лимфоузлов и селезенки, диффузный или диффузно-интерстициальный рост опухоли в костном мозге), опухолевой формой ХЛЛ (наличие больших плотных конгломератов лимфоузлов, диффузный рост опухоли в костном мозге) и абдоминальной формой (отличающейся наличием конгломератов лимфоузлов в брюшной полости и диффузной пролиферации в трепанате). Данным категориям больных требовалось назначение полихимиотерапии.

Группа больных ХЛЛ с доброкачественным течением составила 54 человека, группа с агрессивным течением заболевания - 50 человек. В качестве контроля обследована группа практически здоровых доноров, подобранных в соответствии с возрастом и полом исследуемых групп больных.

Молекулярно-генетическое изучение полиморфного локуса -308GА промоторного участка гена TNF-. В табл.1 приведены результаты изучения полиморфного локуса -308GA промоторного участка гена TNF-. В группе больных ХЛЛ частота генотипа TNF2/2 гомозиготного по мутантным аллелям и определяющего повышенный уровень экспрессии гена ФНО-, составила 2,88%, частота аллеля TNF2 - 22,31%, что не имеет достоверных отличий по сравнению с контрольной группой, где на долю генотипа TNF2/2 и аллеля TNF2 приходится 2,13 и 19,29% соответственно. Полученные результаты согласуются с аналогичными литературными данными, представленные в работах Mainou-Fowler Т. и Wihiborg С. [Mainou-Fowler Т., Dickinson A. M., Taylor P.R. et al. // Leuk Lymphoma 2000 Aug; 38(5-6):547-52; Wihiborg C., Sjoberg J., Intaglietta M., et al. //Br. J. Haematol 1999 Feb;104(2):346-9]. Авторами этих исследований был изучен полиморфизм гена TNF- у больных с В-ХЛЛ и болезнью Ходжкина. Результаты этих работ показали отсутствие достоверных различий между группами больных и контролем по распределению частот аллелей.

В результате изучения характера распределения частот генотипов у больных ХЛЛ в зависимости от степени тяжести клинического течения заболевания выявлено увеличение частоты встречаемости мутантного генотипа TNF2 полиморфного локуса - 308GA TNF- у больных с агрессивным течением ХЛЛ до 4,0% по сравнению с доброкачественным течением заболевания, 1,9%. Хотя применение критерия ² не выявило достоверных различий по частотам аллелей между больными хроническим лимфолейкозом и контрольной группой ( ²=0,01; р=0,95), что может быть обусловлено недостаточностью выборки, повышение частоты мутантного генотипа у больных с опухолевой формой свидетельствует о возможной прогностической значимости данного генетического маркера.

Таблица 1 Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса -308GA промоторного участка гена TNF-
Обследованные группы	Объем выборки	Частота генотипов (%)			Частота аллелей (%)
		TNF11	TNF12	TNF22	TNF1	TNF2
Контроль	101	76,59	21,28	2,13	80,71	19,29
Больные ХЛЛ, в целом	104	72,12	25,00	2,88	77,69	22,31
Доброкачественное течение	54	72,2	25,9	1,9	77,9	22,1
Агрессивное течение	50	72,0	24,0	4,0	77,4	22,6

Молекулярно-генетическое изучение полиморфного локуса +252АG гена TNF-P. В табл.2 приведены результаты изучения полиморфного локуса +252АG гена TNF-. Как видно из полученных данных, только один генотип, а именно генотип LT22, характеризующийся наличием мутации гена ФНО- в гомозиготном состоянии, у больных хроническим лимфолейкозом встречался более чем в 2 раза чаще по сравнению с контролем (9,00% и 3,55% соответственно). Применение критерия ² показало достоверность различий ( ²=3,82; р=0,05). Для генотипа LT*22 был рассчитан показатель OR, который для больных хроническим лимфолейкозом составил 2,68, что указывает на повышение вероятности развития хронического лимфолейкоза у данной категории индивидов.

Таблица 2 Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса +252AG промоторного участка гена TNF-
Обследованные группы	Объем выборки	Частота генотипов (%)			Частота аллелей (%)
		LT11	LT12	LT22	LT1	LT2
Контроль	101	55,03	41,42	3,55	68,21	31,79
Больные ХЛЛ, в целом	104	55,00	36,00	9,00	66,91	33,09
Доброкачественное течение	52	53,84	36,54	9,62	66,19	33,80
Агрессивное течение	48	56,25	35,42	8,33	67,69	32,31

Анализ комбинаций генотипов по локусам TNF- и TNF- больных хроническим лимфолейкозом. Принимая во внимание, что гены TNF- и TNF- расположены на одной хромосоме в непосредственной близости (локус 6р21.3), целесообразным представлялось изучить особенности комбинаций генотипов по изученным локусам и характер сцепления между ними. Данные по распределению комбинаций генотипов приведены в табл. 3.

В качестве прогностически неблагоприятных комбинаций генотипов по локусам TNF- и TNF- следует отметить варианты TNF22/LT22 и TNF12/LT11, частота которых при агрессивном течении ХЛЛ оказалась почти в 2 раза выше, чем при доброкачественной форме заболевания. Показатели OR в отношении агрессивного течения ХЛЛ составили 2,22 для сочетания TNF22/LT11 и 2,27 для комбинации генотипов TNF12/LT11. Полученные результаты позволяют использовать данные комбинации генотипов по локусам TNF- и в качестве генетических маркеров предрасположенности к агрессивному течению ХЛЛ.

Таблица 3 Распределение генотипов по локусам TNF- и TNF- у больных хроническим лимфолейкозом и в контроле
Комбинации генотипов -308/+252	Частота (%)
	Контроль (n=101)	Больные ХЛЛ, в целом (n=104)	Доброкачественное течение (n=52)	Агрессивное течение(n=48)
TNF11/LT11	44,94	47,12	50,0	47,92
TNF11/LT12	18,35	18,27	15,38	22,92
TNF11/LT22	1,89	3,85	5,77	2,08
TNF22/LT11	1,27	-	-	-
TNF22/LT12	0,63	-	-	-
TNF22/LT22	0.63	2,88	1,92	4,17
TNF12/LT11	9,49	5,77	3,85	8,33
TNF12/LT12	21,52	16,35	21,15	12,5
TNF12/LT22	1,27	1,92	1,92	2,08

Таким образом, определение генотипа LT22, характеризующегося наличием мутации гена TNF- в гомозиготном состоянии, позволит выявлять лица, предрасположенные к возникновению ХЛЛ.

В качестве прогностических маркеров для выявления лиц, предрасположенных к агрессивному течению ХЛЛ должны определяться комбинации генотипов TNF22/LT22 и TNF12/LT11 у больных ХЛЛ.

Для иллюстрации приведем некоторые клинические примеры.

Б-ая М-о., 1937 года рождения, город Белебей, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в апреле 1996 года, подтвержден стернальной пункцией, костный мозг богат клеточными элементами, представлен зрелыми лимфоцитами 89%. Регулярно получает полихимиотерапию с включением циклофосфана, преднизолона. В настоящее время диагноз ХЛЛ, стадия по К.Rai III, продолжает принимать лечение, наблюдается прогрессирование течения заболевания, увеличение количества лимфоузлов, увеличение их до 2 см в диаметре, группирование их в конгломераты, при пальпации отмечается болезненность. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов TNF- и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hsp92II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфных локусов генов TNF- и больной выявило генотип LT22, свидетельствующий о предрасположенности к возникновению ХЛЛ, а выявление комбинации генотипов TNF22/LT22 позволило прогнозировать агрессивное течение заболевания.

Пациентка К-ва 1948 года рождения, г.Учалы, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в сентябре 2000 года, подтвержден стернальной пункцией, 95%-зрелых лимфоцитов. Неоднократно проводилось лечение циклофосфаном и преднизолоном. Смерть наступила в декабре 2002 г, на фоне прогрессирования лимфоцитоза до 250×10⁹ /л, анемии -Нв-43 г/л, Тромбоцитопении-Рlt-31×10⁹ /л. Гиперсплено-, гепатомегалия. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов TNF- и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hsp92II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании установлена комбинация генотипов TNF12/LT11, что позволило нам прогнозировать агрессивное течение болезни.

Б-ая М-в., 1944 года рождения, город Нефтекамск, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в сентябре 1998 года, подтвержден стернальной пункцией, костный мозг богат клеточными элементами, представлен зрелыми лимфоцитами - 67%. Получает Хлорбутин 5 мг 4 раза в день. В настоящее время диагноз ХЛЛ, стадия по К.Rai II, продолжает принимать лечение, наблюдается стабильное течение заболевания. Увеличены периферические лимфоузлы до 1,0 см в диаметре, при пальпации мягкие, безболезненные. Умеренная гиперспленомегалия, печень по краю реберной дуги. WBC - 106×10⁹/л, RВС - 3,94×10¹²/л, PLT - 156×10⁹ /л, Нв - 123 г/л. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов TNF- и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой Hsp92II провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфных локусов генов TNF- и больной не выявило генотип LT22 свидетельствующий о предрасположенности к возникновению ХЛЛ. При изучении локусов генов TNF- и была выявлена комбинация генотипов TNF11/LT11, в данном случае мы не можем точно прогнозировать течение заболевания, возможен был как доброкачественный, так и злокачественный вариант течения болезни; стратегия химиотерапии выбиралась исходя из традиционных критериев.

Таким образом, нами проведено молекулярно-генетическое изучение полиморфных локусов -308GA и +252AG промоторных областей генов TNF- и у больных с хроническим лимфолейкозом и в контрольной группе. Установлено, что у лиц с выявленным генотипом LT22 характеризующегося наличием мутации гена TNF-P в гомозиготном состоянии, возможность развития ХЛЛ значительно выше по сравнению с контролем. Определение комбинаций генотипов TNF22/LT22 и TNF12/LT11 у больных ХЛЛ, позволяют прогнозировать агрессивные варианты течения ХЛЛ на самых ранних стадиях развития заболевания.